本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域,尤其是一種類海膽肽口服液的制備方法。
背景技術(shù):
近年來,關(guān)于活性氧自由基(ROS)的研究日益增多。許多研究已經(jīng)證實:活性氧自由基與癌癥、肝病、老年癡呆癥、關(guān)節(jié)炎、糖尿病等疾病的產(chǎn)生有關(guān)。凡是能干擾自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中鏈引發(fā)和鏈增長過程,清除ROS的化合物統(tǒng)稱為抗氧化劑。抗氧化劑有內(nèi)源性和外源性兩大類。前者包括生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的抗氧化酶、尿酸、泛醌、谷胱甘肽等,后者包括一些合成或者天然的抗氧化劑,如丁基羥基茴香醚、植物多酚等等。由于化學(xué)合成的酚類抗氧化劑的安全性受到質(zhì)疑,天然抗氧化劑已成為國內(nèi)外競相研究的熱點。
海膽之名始載于《本草原始》,是一種在世界各地食用廣泛的海洋水產(chǎn)。海膽的生殖腺是海膽黃,含有大量的蛋白質(zhì),海膽黃中蛋白質(zhì)可占干重的44.5%,其營養(yǎng)價值類似于酪蛋白,含有17中氨基酸,不但具有很高的食用價值,還有極好的藥用功能,是制備抗氧化劑—活性肽的天然原料。同時,以海膽黃為原料制備海膽肽口服液的技術(shù)已有公開報道,例如,2015年9月2日公開的CN104872673A中國發(fā)明專利申請公開說明書中就公開這樣一種“海膽肽口服液及其制備方法”,其是將新鮮海膽剝開后,取出海膽黃與水混合磨漿,加入脂肪酶進(jìn)行酶解脫脂,超濾收集截留液,即為海膽黃粗蛋白溶液,將海膽黃粗蛋白溶液采用菠蘿蛋白酶和生姜蛋白酶階段性協(xié)同酶解,酶解液再經(jīng)過濾、超濾,調(diào)配和濃縮后得到海膽肽口服液。但是,海膽產(chǎn)量有限,并且海膽黃容易自溶,海膽捕撈出水后,放置半日至一日,就可能發(fā)軟變質(zhì),失去原有的營養(yǎng)價值。因此,以海膽黃為原料制備活性肽及產(chǎn)品易受到捕撈季節(jié)、地理條件等影響,且生產(chǎn)成本高。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
為了克服現(xiàn)有以海膽黃為原料制備活性肽及產(chǎn)品易受到捕撈季節(jié)等影響及生產(chǎn)成本高的不足,本發(fā)明提供一種工藝合理、易于操作、原料來源不受限制、生產(chǎn)成本低的類海膽肽口服液的制備方法,該方法利用生物工程技術(shù)獲得大量2~6個氨基酸組成的小肽為主要成分的類海膽肽,可被人體不經(jīng)消化而直接吸收,制備的類海膽肽口服液營養(yǎng)價值、口感淳厚、酸甜適中。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種類海膽肽口服液及其制備方法,其特征在于:經(jīng)過下列工藝步驟:
(1)、海膽黃細(xì)胞RNA的提取
(1.1)、勻漿處理
稱取100~200mg海膽黃組織在液氮中磨碎,加入1~2ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理;
(1.2)、靜置
將步驟(1.1)中得到的勻漿后的混合物在室溫條件下靜置3~5min,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離;
(1.3)、離心去雜質(zhì)
將步驟(1.2)中得到的靜置后的混合物于2~8℃條件下,10000g離心8~10min,收取上清液;
(1.4)、抽提
將步驟(1.3)中得到的上清液中加入其體積10%~20%的氯仿,劇烈振蕩15~20s,室溫靜置2~3min;
(1.5)、離心
將步驟(1.4)中得到的室溫靜置后的混合物于2~8℃條件下,10000g離心10~15min;樣品分為三層:有機(jī)相、水相和中間層;
(1.6)、沉淀
將步驟(1.5)中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中,按體積比1:1~2的比例加入異丙醇,室溫靜置8~10min,于2~8℃條件下,10000g離心8~10min,管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀,移去上清液,即得RNA沉淀;
(1.7)、洗滌
向步驟(1.6)中得到的RNA沉淀中加入1~1.5ml、濃度為75%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌,再于2~8℃條件下,6000~7500g離心3~5min,棄上清液,得洗滌后的RNA沉淀;
(1.8)、干燥
將步驟(1.7)中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥5~10min,然后加入25~200μl無RNase的水,用槍頭吸打混勻,于55~60℃條件下靜置8~10min,使RNA溶解,-70℃保存,備用;
