本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種單鏈核酸分子、聚合酶活性測定方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

聚合酶作為一種重要的工具酶，廣泛應用于基因測序、載體制備及基因克隆等一系列重要的分子生物學技術(shù)之中。目前，市場上常見的DNA聚合酶活性單位定義如下：以濃度為0.75 mM的被激活的小牛胸腺DNA為模板，在反應條件為72℃，1×反應緩沖液（包含200 mM Tris-HCl (pH 8.8)、20 mM MgSO4、100 mM KCl、100 mM (NH4)₂SO4、1% Triton X-100、1 mg/mL nuclease-free BSA），0.4 MBq/mL [3H]-dTTP下反應30 min，能催化10 nmol的dNTP聚合生成多核苷酸片段的酶量為1單位酶活，即1U。相應的，市場上常見的聚合酶活性測定方法主要是放射性同位素標記結(jié)合凝膠電泳。但是，因為同位素存在輻射，對人體有害，在使用過程中對實驗室的要求很高，實驗過程中的所有試劑、耗材等均需專門處理，否則會污染環(huán)境。一般實驗室、公司和研究機構(gòu)均不具備進行同位素標記法實驗的條件。此外，這種方法是一種活性終點測定法，無法實時監(jiān)測酶促反應進程，測定的可靠性較差；測定的活性線性范圍較窄，只有1個數(shù)量級，操作也比較復雜費時；基于該方法的試劑盒成本高，使用后需經(jīng)特殊處理才能不污染環(huán)境。

因此需要一種不依賴于同位素標記的聚合酶活性測定方法及試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種單鏈核酸分子以及基于該核酸分子的聚合酶活性測定方法及試劑盒，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中聚合酶活性測定對環(huán)境壓力大，成本高的問題。

為了實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種單鏈核酸分子，包括莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)和單鏈區(qū)；

所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)位于所述單鏈核酸分子的3’端，且從5’到3’方向依次包括第一配對區(qū)、單鏈環(huán)區(qū)和第二配對區(qū)；

所述第一配對區(qū)和第二配對區(qū)互補配對；

所述單鏈環(huán)區(qū)為（dM）_a，M為A、T、C或G，a為正整數(shù)；

所述單鏈區(qū)為（dN）_b，位于所述單鏈核酸分子的5’端，N為A、T、C或G，b為正整數(shù)。

優(yōu)選的，所述（dN）_b中含嘧啶的堿基占總堿基數(shù)的40%-60%。

優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)為（dA）_b、（dT）_b、（dC）_b、（dG）_b或（U）_b。

更優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)為（dT）_b或（dC）_b。

優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)環(huán)區(qū)為（dA）_a、（dT）_a、（dC）_a、（dG）_a或（U）_a。

優(yōu)選的，所述第一配對區(qū)在5-15bp之間。

優(yōu)選的，所述a在3-20之間。

優(yōu)選的，所述b在15-150之間。

優(yōu)選的，所述單鏈核酸分子上含有淬滅基團。

優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)、第二配對區(qū)或單鏈區(qū)的3’端。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)或第二配對區(qū)。

優(yōu)選的，所述淬滅基團為TAMRA、MGB或BHQ。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團為MGB或BHQ。

為了更好地實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提出一種聚合酶活性測定方法，包括以下步驟：

A、制備PCR反應體系，所述反應體系包括待測聚合酶、單鏈核酸分子、雙鏈DNA染料、dNTP和適宜所述待測聚合酶發(fā)揮活性的緩沖液；

B、進行PCR反應，并通過熒光檢測裝置檢測反應過程中的熒光強度；

所述單鏈核酸分子，包括莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)和單鏈區(qū)；

所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)位于所述單鏈核酸分子的3’端，且從5’到3’方向依次包括第一配對區(qū)、單鏈環(huán)區(qū)和第二配對區(qū)；

所述第一配對區(qū)和第二配對區(qū)互補配對；

所述單鏈環(huán)區(qū)為（dM）_a，M為A、T、C、G或U，a為正整數(shù)；

所述單鏈區(qū)為（dN）_b，位于所述單鏈核酸分子的5’端，N為A、T、C、G或U，b為正整數(shù)。

優(yōu)選的，所述（dN）_b中含嘧啶的堿基占總堿基數(shù)的40%-60%。

優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)為（dA）_b、（dT）_b、（dC）_b、（dG）_b或（U）_b。

更優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)為（dT）_b或（dC）_b。

優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)環(huán)區(qū)為（dA）_a、（dT）_a、（dC）_a、（dG）_a或（U）_a。

優(yōu)選的，所述第一配對區(qū)在5-15bp之間。

優(yōu)選的，所述a在3-20之間。

優(yōu)選的，所述b在15-150之間。

優(yōu)選的，所述單鏈核酸分子上含有淬滅基團。

優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)、第二配對區(qū)或單鏈區(qū)的3’端。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)或第二配對區(qū)。

優(yōu)選的，所述淬滅基團為TAMRA、MGB或BHQ。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團為MGB或BHQ。

優(yōu)選的，所述雙鏈DNA染料為Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。

更優(yōu)選的，所述雙鏈DNA染料為Eva Green。

優(yōu)選的，所述待測聚合酶為Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或phi 29 DNA聚合酶。

優(yōu)選的，所述反應體系還包括所述待測聚合酶的抗體，所述待測聚合酶的抗體能夠抑制所述待測聚合酶的低溫聚合酶活性。

優(yōu)選的，還包括以下步驟：

C、根據(jù)步驟B的結(jié)果獲得熒光值對時間的雙鏈核酸分子增長曲線，進而獲得待測聚合酶的反應初速度，并以待測聚合酶的反應初速度來表示待測聚合酶的活性。

更優(yōu)選的，還包括以下步驟:

