一種通過永生化細胞獲得生物活性物質組合物的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含有人類生物活性物質組合物的制造方法，特別是人類生物活性 物質來源于永生化細胞。具體來說，本發(fā)明提供了一種采集自體細胞制作的永生化細胞，在 適當的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下獲得人類生物活性物質組合物，獲取的人類生物活性物質組合 物經分離提取后可用于個性化化妝品供美容及皮膚保養(yǎng)使用。
【背景技術】
[0002] 正常組織來源的細胞在通常的體外培養(yǎng)條件下生長、分裂，經過有限次的細胞傳 代后就會停止增殖，出現衰老和死亡。永生化細胞是實現了永生化（immortalization)的 細胞，則具有無限分裂和增殖的能力，如生殖細胞、干細胞、腫瘤細胞和外源性基因轉染而 構建的永生化細胞等。通常意義的永生化細胞是指體外培養(yǎng)的細胞經過自發(fā)的或受外界因 素的影響從增殖衰老危機中逃離，從而具有無限增殖能力一類細胞，這樣的細胞群體稱為 永生化細胞系或連續(xù)細胞系。
[0003] 目前，建立永生化細胞系的方法是通過基因轉染等技術，將外源永生相關基因轉 入目的細胞或通過物化的方法誘導衰老相關基因發(fā)生突變，促使正常細胞永生化。經人工 轉染的永生化細胞能無限增殖生長，可長期傳代，但并不改變細胞本身的特性。具體方法包 括電穿孔法、磷酸鈣沉淀法、脂質體轉染法以及逆轉錄病毒和腺病毒介導轉染法；物理刺激 法通過X射線、電離輻射、C〇60等放射性因素進行細胞永生化的方法，可能破壞了細胞的衰 老機制，使細胞周期得到延伸或促進了與細胞永生相關基因的表達。比較常用的基因轉染 技術是將腫瘤病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等轉染正常組織細胞來構建。此外，研究細 胞永生化最常用的方法還有通過構建含端粒酶催化亞基（hT ERT)的表達載體，通過各種方 法來轉染細胞獲得永生化細胞。
[0004] 應用較為廣泛的腫瘤病毒包括EB病毒、腺病毒、猴腎細胞病毒、多瘤病毒等。EB病 毒（epstein-barr virus，EBV)在體外能使13淋巴母細胞永生化形成淋巴母細胞樣細胞系， 它可能通過誘導其它細胞周期調控蛋白從而抑制了P53的促細胞衰老作用，使細胞永生。 導致B細胞永生的主要原因可能是端粒酶活性的提高。目前，可以直接用B淋巴細胞與EB 病毒共培養(yǎng)的方法是細胞實現永生，在其他細胞中的應用很少。猿猴病毒SV40是一種真核 細胞病毒，它的T抗原片段是最常用的整合片段，此片段能夠整合進靶細胞核內并表達，可 導致細胞增殖活力的改變并表現出多種與腫瘤相關的表型。近年來，人們通過野生型SV40 病毒共培養(yǎng)感染靶細胞、磷酸鈣法、電穿孔以及逆轉錄病毒載體法等，成功獲得了多種永生 細胞株。其它病毒如人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV)已成功地將人的包皮細 胞、角化上皮以及乳腺、胰導管和口腔等的上皮細胞以及牛牙乳頭成纖維細胞永生化。此 外，也發(fā)現腺病毒可有效永生化大鼠腎細胞。
[0005] 另一種常用的獲得永生化細胞的方式是通過構建含端粒酶催化亞基（hTERT)的 表達載體，轉染正常細胞來獲得永生化細胞。端粒酶轉染建立的永生化細胞是正常細胞，而 非轉化細胞，這些細胞依然保持了正常細胞的生理特性，具有正常的生長速率和核型。另 外，hTERT介導的永生化細胞已通過了 Ml期和M2期，具有同胚胎干細胞一樣的傳代能力， 可以算得上是真正意義上的永生化。
[0006] 端粒是位于染色體末端具有穩(wěn)定染色體及防止染色體末端融合等特殊功能的部 分。隨著細胞分裂次數的增加端粒進行性縮短，當縮短到一定的限度即不能維持染色體的 穩(wěn)定時，細胞失去分裂增殖的能力，進而衰老死亡。細胞端粒長度的保持需要激活端粒酶。 端粒酶（telomerase)則是催化合成并維持端粒一定序列的核糖核蛋白，由RNA和蛋白組 成，具有逆轉錄酶的活性。人類端粒酶復合物的分子量約為500-1500kDa。目前發(fā)現，所有 的細胞永生化都與端粒的維持有關。目前大家比較認同的細胞發(fā)生永生化的機理是M1-M2 理論，即進入Ml期后，在病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等作用下，促使細胞繞過Ml期繼 續(xù)生長。經20-30次擴增后進入M2期，絕大多數細胞出現退化，凋亡，極少數細胞的端粒酶 被激活，不斷合成端粒DNA來補充和延長端粒長度，維持染色體的穩(wěn)定性使細胞度過M2期， 最終細胞發(fā)生永生化（褚嘉祐，中華民族永生細胞庫的建立，2009 :9-12)。
