本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種類海膽肽口服液的制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，關(guān)于活性氧自由基（ROS）的研究日益增多。許多研究已經(jīng)證實：活性氧自由基與癌癥、肝病、老年癡呆癥、關(guān)節(jié)炎、糖尿病等疾病的產(chǎn)生有關(guān)。凡是能干擾自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中鏈引發(fā)和鏈增長過程，清除ROS的化合物統(tǒng)稱為抗氧化劑。抗氧化劑有內(nèi)源性和外源性兩大類。前者包括生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的抗氧化酶、尿酸、泛醌、谷胱甘肽等，后者包括一些合成或者天然的抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚、植物多酚等等。由于化學(xué)合成的酚類抗氧化劑的安全性受到質(zhì)疑，天然抗氧化劑已成為國內(nèi)外競相研究的熱點。
海膽之名始載于《本草原始》，是一種在世界各地食用廣泛的海洋水產(chǎn)。海膽的生殖腺是海膽黃，含有大量的蛋白質(zhì)，海膽黃中蛋白質(zhì)可占干重的44.5%，其營養(yǎng)價值類似于酪蛋白，含有17中氨基酸，不但具有很高的食用價值，還有極好的藥用功能，是制備抗氧化劑—活性肽的天然原料。同時，以海膽黃為原料制備海膽肽口服液的技術(shù)已有公開報道，例如，2015年9月2日公開的CN104872673A中國發(fā)明專利申請公開說明書中就公開這樣一種“海膽肽口服液及其制備方法”，其是將新鮮海膽剝開后，取出海膽黃與水混合磨漿，加入脂肪酶進(jìn)行酶解脫脂，超濾收集截留液，即為海膽黃粗蛋白溶液，將海膽黃粗蛋白溶液采用菠蘿蛋白酶和生姜蛋白酶階段性協(xié)同酶解，酶解液再經(jīng)過濾、超濾，調(diào)配和濃縮后得到海膽肽口服液。但是，海膽產(chǎn)量有限，并且海膽黃容易自溶，海膽捕撈出水后，放置半日至一日，就可能發(fā)軟變質(zhì)，失去原有的營養(yǎng)價值。因此，以海膽黃為原料制備活性肽及產(chǎn)品易受到捕撈季節(jié)、地理條件等影響，且生產(chǎn)成本高。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有以海膽黃為原料制備活性肽及產(chǎn)品易受到捕撈季節(jié)等影響及生產(chǎn)成本高的不足，本發(fā)明提供一種工藝合理、易于操作、原料來源不受限制、生產(chǎn)成本低的類海膽肽口服液的制備方法，該方法利用生物工程技術(shù)獲得大量2～6個氨基酸組成的小肽為主要成分的類海膽肽，可被人體不經(jīng)消化而直接吸收，制備的類海膽肽口服液營養(yǎng)價值、口感淳厚、酸甜適中。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種類海膽肽口服液及其制備方法，其特征在于：經(jīng)過下列工藝步驟：
（1）、海膽黃細(xì)胞RNA的提取
（1.1）、勻漿處理
稱取100～200mg海膽黃組織在液氮中磨碎，加入1～2ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理；
（1.2）、靜置
將步驟（1.1）中得到的勻漿后的混合物在室溫條件下靜置3～5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；
（1.3）、離心去雜質(zhì)
將步驟（1.2）中得到的靜置后的混合物于2～8℃條件下，10000g離心8～10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
將步驟（1.3）中得到的上清液中加入其體積10%～20%的氯仿，劇烈振蕩15～20s，室溫靜置2～3min；
（1.5）、離心
將步驟（1.4）中得到的室溫靜置后的混合物于2～8℃條件下，10000g離心10～15min；樣品分為三層：有機(jī)相、水相和中間層；
（1.6）、沉淀
將步驟（1.5）中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中，按體積比1:1～2的比例加入異丙醇，室溫靜置8～10min，于2～8℃條件下，10000g離心8～10min，管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗滌
向步驟（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1～1.5ml、濃度為75%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌，再于2～8℃條件下，6000～7500g離心3～5min，棄上清液，得洗滌后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
將步驟（1.7）中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥5～10min，然后加入25～200μl無RNase的水，用槍頭吸打混勻，于55～60℃條件下靜置8～10min，使RNA溶解，-70℃保存，備用；
（2）、反轉(zhuǎn)錄