D、配置一系列濃度的第一核酸分子，加入所述雙鏈DNA染料，進而測定不同第一核酸分子濃度條件下對應的熒光強度，進而獲得熒光強度對第一核酸分子濃度的標準曲線；

E、根據(jù)熒光強度對第一核酸分子濃度的標準曲線，將步驟C所得待測聚合酶的反應初速度，換算成按單位時間內(nèi)生成的第一核酸分子的量表示的聚合酶活性；

所述步驟D與步驟A、B、C沒有先后關(guān)系；

所述第一核酸分子是與所述單鏈核酸分子自我復制完成后形成的產(chǎn)物具有相同序列的單鏈DNA核酸分子。

更優(yōu)選的，還包括以下步驟：

F、利用標準聚合酶替換待測聚合酶重復步驟A至C，得標準聚合酶的反應初速度；

G、根據(jù)標準聚合酶和待測聚合酶反應初速度的對比，得待測聚合酶的相對酶活性。

更優(yōu)選的，還包括以下步驟：

H、利用標準聚合酶替換待測聚合酶重復步驟A至E，得標準聚合酶的聚合酶活性；

I、根據(jù)標準聚合酶和待測聚合酶的聚合酶活性的對比，得待測聚合酶的相對酶活性。

為了更好的實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提出一種聚合酶活性測定試劑盒，包括上述任一種單鏈核酸分子。

優(yōu)選的，所述所述（dN）_b中含嘧啶的堿基占總堿基數(shù)的40%-60%。

優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)為（dA）_b、（dT）_b、（dC）_b、（dG）_b或（U）_b。

更優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)為（dT）_b或（dC）_b。

優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)環(huán)區(qū)為（dA）_a、（dT）_a、（dC）_a、（dG）_a或（U）_a。

優(yōu)選的，所述第一配對區(qū)在5-15bp之間。

優(yōu)選的，所述a在3-20之間。

優(yōu)選的，所述b在15-150之間。

優(yōu)選的，所述單鏈核酸分子上含有淬滅基團。

優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)、第二配對區(qū)或單鏈區(qū)的3’端。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)或第二配對區(qū)。

優(yōu)選的，所述淬滅基團為TAMRA、MGB或BHQ。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團為MGB或BHQ。

優(yōu)選的，還包括雙鏈DNA染料、dNTP和適宜所述聚合酶發(fā)揮活性的緩沖液。

優(yōu)選的，所述dNTP為dTTP、dATP、dGTP或dCTP。

優(yōu)選的，所述雙鏈DNA染料為Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。

優(yōu)選的，所述聚合酶為Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或phi 29 DNA聚合酶。

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括所述聚合酶的抗體，所述聚合酶的抗體能夠抑制所述聚合酶的低溫聚合酶活性。

優(yōu)選的，還包括第一核酸分子，所述第一核酸分子是與所述單鏈核酸分子自我復制完成后形成的產(chǎn)物具有相同序列的單鏈DNA核酸分子。

更優(yōu)選的，所述第一核酸分子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)上含有淬滅基團。

由上可知，本發(fā)明獨特設(shè)計的單鏈核酸分子，在聚合酶活性測定過程中既是模板又是引物，避免了因為單獨添加引物量不當導致的聚合酶活性測定不準確的技術(shù)問題；同時，本發(fā)明的聚合酶活性測定方法和試劑盒采用熒光檢測的方法實現(xiàn)了對酶促反應的實時檢測，在降低對環(huán)境壓力的同時，降低了成本，步驟更為簡單，且提高了聚合酶活性檢測的準確性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明第一典型實施例中單鏈核酸分子的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是本發(fā)明第二典型實施例的原理圖。

圖3是本發(fā)明第一具體實施例的反應進程曲線圖。

圖4是本發(fā)明第二具體實施例的反應進程曲線圖。

圖5是本發(fā)明一具體實施例的反應進程曲線圖。

圖6是本發(fā)明第三具體實施例的反應進程曲線圖。

圖7是本發(fā)明第三具體實施例中對反應進程曲線的起始位點作切線后的圖。

圖8是本發(fā)明第三具體實施例的Taq DNA聚合酶使用濃度與初速度關(guān)系圖。

圖9是本發(fā)明第五具體實施例中的第一核酸分子濃度對熒光強度的標準曲線圖。

圖10是本發(fā)明第六具體實施例中不同雙鏈DNA染料的反應進程曲線圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。

本發(fā)明提出第一典型實施例，如圖1所示，一種單鏈核酸分子，包括莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)1和單鏈區(qū)2；

所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)1位于所述單鏈核酸分子的3’端，且從5’到3’方向依次包括第一配對區(qū)11、單鏈環(huán)區(qū)12和第二配對區(qū)13；

所述第一配對區(qū)11和第二配對區(qū)13完全互補配對；

所述單鏈環(huán)區(qū)12為（dM）_a，M為A、T、C、G或U，a為正整數(shù)；即，單鏈環(huán)區(qū)的核苷酸為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸、胞嘧啶脫氧核糖核苷酸、鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸或尿嘧啶核糖核苷酸；

所述單鏈區(qū)2為（dN）_b，位于所述單鏈核酸分子的5’端，N為A、T、C、G或U，b為正整數(shù)；即，單鏈區(qū)的核苷酸為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸、胞嘧啶脫氧核糖核苷酸、鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸或尿嘧啶核糖核苷酸。

在聚合酶活性測定過程（PCR擴增）中，因為要保證底物足夠豐富，因此常常需要在反應體系中添加過量的模板和引物，尤其是引物，以保證每個模板在退火后均結(jié)合有引物，并能被聚合酶延伸；而引物的過量添加，既提高了成本，又會在采用熒光檢測的方法測定聚合酶活性時，顯著提高本底值，導致聚合酶活性測定不夠準確。本實施例的單鏈核酸分子，在聚合酶活性測定過程中既是模板又是引物，既簡化了實驗步驟，又降低了實驗成本，提高了聚合酶活性檢測的準確性。

針對單鏈區(qū)的堿基的組成，本發(fā)明并無特殊限制，以下將通過數(shù)個較佳方案進行進一步的說明。

在本發(fā)明的第一實施例中，所述（dN）_b中含嘧啶的堿基占總堿基數(shù)的40%-60%。本實施例中，單鏈區(qū)含嘧啶和嘌呤的堿基比例與自然界中大多數(shù)生物的核酸分子中的比例一致，通過本實施中的單鏈核酸分子測定的聚合酶活性更能反映聚合酶在大多數(shù)工作條件下的活性。