(2)、反轉(zhuǎn)錄
將步驟(1.8)中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法,利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得海膽黃細(xì)胞的cDNA;
(3)、構(gòu)建表達(dá)載體
將步驟(2)中得到的海膽黃細(xì)胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,利用大量隨機(jī)引物:引物L(fēng)-隨機(jī)和R-隨機(jī) PCR擴(kuò)增25個循環(huán)后回收,酶切后,回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,得到含有表達(dá)載體pET32(a)-隨機(jī)的大腸桿菌,挑取菌落,接種入LB液體培養(yǎng)基,待菌液濃度為OD值接近1.0時,向其中加入菌液體積10%~15%的甘油,-70℃保存,得到轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體的菌株;
(4)、蛋白表達(dá)
挑取步驟(3)中保存的菌株,接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)8~12h;將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)8~12h;將500ml菌液接種至50~80L發(fā)酵罐中,跟蹤菌體生長指標(biāo),待OD600≈0.4~0.6,向其中加入IPTG至終濃度為0.3~0.4mM,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h;開罐取菌液,12000g離心30~60s,用發(fā)酵液體積10%~20%的、濃度為1%的SDS溶液進(jìn)行重懸,混勻,冰上超聲破碎;12000g離心30~60s,取上清液,即為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物;
(5)、酶切
將步驟(4)中的海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行充分酶切,得到類海膽酶切溶液;其中,所述的復(fù)合蛋白酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶中的兩種或多種;復(fù)合蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的1%~2.5%;
(6)、超濾濃縮
將步驟(5)中得到的類海膽酶切溶液利用2000Kd的超濾管進(jìn)行超濾,收集濾過液,即得2000Kd以下的2~6個氨基酸大小的類海膽肽溶液;
(7)、調(diào)配
稱取步驟(6)中得到的類海膽肽溶液加入其質(zhì)量6%~6.5%的枸杞提取液、1%~1.5%的薄荷提取液、0.00015~0.00018%的乳酸鏈球菌素混合均勻,得調(diào)配液;
(8)、滅菌
將步驟(7)中得到的調(diào)配液經(jīng)精濾膜精濾后,進(jìn)行高溫瞬時滅菌;
(9)、灌裝
將步驟(8)中得到的滅菌后的精濾液用灌裝機(jī)按預(yù)設(shè)重量進(jìn)行分瓶真空灌裝,封口,獲得類海膽肽口服液。
所述的枸杞提取液其是稱取枸杞采用去離子水沖洗后,按照料液比1:30~40添加去離子水,浸泡2~3h,蒸煮20~30min,過濾,收集濾液后進(jìn)行抽濾,澄清透過液即得枸杞提取液。
所述的薄荷提取液其稱取薄荷采用去離子水沖洗后,按照料液比1:30~40添加去離子水,浸泡2~3h,打漿,蒸煮20~30min,過濾,收集濾液后進(jìn)行抽濾,澄清透過液即得薄荷提取液。
所述的勻漿后的混合物靜置時的室溫控制為15~30℃。
所述的高溫瞬時滅菌的滅菌溫度為120~140℃,滅菌時間為4~6s。
所述的真空灌裝的真空度為0.04~0.05Mpa,灌裝溫度控制在60~75℃。
本發(fā)明先是選取海膽黃組織通過氯仿抽提方法,獲得海膽黃細(xì)胞RNA;再采用RT-PCR的方法,得到海膽黃細(xì)胞的cDNA,然后利用隨機(jī)引物進(jìn)行PCR,得到各種隨機(jī)的基因片段,然后將得到的基因片段克隆入原核表達(dá)載體,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),得到隨機(jī)基因編碼的隨機(jī)蛋白,這些蛋白有一個共同的特點,都是來源于海膽黃細(xì)胞的RNA,即均為海膽黃細(xì)胞中所含有蛋白或蛋白片段,氨基酸組成與海膽黃細(xì)胞的氨基酸組成基本類似,克服了生產(chǎn)原料受限的問題,所得到的蛋白用于后期的口服液加工使用,使得到的口服液產(chǎn)品具有海膽黃的氨基酸組成,不影響營養(yǎng)價值和功效,以達(dá)到提供與海膽黃多肽類似的抗氧化作用。