用于將生物活性物質(zhì)引入腦的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及研發(fā)一種用于將合成的和天然的生物活性的且藥用的物質(zhì)基于所述 物質(zhì)和自由基性質(zhì)的膜活性產(chǎn)物和/或該產(chǎn)物的源與鼻腔的神經(jīng)和血管結(jié)構(gòu)的交互作用 從鼻腔直接供給到腦中的醫(yī)藥生物方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)境是多種生物活性分子的源，所述生物活性分子隨著食物或者從空氣環(huán)境進(jìn)入 到生物體中。生物活性分子的其它重要的源是生物體的內(nèi)部源，這樣的內(nèi)部的源如是血液 和間質(zhì)液。為了到達(dá)器官結(jié)構(gòu)或者組織，生物活性物質(zhì)必須從外部的和內(nèi)部的環(huán)境中穿過(guò) 生物膜，例如穿過(guò)腦的膜結(jié)構(gòu)。
[0003] 生物體的外部和內(nèi)部環(huán)境的大量生物活性分子是有用的并且對(duì)于器官和組織包 括腦的正常地起作用是必要的，生物活性分子尤其是包括大多數(shù)藥物以及許多生物化合 物一一新陳代謝的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物在生物體中在代謝過(guò)程中形成。
[0004] 同時(shí)，將通常已知的和新的藥物、生物技術(shù)產(chǎn)品供給到腦中以及用于治療中樞 神經(jīng)系統(tǒng)（ZNS)、尤其是腦的一系列代謝物的治療應(yīng)用，是嚴(yán)重的問題。在過(guò)去十年的科 學(xué)和專利文獻(xiàn)中描述了將一些中樞性地作用的藥物從鼻腔中供給到腦中的方法。（Ming Ming ffen(2011)http://www. discoverymedicine. com/Ming-mingffen/2011/06/13/ οIfactor y-targeting-through-intranasal-delivery-of-biopharmaceutical-drug s-t〇-the-brain-current-development/ ；Costantino H. R. et al. (2007). Intranasal delivery-Physicochemical and therapeutic aspects. International Journal of Pharmaceutics 337:1-24)。
[0005] 在Ming Ming Wen和Costantino等的工作中，描述了用于將藥用物質(zhì)從鼻腔中供 給到腦中的已知的措施。尤其包括：應(yīng)用粘膜附著性輔助劑，所述輔助劑增強(qiáng)穿過(guò)膜的滲 透，這些輔助劑如是脂質(zhì)體、納米顆粒，并且甚至包括應(yīng)用血管收縮劑，這沒有充分的科學(xué) 依據(jù)。
[0006] 多種所描述的方法雖然可使一些小分子透入到腦中，然而所述方法對(duì)于寬范圍的 藥用物質(zhì)而言不是通用的方法。
[0007] 顯而易見的已知的解決方案為用于治療和免疫的將藥用物質(zhì)經(jīng)鼻運(yùn)輸?shù)酵庵苎?液中并且到腦中的方法（根據(jù)專利EP 1 031 347 BI)。作者確認(rèn)，迄今為止所使用的經(jīng)鼻 運(yùn)輸?shù)姆椒ú荒軌虼_保便捷且可接受地將藥物活性物質(zhì)運(yùn)輸穿過(guò)鼻腔的膜的令人信服的 原理。
[0008] 作者發(fā)現(xiàn)所述問題的解決方案的一個(gè)重要的要素是存在細(xì)胞因子或者其源的制 藥學(xué)配方。然而作者所使用的方法僅是用于將藥物在鼻部供給到外周血液循環(huán)和/或腦中 的一種可行的途徑和一種免疫接種的手段，并且僅能夠用作為進(jìn)一步改進(jìn)藥物的鼻部供給 以用于治療腦部疾病的藥理和技術(shù)平臺(tái)。
[0009] 所描述的方法的主要不足之處在于藥物的準(zhǔn)備和應(yīng)用的復(fù)雜性以及對(duì)于水溶性 的化合物的特定的限制。該方法的另一個(gè)不足之處在于藥用組合物的復(fù)雜的準(zhǔn)備。
[0010] 之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：自由基物質(zhì)或者其副產(chǎn)物、過(guò)氧化氫（H2O2)或者·ΝΟ活性產(chǎn)物、例 如L-精氨酸能夠在特定的條件下確保提高鼻腔的神經(jīng)和血管的膜結(jié)構(gòu)的可透過(guò)性并且有 助于在透過(guò)時(shí)生物活性物質(zhì)進(jìn)入腦中（專利號(hào)DE 102 48 601，歐洲專利號(hào)010692)。