優(yōu)選的，所述（dN）_b中含嘧啶和嘌呤的堿基均勻分布。本方案能夠進一步提高通過本實施中的單鏈核酸分子測定的聚合酶活性的真實性。

在本發(fā)明的第二實施例中，所述單鏈區(qū)為（dA）_b、（dT）_b、（dC）_b、（dG）_b或（U）_b。在應用至通過熒光檢測的方法測定聚合酶活性的前提下，與第一實施例相比，第二實施例中的單鏈核酸分子能使酶促反應的線性更好，熒光值更高，不同酶濃度的區(qū)分度更好，準確性更高。

更優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)為（dT）_b或（dC）_b。在應用至通過熒光檢測的方法測定聚合酶活性的前提下，與所述單鏈區(qū)為（dA）_b或（dG）_b的方案相比，本方案中的單鏈核酸分子能使酶促反應的線性更好，不同酶濃度的區(qū)分度更好，準確性更高。

針對單鏈區(qū)的長度，需要說明的是，本發(fā)明并無特殊限制，只要其能滿足進行聚合酶活性測定所需的長度即可。當單鏈區(qū)的長度過短，例如在15bp以下時，聚合酶能夠延伸的長度較短，可能導致活性測定不準確；而當單鏈區(qū)的長度過長時，所述單鏈核酸分子的合成成本較高。因此，當所述b在15-150之間時，能夠同時避免上述兩個問題。更優(yōu)選的，所述b在20-100之間。

此外，優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)自身以及單鏈區(qū)之間不形成二級結(jié)構(gòu)，這樣可避免因為單鏈區(qū)自身或單鏈區(qū)之間形成二級結(jié)構(gòu)，從而影響聚合酶活性的測定。

針對單鏈環(huán)區(qū)的堿基組成，需要說明的是，所述單鏈環(huán)區(qū)自身不能互補配對即可。

優(yōu)選的，所述單鏈環(huán)區(qū)為（dA）_a、（dT）_a、（dC）_a、（dG）_a或（U）_a。本方案中，單鏈環(huán)區(qū)為連續(xù)的寡聚核苷酸，不存在自身互不配對的問題，設(shè)計簡單，易合成。

針對單鏈環(huán)區(qū)的堿基長度，需要說明的是，本發(fā)明并無特殊的限制。

優(yōu)選的，所述單鏈環(huán)區(qū)的長度在3-20bp之間。本方案中，單鏈環(huán)區(qū)既不會影響第一配對區(qū)和第二配對區(qū)的互補配對，又不會因為單鏈環(huán)區(qū)的長度過長而增加設(shè)計難度。

更優(yōu)選的，所述a在3-5之間；即單鏈環(huán)區(qū)的長度在3-5bp之間。本方案進一步縮短了所述單鏈分子的整體堿基數(shù)，可有效降低合成成本。

針對第一配對區(qū)和第二配對區(qū)組成的互補配對區(qū)，需要說明的是，第一配對區(qū)和第二配對區(qū)互補配對，使得第二配對區(qū)的3’端在聚合酶的作用下能夠以單鏈區(qū)為模板進行延伸，從而使得本發(fā)明的單鏈核酸分子能夠在聚合酶活性測定過程中既是模板又是引物，在簡化實驗步驟的同時降低了實驗成本，還提高了聚合酶活性檢測的準確性。

優(yōu)選的，所述第一配對區(qū)的堿基數(shù)大于等于5bp。本方案同時保證了所述單鏈核酸分子莖環(huán)區(qū)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及聚合酶在互補配對區(qū)的穩(wěn)定結(jié)合。

更優(yōu)選的，所述第一配對區(qū)在5-15bp之間。本方案避免了因為第一配對區(qū)、第二配對區(qū)長度過長導致的所述單鏈核酸分子合成難度大，合成成本高的技術(shù)問題。

更優(yōu)選的，所述第一配對區(qū)在6-10bp之間。本方案與上一方案相比能夠進一步減少所述單鏈核酸分子的整體堿基數(shù)，可有效降低合成成本。

需要說明的是，所述第一配對區(qū)和第二配對區(qū)優(yōu)選完全互補配對；當然，第一配對區(qū)和第二配對區(qū)如果不是完全互補配對，也能用于聚合酶活性檢測，只要不互補配對的區(qū)域不在第二配對區(qū)3’端的倒數(shù)三個堿基內(nèi)；不過這種方案，會影響聚合酶與所述單鏈核酸分子的結(jié)合并降低聚合酶催化的延伸效率，降低聚合酶活性檢測的準確性。

優(yōu)選的，所述單鏈核酸分子上含有淬滅基團。所述淬滅基團能夠淬滅雙鏈DNA染料與核酸分子雙鏈區(qū)結(jié)合后產(chǎn)生的熒光。

優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)、第二配對區(qū)或單鏈區(qū)的3’端。

本方案的單鏈核酸分子在進行聚合酶活性測定時，能夠淬滅所述單鏈核酸分子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)結(jié)合的雙鏈DNA染料產(chǎn)生的熒光，降低本底值，從而提高聚合酶活性檢測的準確性。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)或第二配對區(qū)。

與上一方案相比，本方案的單鏈核酸分子在進行聚合酶活性測定時，能夠進一步避免淬滅基團對結(jié)合在所述單鏈區(qū)形成的雙鏈上的雙鏈DNA染料產(chǎn)生的熒光的干擾，提高聚合酶活性檢測的準確性。

優(yōu)選的，所述淬滅基團為TAMRA、MGB或BHQ；更優(yōu)選的，所述淬滅基團為MGB或BHQ。

MGB作為淬滅基團可以將Tm值提高10℃左右，這樣就可以減少第一配對區(qū)、第二配對區(qū)的堿基數(shù)，進而減少整個單鏈核酸分子的堿基數(shù)，從而使其成本更為低廉；同時，MGB與TAMARA相比，MGB作為淬滅基團與DNA雙鏈熒光染料的結(jié)合時，空間位置更接近，淬滅效果更好，本底更低，使得檢測結(jié)果更為準確。