本發(fā)明采用的是原核表達(dá)的方法,因原核表達(dá)技術(shù)成熟,價格低廉,易于操作,降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明將枸杞提取液和薄荷提取液與類海膽肽溶液進(jìn)行調(diào)配,不添加任何化學(xué)物質(zhì),使類海膽肽口服液口感淳厚,酸甜適中,鮮味十足。枸杞提取液和薄荷提取液中含有豐富的枸杞多糖、有機(jī)酸、苷類和黃酮類物質(zhì),其抗氧化活性大大提高了海膽肽口服液的營養(yǎng)價值和保健功能。本發(fā)明的類海膽肽口服液的制備方法,其工藝合理,操作可行,易實現(xiàn)規(guī)?;a(chǎn)。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例1
一種類海膽肽口服液及其制備方法,經(jīng)過下列工藝步驟:
(1)、海膽黃細(xì)胞RNA的提取
(1.1)、勻漿處理
稱取150mg海膽黃組織在液氮中磨碎,加入1.5ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理;
(1.2)、靜置
將步驟(1.1)中得到的勻漿后的混合物在室溫控制為20℃條件下靜置4min,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離;
(1.3)、離心去雜質(zhì)
將步驟(1.2)中得到的靜置后的混合物于5℃條件下,10000g離心9min,收取上清液;
(1.4)、抽提
將步驟(1.3)中得到的上清液中加入其體積16%的氯仿,劇烈振蕩18s,室溫靜置3min;
(1.5)、離心
將步驟(1.4)中得到的室溫靜置后的混合物于5℃條件下,10000g離心12min;樣品分為三層:有機(jī)相、水相和中間層;
(1.6)、沉淀
將步驟(1.5)中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中,按體積比1:1.6的比例加入異丙醇,室溫靜置9min,于5℃條件下,10000g離心9min,管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀,移去上清液,即得RNA沉淀;
(1.7)、洗滌
向步驟(1.6)中得到的RNA沉淀中加入1.2ml、濃度為75%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌,再于5℃條件下,7000g離心4min,棄上清液,得洗滌后的RNA沉淀;
(1.8)、干燥
將步驟(1.7)中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥8min,然后加入100μl無RNase的水,用槍頭吸打混勻,于58℃條件下靜置9min,使RNA溶解,-70℃保存,備用;
(2)、反轉(zhuǎn)錄
將步驟(1.8)中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法,利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得海膽黃細(xì)胞的cDNA;
(3)、構(gòu)建表達(dá)載體
將步驟(2)中得到的海膽黃細(xì)胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,利用大量隨機(jī)引物:引物L(fēng)-隨機(jī)和R-隨機(jī) PCR擴(kuò)增25個循環(huán)后回收,酶切后,回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,得到含有表達(dá)載體pET32(a)-隨機(jī)的大腸桿菌,挑取菌落,接種入LB液體培養(yǎng)基,待菌液濃度為OD值接近1.0時,向其中加入菌液體積12%的甘油,-70℃保存,得到轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體的菌株;
(4)、蛋白表達(dá)
挑取步驟(3)中保存的菌株,接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)10h;將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)10h;將500ml菌液接種至65L發(fā)酵罐中,跟蹤菌體生長指標(biāo),待OD600≈0.5,向其中加入IPTG至終濃度為0.35mM,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h;開罐取菌液,12000g離心45s,用發(fā)酵液體積15%的、濃度為1%的SDS溶液進(jìn)行重懸,混勻,冰上超聲破碎;12000g離心45s,取上清液,即為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物;
(5)、酶切