[0007] 永生化細胞除了能在體外長期傳代外，還具有很高的端粒酶活性。因此，利用永 生化細胞生產細胞活性物質能夠克服正常組織細胞傳代、增殖的限制，能夠作為質量和遺 傳物質均穩(wěn)定的標準細胞系。實際上，永生化細胞除了具有較高的端粒酶活性之外，其本 身還能夠分泌大量的細胞因子（Christian Unger 等 2009，Human Reproduction。24(10): 2567-2581)。然而，對永生化細胞產生的細胞因子的研究非常少，可能是目前只是將永生化 細胞作為一種保存遺傳物質的方式，而對細胞本身的代謝特征還沒有注意到。
[0008] 專利申請?zhí)枮?3134542. 5的專利公開了"一種使皮膚成纖維細胞永生化的方法"； 專利申請?zhí)枮?01010109274. 6的專利公開了"端粒酶永生化的皮膚成纖維細胞系及其構 建方法";專利申請?zhí)枮?01010585718. 3的專利公開了"永生化人椎間盤髓核細胞體系的制 備方法"。這幾個專利僅公開了通過不同細胞制作永生化細胞的方法，其中并沒有涉及利用 其制造細胞生長因子等人類生物活性物質方面的內容。
[0009] 目前，應用的細胞因子，主要是采用人工化學合成或者遺傳重組技術進行制造。 如專利申請?zhí)枮?00510069586. 8的專利公開了 "雙功能表皮生長因子及其制備方法和用 途"；專利申請?zhí)枮?01010137435.2的專利公開了 "一種生產人表皮生長因子（EGF)的制 備方法"。也有專利將上述通過基因重組的細胞因子用于美容護膚領域，如專利申請?zhí)枮?200710059770. 3的專利公開了"含人血清白蛋白與皮膚細胞生長因子的融合蛋白護膚產品 制備工藝和用途";專利申請?zhí)枮?01210139430. 2"基因重組人型活性堿性成纖維細胞生長 因子融合蛋白及其制備方法和應用"。此外，也有通過干細胞的方法來大量制造細胞生長因 子的技術，如來自韓國的專利申請?zhí)枮?00680051716. 8,名稱為采用脂肪來源成體干細胞 大量制造生長因子的方法。但因技術難度或細胞來源等問題，并未發(fā)現利用永生化細胞制 造細胞生長因子的技術出現。無論是人工化學合成的還是基因重組獲得的細胞因子與人體 自身產生的細胞因子還是存在一些差異，如這些細胞因子都或多或少的存在過敏原，失去 特定的三維結構，活性弱。而自體細胞具有與個體高基因一致性，不存在過敏原，不會產生 免疫排斥。由自體細胞制成的永生細胞不會導致癌癥，用于自體不會出現免疫排斥反應，并 且不受細胞來源核數量的限制，能夠做到質量均一，活性穩(wěn)定，因此，能夠應用于個性化的 需求，具有非常廣闊的應用前景。
[0010] 本發(fā)明人注意到已有細胞因子的諸多問題以及永生化細胞的諸多特點，擬采用體 細胞制作永生化細胞并在適當的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下制造人細胞生長因子等生物活性物 質組合物。

【發(fā)明內容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種通過永生化細胞獲得生物活性物質組合物的方法。該組 合物包含細胞因子以及端粒酶等多種生物活性物質。此組合物能夠應用于自體使用，具有 優(yōu)異的生物活性、免疫源性低、無排斥反應、制作周期短、取材方便、費用合理等特點。
[0012] 此外，本發(fā)明將提供一種安全、有效、個性化的化妝品。所述化妝品中含有通過永 生化細胞獲得生物活性物質組合物，或者含有由此永生化細胞培養(yǎng)的含有上述生物活性物 質組合物的培養(yǎng)基。
[0013] 為了達到上述目的，本發(fā)明提供了利用永生化細胞制造生物活性物質組合物的方 法，所述方法包括以下步驟：1，制作永生化細胞；2,在無血清培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)所述永生 化細胞；3,通過中空纖維超濾系統(tǒng)分離純化生物活性物質；4,對上述分離純化的生物活 性物質進行檢測。
[0014] 本發(fā)明中公布的方法能夠解決現有技術中不能通過細胞培養(yǎng)途徑有效獲得細胞 生長因子等生物活性物質的問題。本發(fā)明的生物活性物質組合物具有提高細胞膠原合成、 促進成纖維細胞增殖、抑制UV光導致的角化細胞增殖的作用。生物活性物質組合物來源于 人體細胞，與人體自身的生物活性物質具有一致的三維結構和生物活性，具有確定的安全 性，較好的皮膚相容性。預期能夠很好地應用于抗皺，美化皮膚，創(chuàng)傷愈合，去除疤痕。
【附圖說明】
[0015] 圖1是永生化B淋巴細胞顯微鏡照片；
[0016] 圖2是永生化B淋巴細胞培養(yǎng)不同時間的生長因子濃度Elisa檢測結果圖；
[0017] 圖3是永生化B淋巴細胞端粒酶活性檢測結果圖；
[0018] 圖4是永生化B淋巴細胞培養(yǎng)基刺激成纖維細胞增殖結果圖；
[0019] 圖5是永生化B淋巴細胞培養(yǎng)基和生物因子刺激膠原生成Elisa檢測結果圖；
[0020] 圖6是永生化B淋巴細胞培養(yǎng)基促進角化細胞UV防御功能檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0021] 為實現上述目的，本發(fā)明提供了通過永