另外，因為BHQ本身不產(chǎn)生熒光，而TAMRA本身會產(chǎn)生熒光，所以淬滅基團BHQ比TAMRA效果要好，熒光背景低，檢測結(jié)果更為準確。

本發(fā)明提出第二典型實施例，一種聚合酶活性測定方法，包括以下步驟：

A、制備PCR反應體系，所述反應體系包括待測聚合酶、單鏈核酸分子、雙鏈DNA染料、dNTP和適宜所述待測聚合酶發(fā)揮活性的緩沖液；

B、進行PCR反應，并通過熒光檢測裝置檢測反應過程中的熒光強度；

所述單鏈核酸分子為第一典型實施例中的任一種單鏈核酸分子。

如圖2所示，本方案利用第一典型實施例中的單鏈核酸分子同時作為PCR反應中的模板和引物，在待測聚合酶的作用下發(fā)生延伸反應，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，然后雙鏈DNA染料結(jié)合至雙鏈結(jié)構(gòu)發(fā)出熒光，并被熒光檢測裝置檢測到，通過記錄反應過程中熒光強度的變化值，即可根據(jù)熒光強度的變化獲得待測聚合酶的活性。

需要說明的是，本方案是一種不依賴于同位素標記的聚合酶活性測定方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對酶促反應的實時檢測，在降低對環(huán)境壓力的同時，降低了成本，步驟也更為簡單，同時還解決了因為單獨添加引物的量不當而導致的聚合酶活性測定不準確的技術(shù)問題，提高了聚合酶活性檢測的準確性。

步驟A中所述待測聚合酶，既可以DNA聚合酶也可以逆轉(zhuǎn)錄酶；也可以是依賴DNA的聚合酶或依賴RNA的聚合酶；也可以是嗜熱DNA聚合酶或嗜溫DNA聚合酶；還可以是α、β、γ、δ或ε家族DNA聚合酶。本發(fā)明的方案尤其適用于Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和phi29 DNA聚合酶的聚合酶活性檢測。

當所述待測聚合酶為逆轉(zhuǎn)錄酶時，將所述單鏈核酸分子的單鏈區(qū)中的T均用U代替即可。

對于步驟A中的雙鏈DNA染料，需要說明的是，其只要對雙鏈核酸分子具有特異性結(jié)合能力，并在與雙鏈DNA分子結(jié)合之后能夠產(chǎn)生熒光即可。

優(yōu)選的，所述雙鏈DNA染料為Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。本方案中，Eva Green、Sybr Green I和PicoGreen均是市場上最為常見的雙鏈DNA染料，有利于本方案的推廣應用。

目前市面上常見的聚合酶大都是嗜熱聚合酶，最適反應溫度一般都在72℃，但是這些聚合酶在室溫及其以下溫度往往都還會有聚合酶活性，為了避免聚合酶低溫聚合酶活性對聚合酶活性測定的影響，常用的方法是在冰上配制PCR反應液，通過低溫來限制聚合酶冷啟動活性，并在配制完成后立即將其置于已經(jīng)預熱好的PCR儀中進行PCR反應，但是這種方法并不能完全抑制聚合酶冷啟動活性。為了徹底解決聚合酶的低溫聚合酶活性對聚合酶活性測定的影響，本發(fā)明提出一實施方案，步驟A所述反應體系還包括所述待測聚合酶的抗體，所述待測聚合酶的抗體能夠抑制所述待測聚合酶的低溫聚合酶活性。例如，當待測聚合酶為Taq DNA聚合酶時，所述反應體系中還加入了Taq DNA聚合酶抗體，用于抑制Taq DNA聚合酶的低溫聚合酶活性，使得Taq DNA聚合酶的聚合酶活性檢測結(jié)果更為準確。

對于聚合酶的活性，需要說明的是，其可通過多種方式來表示。在本發(fā)明的第三實施例中，所述方法還包括以下步驟：

C、根據(jù)步驟B的結(jié)果獲得熒光值對時間的雙鏈核酸分子增長曲線，進而獲得待測聚合酶的反應初速度，并以待測聚合酶的反應初速度來表示待測聚合酶的活性。

需要說明的是，所述反應初速度是指在酶促反應的最初階段底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速度，最初階段是指底物消耗量在5%以內(nèi)的反應階段。根據(jù)實際檢測過程中的情況，所述最初反應階段可進行相應調(diào)整，例如，最初階段是指酶促反應發(fā)生的那一瞬間，或酶促反應發(fā)生的第1s，或?qū)Ξa(chǎn)物進行檢測時，第一次記錄產(chǎn)物的相應信號時。因此，所述反應初速度的定義可進行相應調(diào)整，為直接或間接反映底物消耗量在5%以內(nèi)的反應階段底物轉(zhuǎn)換為產(chǎn)物的速度。

在第三實施例的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出第四實施例，所述方法還包括以下步驟：

D、配置一系列濃度的第一核酸分子，加入所述雙鏈DNA染料，進而測定不同第一核酸分子濃度條件下對應的熒光強度，進而獲得熒光強度對第一核酸分子濃度的標準曲線；

E、根據(jù)熒光強度對第一核酸分子濃度的標準曲線，將步驟C所得待測聚合酶的反應初速度，換算成按單位時間內(nèi)生成的第一核酸分子的量表示的聚合酶活性；

所述步驟D與步驟A、B、C沒有先后關(guān)系；

所述第一核酸分子是與所述單鏈核酸分子自我復制完成后形成的產(chǎn)物具有相同序列的單鏈DNA核酸分子。

需要說明的是，本方案相對上一方案，其對聚合酶活性的表述更為直觀；所述第一核酸分子可通過所述單鏈核酸分子自我復制完成后回收獲得，也可以直接合成，還可以通過純化與所述單鏈核酸分子的單鏈區(qū)互補配對的單鏈核酸分子與所述單鏈核酸分子連接產(chǎn)物獲得。優(yōu)選通過所述單鏈核酸分子自我復制完成后回收獲得，本方案可以在一定程度上克服因為核酸分子合成過程中長度的限制，而獲得長度較長的第一核酸分子，本方法也較通過連接反應獲得的方法更為簡單，易得。