[0011] 至今已經(jīng)大量地討論了用于解決技術(shù)問題的構(gòu)想，因此也在文獻(xiàn)（Goldstein N. , et al. 2012, Blood-Brain Barrier Unlocked. Biochemistry(Moscow), Vol. 77, No. 5, pp. 419-424)中討論。在該文獻(xiàn)中，為了確定生物活性物質(zhì)多巴胺在與微摩爾的過(guò)氧化氫一 起同時(shí)在鼻部導(dǎo)入時(shí)引入到腦中的有效性，執(zhí)行借助于氚標(biāo)記的多巴胺（DA)的試驗(yàn)。通常 已知的是，為此多巴胺不能夠在常見條件下滲入到腦中并且在那里觸發(fā)明顯的效果。
[0012] 為了證實(shí)多巴胺在腦結(jié)構(gòu)中的具體的生物活性，執(zhí)行借助于同位素產(chǎn)品[3H]-多 巴胺并且借助于抗精神病藥氟哌啶醇的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研宄。在此通常已知的是，多巴胺不能 夠在常見條件下滲入到腦中并且在那里觸發(fā)明顯的生理或者治療效果。為了證實(shí)多巴胺在 腦結(jié)構(gòu)中的具體的生理活性，執(zhí)行借助于同位素產(chǎn)品[ 3H]-多巴胺并且借助于抗精神病藥 氟哌啶醇的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研宄。
[0013] 在制備用氚標(biāo)記的[3H]-多巴胺時(shí)，使用多巴胺鹽酸制劑中的氫相對(duì)于氚的高溫 固相催化的同位素置換反應(yīng)。所產(chǎn)生的制劑[ 3H]_DA在色譜柱Kromasil C18(8X 150mm)中 在乙腈的水溶液的濃度梯度中在存在0. 1%的七氟丁酸的情況下被滌出。所述制劑的定量 分析通過(guò)HPLC在使用DA標(biāo)準(zhǔn)（<〈Sigma/Aldrich>>)的條件下執(zhí)行。均勾標(biāo)記的DA的具體 的放射性為20Ci/Mol。所述制劑的儲(chǔ)備溶液包含體活度為0. 75mCi/ml的KT2M的[3H]-多 巴胺。
[0014] 在準(zhǔn)備鼻部導(dǎo)入多巴胺溶液時(shí)，制備[3H]-DA_溶液（濃度為4Χ10- 2Μ，體活度為 O. 75mCi/ml)與穩(wěn)定的過(guò)氧化氫的等滲溶液的混合物（〈〈Sigma/Aldrich>>)。鼻部導(dǎo)入的 溶液中的多巴胺和H 2O2的終濃度相應(yīng)為KT2M和10_5M。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組中導(dǎo)入[ 3H]-DA-溶 液和H2O2-溶液的混合物?？刂平M中的動(dòng)物接受[ 3H]-DA+0. 9% NaCl的混合物。
[0015] 在準(zhǔn)備老鼠的生物材料時(shí)去除腦，下丘腦和紋狀體的兩個(gè)部分被切除并且被置于 冷的襯墊上（+4°C)，其中所述老鼠在鼻部導(dǎo)入包含[ 3H]-DA的溶液三分鐘后被處死。所取 出的腦結(jié)構(gòu)在35s至40s內(nèi)被稱量，在液氮中冷凍并且安置到艾本德試管中。冷凍的樣品 凍干48小時(shí)長(zhǎng)并且緊接著通過(guò)200 μ 1 0.1 M的此104溶液萃取。隨后將樣品在15分鐘內(nèi) 在1000 Og中離心分離并且將上清液用于確定[ 3H-DA]和[3H-DOPAC]。
[0016] 因?yàn)闃悠分械腄A和DOPAC的終濃度對(duì)于借助于UV檢測(cè)結(jié)合血液的血漿的峰值來(lái) 確定該物質(zhì)的放射性衍生物是不足的，所以由于該原因在色譜分離之前分別將10 μ g未標(biāo) 記的多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品和其代謝產(chǎn)物3, 4-二羥苯乙酸（DOPAC)添加到組織萃取液中。0.1 M的 HClO4中的萃取液的色譜分析在色譜柱Kromasil C18-5 μ m(4X 150mm)中在20°C下借助于 用〇.1%的七氟丁酸中的乙腈（4%至24%)的梯度洗脫來(lái)執(zhí)行。同時(shí)對(duì)25411111和22〇11111的 波長(zhǎng)的檢測(cè)在貝克曼分光光度計(jì)（Modell 165, Altex)上執(zhí)行，樣品體積為100 μ 1。實(shí)驗(yàn)組 和控制組的每個(gè)動(dòng)物的、已分開地添加有[3H]-DA和[3H]-D0PAC的腦萃取物的餾分，借助于 液體閃爍計(jì)數(shù)器來(lái)量性分析。
[0017] 在圖1上示出包含多巴胺和DOPAC的萃取溶液、下丘腦以及紋狀體萃取物的典型 的色譜圖。
[0018] 圖1.鼠腦的下丘腦和紋狀體的色譜分析的萃取物餾分中的[3H]-DA和[ 3H]-DOPAC 的放射性。
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