將步驟（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得海膽黃細(xì)胞的cDNA；
（3）、構(gòu)建表達(dá)載體
將步驟（2）中得到的海膽黃細(xì)胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用大量隨機(jī)引物：引物L(fēng)-隨機(jī)和R-隨機(jī) PCR擴(kuò)增25個循環(huán)后回收，酶切后，回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到含有表達(dá)載體pET32(a)-隨機(jī)的大腸桿菌，挑取菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基，待菌液濃度為OD值接近1.0時，向其中加入菌液體積10%～15%的甘油，-70℃保存，得到轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體的菌株；
（4）、蛋白表達(dá)
挑取步驟（3）中保存的菌株，接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)8～12h；將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8～12h；將500ml菌液接種至50～80L發(fā)酵罐中，跟蹤菌體生長指標(biāo)，待OD600≈0.4～0.6，向其中加入IPTG至終濃度為0.3～0.4mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h；開罐取菌液，12000g離心30～60s，用發(fā)酵液體積10%～20%的、濃度為1%的SDS溶液進(jìn)行重懸，混勻，冰上超聲破碎；12000g離心30～60s，取上清液，即為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物；
（5）、酶切
將步驟（4）中的海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行充分酶切，得到類海膽酶切溶液；其中，所述的復(fù)合蛋白酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶中的兩種或多種；復(fù)合蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的1%～2.5%；
（6）、超濾濃縮
將步驟（5）中得到的類海膽酶切溶液利用2000Kd的超濾管進(jìn)行超濾，收集濾過液，即得2000Kd以下的2～6個氨基酸大小的類海膽肽溶液；
（7）、調(diào)配
稱取步驟（6）中得到的類海膽肽溶液加入其質(zhì)量6%～6.5%的枸杞提取液、1%～1.5%的薄荷提取液、0.00015～0.00018%的乳酸鏈球菌素混合均勻，得調(diào)配液；
（8）、滅菌
將步驟（7）中得到的調(diào)配液經(jīng)精濾膜精濾后，進(jìn)行高溫瞬時滅菌；
（9）、灌裝
將步驟（8）中得到的滅菌后的精濾液用灌裝機(jī)按預(yù)設(shè)重量進(jìn)行分瓶真空灌裝，封口，獲得類海膽肽口服液。
所述的枸杞提取液其是稱取枸杞采用去離子水沖洗后，按照料液比1:30～40添加去離子水，浸泡2～3h，蒸煮20～30min，過濾，收集濾液后進(jìn)行抽濾，澄清透過液即得枸杞提取液。
所述的薄荷提取液其稱取薄荷采用去離子水沖洗后，按照料液比1:30～40添加去離子水，浸泡2～3h，打漿，蒸煮20～30min，過濾，收集濾液后進(jìn)行抽濾，澄清透過液即得薄荷提取液。
所述的勻漿后的混合物靜置時的室溫控制為15～30℃。
所述的高溫瞬時滅菌的滅菌溫度為120～140℃，滅菌時間為4～6s。
所述的真空灌裝的真空度為0.04～0.05Mpa，灌裝溫度控制在60～75℃。
本發(fā)明先是選取海膽黃組織通過氯仿抽提方法，獲得海膽黃細(xì)胞RNA；再采用RT-PCR的方法，得到海膽黃細(xì)胞的cDNA，然后利用隨機(jī)引物進(jìn)行PCR，得到各種隨機(jī)的基因片段，然后將得到的基因片段克隆入原核表達(dá)載體，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到隨機(jī)基因編碼的隨機(jī)蛋白，這些蛋白有一個共同的特點，都是來源于海膽黃細(xì)胞的RNA，即均為海膽黃細(xì)胞中所含有蛋白或蛋白片段，氨基酸組成與海膽黃細(xì)胞的氨基酸組成基本類似，克服了生產(chǎn)原料受限的問題，所得到的蛋白用于后期的口服液加工使用，使得到的口服液產(chǎn)品具有海膽黃的氨基酸組成，不影響營養(yǎng)價值和功效，以達(dá)到提供與海膽黃多肽類似的抗氧化作用。本發(fā)明采用的是原核表達(dá)的方法，因原核表達(dá)技術(shù)成熟，價格低廉，易于操作，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明將枸杞提取液和薄荷提取液與類海膽肽溶液進(jìn)行調(diào)配，不添加任何化學(xué)物質(zhì)，使類海膽肽口服液口感淳厚，酸甜適中，鮮味十足。枸杞提取液和薄荷提取液中含有豐富的枸杞多糖、有機(jī)酸、苷類和黃酮類物質(zhì)，其抗氧化活性大大提高了海膽肽口服液的營養(yǎng)價值和保健功能。本發(fā)明的類海膽肽口服液的制備方法，其工藝合理，操作可行，易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例1