另外，所述第一核酸分子濃度可為質(zhì)量體積比，也可為摩爾數(shù)體積比；相應的所述第一核酸分子的量可為質(zhì)量，也可為摩爾數(shù)。

此外，所示第一核酸分子還可以是與所述單鏈核酸分子自我復制完成后形成的產(chǎn)物的雙鏈區(qū)具有相同序列的雙鏈核酸分子，本方案的第一核酸分子可直接通過化學合成的方式合成兩條單鏈核酸分子，然后退火而得，該方法較上述方案的回收方案更為簡單；且合成的兩條單鏈核酸分子的鏈長度相對較短，合成費用低，易操作，能降低本方案的試劑成本。

在第三實施例的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出第五實施例，所述方法還包括以下步驟：

F、利用標準聚合酶替換待測聚合酶重復步驟A至C，得標準聚合酶的反應初速度；

G、根據(jù)標準聚合酶和待測聚合酶反應初速度的對比，得待測聚合酶的相對酶活性。

本方案中，所述標準聚合酶的活性是已知；優(yōu)選的，所述標準聚合酶的活性是通過背景技術(shù)中所述的方法進行的聚合酶活性測定，其活性單位為U。更優(yōu)選的，所述標準聚合酶為市場上大公司生成銷售的聚合酶，且與待測聚合酶屬于相同類型的聚合酶。例如：均為Pfu DNA聚合酶、均為Taq DNA聚合酶、均為Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、均為Vent DNA聚合酶、均為MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或均為phi 29 DNA聚合酶。本方案通過F、G步驟，可將待測聚合酶的活性單位換算成U，這對廣大的使用者來說，更為方便和直觀，有利于與市面上的其他聚合酶的活性進行比較。

在第四實施例的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出第六實施例，所述方法還包括以下步驟：

H、利用標準聚合酶替換待測聚合酶重復步驟A至E，得標準聚合酶的聚合酶活性；

I、根據(jù)標準聚合酶和待測聚合酶的聚合酶活性的對比，得待測聚合酶的相對酶活性。

本實施例的方案與第五實施例一樣，均是通過與標準聚合酶的已知聚合酶活性的比較，將待測聚合酶的活性單位換算成目前通行的活性單位定義，更為方便和直觀，有利于與市面上的其他聚合酶的活性的比較。

本發(fā)明還提出了第三典型實施例，一種聚合酶活性測定試劑盒，包括第一典型實施例中的任一種單鏈核酸分子。

本實施例的試劑盒可用于不依賴于同位素標記的聚合酶活性測定方法，進而實現(xiàn)對酶促反應的實時檢測，在降低對環(huán)境壓力的同時，降低了成本，步驟也更為簡單，同時還解決了因為單獨添加引物的量不當而導致的聚合酶活性測定不準確的技術(shù)問題，提高了聚合酶活性檢測的準確性。

基于第三典型實施例，本發(fā)明提出第七實施例，所述試劑盒還包括雙鏈DNA染料、dNTP和適宜所述聚合酶發(fā)揮活性的緩沖液。

根據(jù)所述試劑盒中的所述單鏈核酸分子單鏈區(qū)的不同，所述dNTP可以有多種選擇。所述dNTP可以是dTTP、dATP、dGTP和dCTP的等摩爾數(shù)的混合液，本方案尤其適用于所述單鏈核酸分子為本發(fā)明第一實施例中的單鏈核酸分子。當所述單鏈核酸分子的單鏈區(qū)為（dA）_b、（dT）_b、（dC）_b、（dG）_b或（U）_b時，所述dNTP既可以是dTTP、dATP、dGTP和dCTP的等摩爾數(shù)的混合液，也可以是相對應的dTTP、dATP、dGTP、dCTP或dATP，即所述dNTP與單鏈區(qū)的堿基互補配對。

此外，需要說明的是，所述雙鏈DNA染料是對雙鏈核酸分子具有特異性結(jié)合能力，并在與雙鏈DNA分子結(jié)合之后能夠產(chǎn)生熒光的染料，其不與單鏈核酸分子結(jié)合。

優(yōu)選的，所述雙鏈DNA染料為Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。本方案中，Eva Green、Sybr Green I和PicoGreen均是市場上最為常見的雙鏈DNA染料，有利于本方案的推廣應用。

更優(yōu)選的，所述雙鏈DNA染料為Eva Green。

在第七實施例的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出另一優(yōu)選實施方案，所述試劑盒還包括所述聚合酶的抗體，所述聚合酶的抗體能夠抑制所述聚合酶的低溫聚合酶活性。本方案的試劑盒對聚合酶活性的檢測結(jié)果更為準確。

在上述實施例的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提出另一優(yōu)選實施方案，所述試劑盒還包括適宜所述聚合酶發(fā)揮活性的緩沖液。本方案的易用性更好。

在上述實施例的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提出另一優(yōu)選實施方案，所述試劑盒還包括第一核酸分子，所述第一核酸分子是與所述單鏈核酸分子自我復制完成后形成的產(chǎn)物具有相同序列的單鏈DNA核酸分子。

需要說明的是，本方案直接提供了用于對比的第一核酸分子，易用性更好。

更優(yōu)選的，所述第一核酸分子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)上含有淬滅基團。所述淬滅基團能夠淬滅雙鏈DNA染料與核酸分子雙鏈區(qū)結(jié)合后產(chǎn)生的熒光。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一核酸分子中包括的所述單鏈核酸分子的第一配對區(qū)、第二配對區(qū)或單鏈區(qū)的3’端。

本方案的第一核酸分子在進行聚合酶活性測定時，能夠淬滅所述第一核酸分子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)結(jié)合的雙鏈DNA染料產(chǎn)生的熒光，降低本底值，從而提高聚合酶活性檢測的準確性。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)或第二配對區(qū)。