將步驟(4)中的海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行充分酶切,得到類海膽酶切溶液;其中,所述的復(fù)合蛋白酶為中性蛋白酶和胰蛋白酶,中性蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的1%,胰蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的1.2%;
(6)、超濾濃縮
將步驟(5)中得到的類海膽酶切溶液利用2000Kd的超濾管進(jìn)行超濾,收集濾過液,即得2000Kd以下的2~6個氨基酸大小的類海膽肽溶液;
(7)、調(diào)配
稱取步驟(6)中得到的類海膽肽溶液加入其質(zhì)量6.,2 %的枸杞提取液、1.2%的薄荷提取液、0.00016%的乳酸鏈球菌素混合均勻,得調(diào)配液;其中,枸杞提取液其是稱取枸杞采用去離子水沖洗后,按照料液比1:35添加去離子水,浸泡2.5h,蒸煮25min,過濾,收集濾液后進(jìn)行抽濾,澄清透過液即得枸杞提取液;薄荷提取液其稱取薄荷采用去離子水沖洗后,按照料液比1:32添加去離子水,浸泡3h,打漿,蒸煮25min,過濾,收集濾液后進(jìn)行抽濾,澄清透過液即為薄荷提取液;
(8)、滅菌
將步驟(7)中得到的調(diào)配液經(jīng)孔徑為0.5微米的精濾膜精濾后,進(jìn)行高溫瞬時滅菌,其滅菌溫度為130℃,滅菌時間為5s;
(9)、灌裝
將步驟(8)中得到的滅菌后的精濾液用灌裝機(jī)按每瓶100g進(jìn)行分瓶真空灌裝,其真空度為0.045Mpa,灌裝溫度控制在70℃,封口,獲得類海膽肽口服液。
本實施例得到隨機(jī)基因編碼的隨機(jī)蛋白的氨基酸組成與海膽黃細(xì)胞的氨基酸組成基本類似,克服了生產(chǎn)原料受限的問題,所得到的類海膽蛋白營養(yǎng)價值高和抗氧化功效好。其采用的原核表達(dá)方法技術(shù)成熟,價格低廉,易于操作,降低了生產(chǎn)成本。其將類海膽肽與枸杞提取液和薄荷提取液進(jìn)行調(diào)配,得到的口服液口感淳厚,酸甜適中。枸杞提取液和薄荷提取液中含有豐富的枸杞多糖、有機(jī)酸、苷類和黃酮類物質(zhì),其抗氧化活性大大提高了海膽肽口服液的營養(yǎng)價值和保健功能。其制備方法工藝合理,操作可行,易實現(xiàn)規(guī)?;a(chǎn)。
實施例2
一種類海膽肽口服液及其制備方法,經(jīng)過下列工藝步驟:
(1)、海膽黃細(xì)胞RNA的提取
(1.1)、勻漿處理
稱取200mg海膽黃組織在液氮中磨碎,加入2ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理;
(1.2)、靜置
將步驟(1.1)中得到的勻漿后的混合物在室溫控制為30℃條件下靜置3min,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離;
(1.3)、離心去雜質(zhì)
將步驟(1.2)中得到的靜置后的混合物于8℃條件下,10000g離心8min,收取上清液;
(1.4)、抽提
將步驟(1.3)中得到的上清液中加入其體積20%的氯仿,劇烈振蕩20s,室溫靜置3min;
(1.5)、離心
將步驟(1.4)中得到的室溫靜置后的混合物于8℃條件下,10000g離心15min;樣品分為三層:有機(jī)相、水相和中間層;
(1.6)、沉淀
將步驟(1.5)中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中,按體積比1: 2的比例加入異丙醇,室溫靜置10min,于8℃條件下,10000g離心10min,管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀,移去上清液,即得RNA沉淀;
(1.7)、洗滌
向步驟(1.6)中得到的RNA沉淀中加入1.5ml、濃度為75%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌,再于8℃條件下, 7500g離心3min,棄上清液,得洗滌后的RNA沉淀;
(1.8)、干燥
將步驟(1.7)中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥10min,然后加入200μl無RNase的水,用槍頭吸打混勻,于60℃條件下靜置8min,使RNA溶解,-70℃保存,備用;
(2)、反轉(zhuǎn)錄
將步驟(1.8)中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法,利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得海膽黃細(xì)胞的cDNA;
(3)、構(gòu)建表達(dá)載體