一種類海膽肽口服液及其制備方法，經(jīng)過下列工藝步驟：
（1）、海膽黃細(xì)胞RNA的提取
（1.1）、勻漿處理
稱取150mg海膽黃組織在液氮中磨碎，加入1.5ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理；
（1.2）、靜置
將步驟（1.1）中得到的勻漿后的混合物在室溫控制為20℃條件下靜置4min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；
（1.3）、離心去雜質(zhì)
將步驟（1.2）中得到的靜置后的混合物于5℃條件下，10000g離心9min，收取上清液；
（1.4）、抽提
將步驟（1.3）中得到的上清液中加入其體積16%的氯仿，劇烈振蕩18s，室溫靜置3min；
（1.5）、離心
將步驟（1.4）中得到的室溫靜置后的混合物于5℃條件下，10000g離心12min；樣品分為三層：有機(jī)相、水相和中間層；
（1.6）、沉淀
將步驟（1.5）中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中，按體積比1:1.6的比例加入異丙醇，室溫靜置9min，于5℃條件下，10000g離心9min，管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗滌
向步驟（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1.2ml、濃度為75%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌，再于5℃條件下，7000g離心4min，棄上清液，得洗滌后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
將步驟（1.7）中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥8min，然后加入100μl無RNase的水，用槍頭吸打混勻，于58℃條件下靜置9min，使RNA溶解，-70℃保存，備用；
（2）、反轉(zhuǎn)錄
將步驟（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得海膽黃細(xì)胞的cDNA；
（3）、構(gòu)建表達(dá)載體
將步驟（2）中得到的海膽黃細(xì)胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用大量隨機(jī)引物：引物L(fēng)-隨機(jī)和R-隨機(jī) PCR擴(kuò)增25個循環(huán)后回收，酶切后，回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到含有表達(dá)載體pET32(a)-隨機(jī)的大腸桿菌，挑取菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基，待菌液濃度為OD值接近1.0時，向其中加入菌液體積12%的甘油，-70℃保存，得到轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體的菌株；
（4）、蛋白表達(dá)
挑取步驟（3）中保存的菌株，接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)10h；將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)10h；將500ml菌液接種至65L發(fā)酵罐中，跟蹤菌體生長指標(biāo)，待OD600≈0.5，向其中加入IPTG至終濃度為0.35mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h；開罐取菌液，12000g離心45s，用發(fā)酵液體積15%的、濃度為1%的SDS溶液進(jìn)行重懸，混勻，冰上超聲破碎；12000g離心45s，取上清液，即為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物；
（5）、酶切
將步驟（4）中的海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行充分酶切，得到類海膽酶切溶液；其中，所述的復(fù)合蛋白酶為中性蛋白酶和胰蛋白酶，中性蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的1%，胰蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的1.2%；
（6）、超濾濃縮
將步驟（5）中得到的類海膽酶切溶液利用2000Kd的超濾管進(jìn)行超濾，收集濾過液，即得2000Kd以下的2～6個氨基酸大小的類海膽肽溶液；
（7）、調(diào)配
稱取步驟（6）中得到的類海膽肽溶液加入其質(zhì)量6.,2 %的枸杞提取液、1.2%的薄荷提取液、0.00016%的乳酸鏈球菌素混合均勻，得調(diào)配液；其中，枸杞提取液其是稱取枸杞采用去離子水沖洗后，按照料液比1:35添加去離子水，浸泡2.5h，蒸煮25min，過濾，收集濾液后進(jìn)行抽濾，澄清透過液即得枸杞提取液；薄荷提取液其稱取薄荷采用去離子水沖洗后，按照料液比1:32添加去離子水，浸泡3h，打漿，蒸煮25min，過濾，收集濾液后進(jìn)行抽濾，澄清透過液即為薄荷提取液；