與上一方案相比，本方案的第一核酸分子在應用至聚合酶活性測定時，能夠進一步避免淬滅基團對結(jié)合在所述第一核酸分子的雙鏈區(qū)域上的雙鏈DNA染料產(chǎn)生的熒光的干擾，提高聚合酶活性檢測的準確性。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團為TAMRA、MGB或BHQ。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團為MGB或BHQ。

以下將通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明進行進一步的詳細說明。

在第一具體實施例中，本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計了H60-1（SEQ ID NO:1）、H60-2（SEQ ID NO:2）、H60-3（SEQ ID NO:3）、H60-4（SEQ ID NO:4）、T60-1（SEQ ID NO:5）、A60-1（SEQ ID NO:6）、G60-1（SEQ ID NO:7）和C60-1（SEQ ID NO:8）等8種單鏈核酸分子，并交上海生工合成。

以Promega Pfu DNA聚合酶（M7741）作為待檢測聚合酶，用含0.1%BSA的水溶液稀釋成60mU/μL、30mU/μL、15mU/μL、7.5mU/μL、3.75mU/μL、1.875mU/μL、0.9375mU/μL等7個濃度梯度。

按2×Pfu反應緩沖液，10μL；Pfu DNA 聚合酶5μL；單鏈核酸分子（10μM），1μL；EvaGreen（20×），1μL；ddH₂O，3μL；合計20μL；分別配置上述9種單鏈核酸分子對不同Pfu DNA聚合酶濃度的反應體系，以ddH₂O為空白對照。其中，2×Pfu反應緩沖液為pH 9.0，含100mM Tris-HCl、8mM MgSO₄、0.06%Tween 20、0.6% BSA、0.4mM dNTP的水溶液。

將配制好的上述反應體系放在stepone plus熒光PCR儀的上，75℃保溫5min，每10s收集一次熒光信號。將收集到的熒光數(shù)據(jù)繪制反應進程曲線，結(jié)果如圖3所示。其中，圖3A-H，依次為H60-1、H60-2、H60-3、H60-4、T60-1、A60-1、G60-1和C60-1的反應進程曲線圖。所述反應進程曲線為時間熒光強度曲線，即熒光值（Rn）對時間的雙鏈核酸分子增長曲線。

需要說明的是，本發(fā)明的方法在利用所述單鏈核酸分子溶液配制反應體系之前，需先將所述單鏈核酸分子溶液高溫變性，然后退火才能使用。在第一具體實施例中，具體為于95℃變性5min，然后冰上退火。

由圖3可知，上述8種單鏈核酸分子中，后4種相對前4種對不同聚合酶濃度（用量）的區(qū)分度更好，熒光值更高，酶促反應的線性也更好；因此，基于后4種單鏈核酸分子進行的聚合酶活性檢測準確性也更高。

另外，需要說明的是，上述后四種單鏈核酸分子中，單鏈區(qū)為（dT）_b或（dC）_b的較另外2種對不同Pfu DNA聚合酶濃度（用量）的區(qū)分度更好，酶促反應線性區(qū)的線性也更好；因此，基于單鏈區(qū)為（dT）_b或（dC）_b的單鏈核酸分子進行的聚合酶活性檢測準確性比另外2種更高。

本發(fā)明還進一步將上述具體實施例中的Pfu DNA聚合酶和2×Pfu反應緩沖液換成Taq DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或phi 29 DNA聚合酶以及相應的適宜Taq DNA聚合酶、Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或phi 29 DNA聚合酶發(fā)揮活性的緩沖液；所得實驗結(jié)果與上述第一具體實施例類似；即DNA聚合酶可采用熒光檢測的方法實現(xiàn)其聚合酶活性的檢測。

在第二具體實施例中，采用H60-5（SEQ ID NO:9）、T15-1（SEQ ID NO:10）、T30-1（SEQ ID NO:11）、T60-2（SEQ ID NO:12）、T120-1（SEQ ID NO:13）、T150-1（SEQ ID NO:14）作為聚合酶活性檢測方法中的模板和引物，重復第一具體實施例的操作，結(jié)果如圖4所示。其中，圖4A-F，依次為H60-5、T15-1、T30-1、T60-2、T120-1、T150-1的反應進程曲線圖。

由圖4可知，隨著單鏈核酸分子中單鏈區(qū)長度的增長，在相同聚合酶濃度的前提下，酶促反應的線性范圍變大，線性更好；另外，雖然T15-1、T30-1的單鏈區(qū)比H60-1短了不少，但是與H60-1相比，其在聚合酶活性檢測實驗中線性更好，熒光值更高，不同酶濃度的區(qū)分度更好，準確性更高。與T15-1、T30-1類似的單鏈核酸分子，例如：單鏈區(qū)為（dC）_b、（dA）_b、（dG）_b或（U）_b，b小于等于60的單鏈核酸分子，在用于聚合酶活性檢測時，其結(jié)果與圖4中類似，在此不再另行詳細說明。以上結(jié)果說明當單鏈區(qū)為（dA）_b、（dT）_b、（dC）_b、（dG）_b或（U）_b時，即使單鏈區(qū)的長度較短，與本發(fā)明中的其他單鏈核酸分子相比，其在聚合酶活性檢測實驗中線性更好，熒光值更高，不同酶濃度的區(qū)分度更好，準確性更高。

此外，本發(fā)明還分別以：1）T20-1（SEQ ID NO:15）、T40-1（SEQ ID NO:16）、T60-3（SEQ ID NO:17）、T80-1（SEQ ID NO:18）、T100-1（SEQ ID NO:19）；2）C25-1（SEQ ID NO:20）、C50-1（SEQ ID NO:21）、C75-1（SEQ ID NO:22）、C100-1（SEQ ID NO:23）、C125-1（SEQ ID NO:24）等兩組單鏈核酸分子重復了上述單鏈區(qū)長度對聚合酶活性測定的影響實驗，部分結(jié)果如圖5所示。其中，圖5A-E，依次為T20-1、T40-1、T60-3、T80-1、T100-1的反應進程曲線圖。由圖5可知，所得結(jié)果與上述實驗結(jié)論完全相符。