將步驟(2)中得到的海膽黃細(xì)胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,利用大量隨機(jī)引物:引物L(fēng)-隨機(jī)和R-隨機(jī) PCR擴(kuò)增25個循環(huán)后回收,酶切后,回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,得到含有表達(dá)載體pET32(a)-隨機(jī)的大腸桿菌,挑取菌落,接種入LB液體培養(yǎng)基,待菌液濃度為OD值接近1.0時,向其中加入菌液體積15%的甘油,-70℃保存,得到轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體的菌株;
(4)、蛋白表達(dá)
挑取步驟(3)中保存的菌株,接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)12h;將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)12h;將500ml菌液接種至80L發(fā)酵罐中,跟蹤菌體生長指標(biāo),待OD600≈0.6,向其中加入IPTG至終濃度為0.4mM,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h;開罐取菌液,12000g離心60s,用發(fā)酵液體積120%的、濃度為1%的SDS溶液進(jìn)行重懸,混勻,冰上超聲破碎;12000g離心60s,取上清液,即為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物;
(5)、酶切
將步驟(4)中的海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行充分酶切,得到類海膽酶切溶液;其中,復(fù)合蛋白酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶;木瓜蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的0.5%,菠蘿蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的1%,胰蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的1%;
(6)、超濾濃縮
將步驟(5)中得到的類海膽酶切溶液利用2000Kd的超濾管進(jìn)行超濾,收集濾過液,即得2000Kd以下的2~6個氨基酸大小的類海膽肽溶液;
(7)、調(diào)配
稱取步驟(6)中得到的類海膽肽溶液加入其質(zhì)量6.5%的枸杞提取液、1%的薄荷提取液、0.00018%的乳酸鏈球菌素混合均勻,得調(diào)配液;其中,枸杞提取液其是稱取枸杞采用去離子水沖洗后,按照料液比1:30添加去離子水,浸泡2h,蒸煮20min,過濾,收集濾液后進(jìn)行抽濾,澄清透過液即得枸杞提取液;薄荷提取液其稱取薄荷采用去離子水沖洗后,按照料液比1:30添加去離子水,浸泡2h,打漿,蒸煮20min,過濾,收集濾液后進(jìn)行抽濾,澄清透過液即為薄荷提取液;
(8)、滅菌
將步驟(7)中得到的調(diào)配液經(jīng)孔徑為0.5微米的精濾膜精濾后,進(jìn)行高溫瞬時滅菌,其滅菌溫度為120℃,滅菌時間為6s;
(9)、灌裝
將步驟(8)中得到的滅菌后的精濾液用灌裝機(jī)按每瓶80g進(jìn)行分瓶真空灌裝,其真空度為0.05Mpa,灌裝溫度控制在60℃,封口,獲得類海膽肽口服液。
本實施例得到隨機(jī)基因編碼的隨機(jī)蛋白的氨基酸組成與海膽黃細(xì)胞的氨基酸組成基本類似,克服了生產(chǎn)原料受限的問題。其采用的原核表達(dá)方法技術(shù)成熟,易于操作,生產(chǎn)成本低。本實施例將類海膽肽與枸杞提取液和薄荷提取液進(jìn)行調(diào)配,得到類海膽肽口服液口感淳厚,酸甜適中。其制備方法工藝合理,操作可行,易實現(xiàn)規(guī)?;a(chǎn)。
實施例3
一種類海膽肽口服液及其制備方法,經(jīng)過下列工藝步驟:
(1)、海膽黃細(xì)胞RNA的提取
(1.1)、勻漿處理
稱取100mg海膽黃組織在液氮中磨碎,加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理;
(1.2)、靜置
將步驟(1.1)中得到的勻漿后的混合物在室溫控制為15℃條件下靜置5min,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離;
(1.3)、離心去雜質(zhì)
將步驟(1.2)中得到的靜置后的混合物于2℃條件下,10000g離心10min,收取上清液;
(1.4)、抽提
將步驟(1.3)中得到的上清液中加入其體積10%的氯仿,劇烈振蕩15s,室溫靜置2min;
(1.5)、離心
將步驟(1.4)中得到的室溫靜置后的混合物于2℃條件下,10000g離心10min;樣品分為三層:有機(jī)相、水相和中間層;
(1.6)、沉淀
將步驟(1.5)中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中,按體積比1:1的比例加入異丙醇,室溫靜置8min,于2℃條件下,10000g離心8min,管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀,移去上清液,即得RNA沉淀;