在第三具體實施例中，以H60-6（SEQ ID NO:25）為單鏈核酸分子，參見圖6，以TaKaRa Taq DNA聚合酶作為待檢測聚合酶，用含0.1%BSA的水溶液稀釋成500mU/μL、250mU/μL、125mU/μL、62.5mU/μL、31.25mU/μL、15.625mU/μL、7.8125mU/μL和4.90625mU/μL等8個濃度梯度，并以dd H₂O為空白對照。

按2×Taq反應緩沖液，10μL；Taq DNA 聚合酶1μL；單鏈核酸分子（10μM），1μL；ddH₂O，6μL；EvaGreen（20×），1μL；anti-taq抗體（500mU/μL），1μL；合計20μL分別配置上述單鏈核酸分子對不同Taq DNA聚合酶濃度的反應體系。其中，2×Taq反應緩沖液為pH 8.3，含100mM Tris-HCl、8mM MgCl₂、0.06%Tween 20、0.3% BSA、0.4mM dNTP的水溶液。

將配制好的上述反應體系放在stepone plus熒光PCR儀的上，96℃變性20s；然后75℃保溫5min，每10s收集一次熒光信號。將收集到的熒光數(shù)據(jù)繪制反應進程曲線，結(jié)果如圖6所示。

需要說明的是，為了保證anti-taq抗體對Taq DNA聚合酶的低溫聚合酶活性的抑制作用，在反應體系的配置過程中，優(yōu)選先將anti-taq抗體、2×Taq反應緩沖液、單鏈核酸分子、ddH₂O和EvaGreen（20×）等混勻，然后再加入Taq DNA 聚合酶。

對于簡單的米氏酶（Michaelian Enzyme），初速度與酶濃度的線性關(guān)系前提條件是反應體系中底物濃度遠大于酶濃度，在本例中，Taq DNA聚合酶的聚合反應實際上是dNTP和H60-6雙底物的酶促反應，但dNTP濃度通常遠遠大于酶的濃度，因此需要研究的是H60-6與酶的濃度關(guān)系，本實驗的反應體系中，底物H60-6與酶的最小摩爾比約為50:1，因此H60-6濃度也是遠大于Taq DNA聚合酶濃度，這滿足米氏方程的前提條件。

在圖6中以曲線起始位點（10s處）作切線，如圖7所示，記錄斜率，結(jié)果如表1所示。

表1.酶用量和反應初速度（切線斜率）數(shù)據(jù)

根據(jù)表1的數(shù)據(jù)可繪制Taq DNA聚合酶使用濃度與初速度關(guān)系圖，結(jié)果如圖8所示，對圖8中的曲線進行線性回歸分析，R²=0.9984，說明在上述酶濃度區(qū)間內(nèi)，酶濃度與初速度的線性關(guān)系良好，所測量的酶活性濃度準確性也較高，可用切線斜率來直接表示聚合酶活性。

在第三具體實施例的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出第四具體實施例，同樣以H60-6（SEQ ID NO:25）為單鏈核酸分子，以自制的Taq DNA聚合酶為待檢測DNA聚合酶，用含0.1%BSA的水溶液將待檢測DNA聚合酶稀釋40倍和80倍，各3個重復實驗，然后參照第三具體實施例的方法進行檢測，取平均值。結(jié)果如表2所示。

表2.酶用量和反應初速度（切線斜率）數(shù)據(jù)

將上表中的數(shù)據(jù)帶入圖8中的線性回歸方程，可知待檢測DNA聚合酶 1/40和待檢測DNA聚合酶 1/80的酶濃度分別為188.01mU/μL、90.03 mU/μL；換算成原液活性濃度則分別為7.52mU/μL和7.20U/μL，平均值為7.36U/μL。

上述具體實施例是通過反應過程中檢測到的熒光值繪制曲線，然后以曲線起始位點（10s處）作切線，記錄斜率，以斜率表示聚合酶的反應初速度并作為聚合酶的活性，依賴于雙鏈熒光染料與含雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA分子結(jié)合后產(chǎn)生的熒光與含雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA分子的量的線性關(guān)系。

為了更真實的反映反應過程中第一核酸分子的量與雙鏈熒光染料之間的關(guān)系，本發(fā)明提出第五具體實施例。

本實施例中，按2×Pfu反應緩沖液，50μL；Promega Pfu DNA聚合酶（M7741），5μL；T100-1（SEQ ID NO：19）（10μM），5μL；ddH₂O，40μL；合計100μL；配置反應體系。然后將配置好的反應體系置于PCR儀中，96℃變性20s；然后75℃保溫20min，將PCR產(chǎn)物純化回收獲得T100-1自我復制完成后形成的產(chǎn)物。測定回收產(chǎn)物的濃度，并配置40ng/μL、20ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL和1.25ng/μL等6個濃度梯度的回收產(chǎn)物。

按2×Pfu反應緩沖液，10μL；回收產(chǎn)物，5μL；EvaGreen（20×），1μL；ddH₂O，4μL；合計20μL；分別配置上述6個濃度梯度的回收產(chǎn)物對應的反應體系。另外以ddH₂O為陰性對照。將配制好的上述7個反應體系放在stepone plus熒光PCR儀的上，75℃保溫5min，每10s收集一次熒光信號。將收集到的熒光數(shù)據(jù)對DNA量作熒光強度對第一核酸分子濃度的標準曲線圖，然后線性回歸分析圖中的曲線，結(jié)果如圖9所示，R²=0.9991，說明在上述DNA濃度區(qū)間內(nèi)，DNA濃度與熒光強度的線性關(guān)系良好，可根據(jù)聚合酶活性檢測過程中熒光檢測裝置檢測到的熒光強度，利用所得的線性方程計算相應的熒光強度對應的DNA質(zhì)量。

需要說明的是，本具體實施例中所述第一核酸分子（回收產(chǎn)物）濃度采用的是質(zhì)量體積比，可根據(jù)第一核酸分子的分子量換算成摩爾數(shù)體積比；然后重做標準曲線圖，并進一步得線性方程，然后可根據(jù)聚合酶活性檢測過程中熒光檢測裝置檢測到的熒光強度，利用所得的線性方程計算相應的熒光強度對應的DNA的摩爾數(shù)。當然也可根據(jù)第一核酸分子的分子量，直接將上述熒光強度對應的DNA質(zhì)量換算成熒光強度對應的DNA摩爾數(shù)。