(1.7)、洗滌
向步驟(1.6)中得到的RNA沉淀中加入1ml、濃度為75%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌,再于2℃條件下,6000g離心5min,棄上清液,得洗滌后的RNA沉淀;
(1.8)、干燥
將步驟(1.7)中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥5min,然后加入25μl無RNase的水,用槍頭吸打混勻,于55℃條件下靜置10min,使RNA溶解,-70℃保存,備用;
(2)、反轉(zhuǎn)錄
將步驟(1.8)中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法,利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得海膽黃細(xì)胞的cDNA;
(3)、構(gòu)建表達(dá)載體
將步驟(2)中得到的海膽黃細(xì)胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,利用大量隨機(jī)引物:引物L(fēng)-隨機(jī)和R-隨機(jī) PCR擴(kuò)增25個循環(huán)后回收,酶切后,回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,得到含有表達(dá)載體pET32(a)-隨機(jī)的大腸桿菌,挑取菌落,接種入LB液體培養(yǎng)基,待菌液濃度為OD值接近1.0時,向其中加入菌液體積10%的甘油,-70℃保存,得到轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體的菌株;
(4)、蛋白表達(dá)
挑取步驟(3)中保存的菌株,接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)8h;將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)8h;將500ml菌液接種至50L發(fā)酵罐中,跟蹤菌體生長指標(biāo),待OD600≈0.4,向其中加入IPTG至終濃度為0.3mM,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h;開罐取菌液,12000g離心30s,用發(fā)酵液體積10%的、濃度為1%的SDS溶液進(jìn)行重懸,混勻,冰上超聲破碎;12000g離心30s,取上清液,即為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物;
(5)、酶切
將步驟(4)中的海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行充分酶切,得到類海膽酶切溶液;其中,所述的復(fù)合蛋白酶為木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶;木瓜蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的0.6%,菠蘿蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的0.4%;
(6)、超濾濃縮
將步驟(5)中得到的類海膽酶切溶液利用2000Kd的超濾管進(jìn)行超濾,收集濾過液,即得2000Kd以下的2~6個氨基酸大小的類海膽肽溶液;
(7)、調(diào)配
稱取步驟(6)中得到的類海膽肽溶液加入其質(zhì)量6%的枸杞提取液、1.5%的薄荷提取液、0.00015%的乳酸鏈球菌素混合均勻,得調(diào)配液;其中,枸杞提取液其是稱取枸杞采用去離子水沖洗后,按照料液比1: 40添加去離子水,浸泡3h,蒸煮30min,過濾,收集濾液后進(jìn)行抽濾,澄清透過液即得枸杞提取液;薄荷提取液其稱取薄荷采用去離子水沖洗后,按照料液比1: 40添加去離子水,浸泡3h,打漿,蒸煮30min,過濾,收集濾液后進(jìn)行抽濾,澄清透過液即為薄荷提取液;
(8)、滅菌
將步驟(7)中得到的調(diào)配液經(jīng)孔徑為0.5微米的精濾膜精濾后,進(jìn)行高溫瞬時滅菌,其滅菌溫度為140℃,滅菌時間為4s;
(9)、灌裝
將步驟(8)中得到的滅菌后的精濾液用灌裝機(jī)按每瓶120g進(jìn)行分瓶真空灌裝,其真空度為0.04Mpa,灌裝溫度控制在75℃,封口,獲得類海膽肽口服液。
本實施例得到隨機(jī)基因編碼的隨機(jī)蛋白的氨基酸組成與海膽黃細(xì)胞的氨基酸組成基本類似,營養(yǎng)價值高和抗氧化功效好。將類海膽肽與枸杞提取液和薄荷提取液進(jìn)行調(diào)配,得到類海膽肽口服液含有豐富的枸杞多糖、有機(jī)酸、苷類和黃酮類物質(zhì),其抗氧化活性高,口感淳厚,酸甜適中。該制備方法工藝合理,操作可行。