另外，基于本具體實施例，可參考第四具體實施例，通過已知的標準聚合酶活性（單位為U，采用同位素標記方法獲得），以及通過本實施例方法獲得的標準聚合酶的反應初速度和待測聚合酶的反應初速度的比值，換算出以U為單位的待測聚合酶活性。

在本發(fā)明的第六具體實施例中，對Eva Green、Sybr Green、PicoGreen三種雙鏈DNA染料在聚合酶活性檢測過程中的效果進行比較。

以Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶（HYK，EN1001，5U/μL）為待檢測聚合酶，利用含0.1%BSA、0.01%Tween 20的水溶液稀釋成12.5mU/μL備用，T60-1（SEQ ID NO:5）作為模板和引物。

按2×Kenow反應緩沖液，10μL；T60-1（10μM），1μL；雙鏈DNA染料（20×），1μL；ddH₂O，3μL；合計15μL；分別配置上述3種雙鏈DNA染料對Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶的反應體系。

其中，2×Kenow反應緩沖液為pH 8.8，含100mM Tris-HCl、8mM MgSO₄、0.06%Tween 20、0.6% BSA、0.4mM dATP的水溶液。

將配制好的上述反應體系在95℃保溫5min，然后立即放入冰上冷卻；隨后每個體系加入Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶（12.5mU/μL），5μL；將溶液充分混勻，在離心機上離心10s，立即放入ABI Step-One plus熒光PCR儀，37℃保溫5min，每10s收集一次熒光信號。將收集到的熒光數(shù)據(jù)繪制反應進程曲線，結(jié)果如圖10所示。其中，EG代表Eva Green；SG代表Sybr Green；PG代表PicoGreen。由圖10可知，熒光強度最快達到峰值的是Eva Green，其次是Sybr Green，最后是PicoGreen；即，Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶的活性在Eva Green作為雙鏈DNA染料的體系中最強。用Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、phi 29 DNA聚合酶或Vent DNA聚合酶等聚合酶替換第六具體實施例中的Klenow Fragment（3’-5’exo-）DNA聚合酶，所得結(jié)果與第六具體實施例類似，熒光強度最快達到峰值的仍然是Eva Green，其次是Sybr Green，最后是PicoGreen；即，聚合酶的活性在Eva Green作為雙鏈DNA染料的體系中最強。所述雙鏈DNA染料優(yōu)選Eva Green。

在本發(fā)明的第七實施例中，以MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa，639523，15U/μL）作為待檢測聚合酶，U60-1（SEQ ID NO：26）作為模板和引物。

利用含0.1%BSA、0.01%Tween 20的水溶液將MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶稀釋200倍、400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍。

按5×First-Strand Buffer，4μL；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，5μL；U60-1（10μM），1μL；EvaGreen（20×），1μL；ddH₂O，9μL；合計20μL；配置不同MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度的反應體系，以ddH₂O為空白對照。

將配制好的上述反應體系放在stepone plus熒光PCR儀的上，42℃保溫5min，每10s收集一次熒光信號。將收集到的熒光數(shù)據(jù)繪制反應進程曲線，然后以曲線起始位點（10s處）作切線，記錄斜率；然后對斜率和對應的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶使用濃度作曲線，對曲線進行線性回歸分析，R²=0.9991，說明在上述酶濃度區(qū)間內(nèi)，酶濃度與初速度的線性關(guān)系良好，本方案可用于MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 盛司潼

<120> 一種單鏈核酸分子、聚合酶活性測定方法及試劑盒

<130>

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tacgcaccag ttccgcagat agacatactt attaacttat attcactctt acttatactc 60

ccgactttgt cgg 73

<210> 2

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacgcaccag ttccgcagat agacatactt attaacttat attcactctt acttatactc 60

ccgatcatca tcatcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagatga tgatgatcgg 110

<210> 3

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacgcaccag ttccgcagat agacatactt attaacttat attcactctt acttatactc 60

attgattgaa ggcggttcaa tcaat 85

<210> 4

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tacgcaccag ttccgcagat agacatactt attaacttat attcactctt acttatactc 60

aggcgtcccc acgcct 76

<210> 5

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tgctcccgcg gccgatctgc tcggccgcgg gagca 95

<210> 6

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

acggcgtttt cgccgt 76

<210> 7

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 60

aaccaggccg cgtggtt 77

<210> 8

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60

atcgataatt ttttatcgat 80

<210> 9

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tactggctgt actgaccgct tccgcagata gacatactta ttaacttata ttcactctta 60

atcgatactt ttgtatcgat 80

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttttttttt tttttgggac cgaaacggtc cc 32

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tttttttttt tttttttttt tttttttttt gggaccgaaa cggtccc 47

<210> 12

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

gggaccgaaa cggtccc 77

<210> 13

<211> 137

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120

gggaccgaaa cggtccc 137

<210> 14

<211> 167

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120

tttttttttt tttttttttt tttttttttt gggaccgaaa cggtccc 167

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tttttttttt tttttttttt cccgcggctt ttgccgcggg 40

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt cccgcggctt ttgccgcggg 60

<210> 17

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

cccgcggctt ttgccgcggg 80

<210> 18

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt cccgcggctt ttgccgcggg 100

<210> 19

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt cccgcggctt ttgccgcggg 120

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cccccccccc cccccccccc cccccagctc ccgcgaaaaa cgcgggagct 50

<210> 21

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc agctcccgcg 60

aaaaacgcgg gagct 75

<210> 22

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60

cccccccccc cccccagctc ccgcgaaaaa cgcgggagct 100

<210> 23

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc agctcccgcg aaaaacgcgg 120

gagct 125

<210> 24

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 60

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 120

cccccagctc ccgcgaaaaa cgcgggagct 150

<210> 25

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tacaccagtt ccgcagatag acatacttat taacttatat tcactcttac ttatactccc 60

acgtcgtgct tttgcacgac gt 82

<210> 26

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 60

atcgataccc ccgtatcgat 80