（8）、滅菌
將步驟（7）中得到的調(diào)配液經(jīng)孔徑為0.5微米的精濾膜精濾后，進(jìn)行高溫瞬時滅菌，其滅菌溫度為130℃，滅菌時間為5s；
（9）、灌裝
將步驟（8）中得到的滅菌后的精濾液用灌裝機(jī)按每瓶100g進(jìn)行分瓶真空灌裝，其真空度為0.045Mpa，灌裝溫度控制在70℃，封口，獲得類海膽肽口服液。
本實施例得到隨機(jī)基因編碼的隨機(jī)蛋白的氨基酸組成與海膽黃細(xì)胞的氨基酸組成基本類似，克服了生產(chǎn)原料受限的問題，所得到的類海膽蛋白營養(yǎng)價值高和抗氧化功效好。其采用的原核表達(dá)方法技術(shù)成熟，價格低廉，易于操作，降低了生產(chǎn)成本。其將類海膽肽與枸杞提取液和薄荷提取液進(jìn)行調(diào)配，得到的口服液口感淳厚，酸甜適中。枸杞提取液和薄荷提取液中含有豐富的枸杞多糖、有機(jī)酸、苷類和黃酮類物質(zhì)，其抗氧化活性大大提高了海膽肽口服液的營養(yǎng)價值和保健功能。其制備方法工藝合理，操作可行，易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
實施例2
一種類海膽肽口服液及其制備方法，經(jīng)過下列工藝步驟：
（1）、海膽黃細(xì)胞RNA的提取
（1.1）、勻漿處理
稱取200mg海膽黃組織在液氮中磨碎，加入2ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理；
（1.2）、靜置
將步驟（1.1）中得到的勻漿后的混合物在室溫控制為30℃條件下靜置3min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；
（1.3）、離心去雜質(zhì)
將步驟（1.2）中得到的靜置后的混合物于8℃條件下，10000g離心8min，收取上清液；
（1.4）、抽提
將步驟（1.3）中得到的上清液中加入其體積20%的氯仿，劇烈振蕩20s，室溫靜置3min；
（1.5）、離心
將步驟（1.4）中得到的室溫靜置后的混合物于8℃條件下，10000g離心15min；樣品分為三層：有機(jī)相、水相和中間層；
（1.6）、沉淀
將步驟（1.5）中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中，按體積比1: 2的比例加入異丙醇，室溫靜置10min，于8℃條件下，10000g離心10min，管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗滌
向步驟（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1.5ml、濃度為75%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌，再于8℃條件下， 7500g離心3min，棄上清液，得洗滌后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
將步驟（1.7）中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥10min，然后加入200μl無RNase的水，用槍頭吸打混勻，于60℃條件下靜置8min，使RNA溶解，-70℃保存，備用；
（2）、反轉(zhuǎn)錄
將步驟（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得海膽黃細(xì)胞的cDNA；
（3）、構(gòu)建表達(dá)載體
將步驟（2）中得到的海膽黃細(xì)胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用大量隨機(jī)引物：引物L(fēng)-隨機(jī)和R-隨機(jī) PCR擴(kuò)增25個循環(huán)后回收，酶切后，回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到含有表達(dá)載體pET32(a)-隨機(jī)的大腸桿菌，挑取菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基，待菌液濃度為OD值接近1.0時，向其中加入菌液體積15%的甘油，-70℃保存，得到轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體的菌株；
（4）、蛋白表達(dá)
挑取步驟（3）中保存的菌株，接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12h；將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h；將500ml菌液接種至80L發(fā)酵罐中，跟蹤菌體生長指標(biāo)，待OD600≈0.6，向其中加入IPTG至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h；開罐取菌液，12000g離心60s，用發(fā)酵液體積120%的、濃度為1%的SDS溶液進(jìn)行重懸，混勻，冰上超聲破碎；12000g離心60s，取上清液，即為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物；
（5）、酶切
將步驟（4）中的海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行充分酶切，得到類海膽酶切溶液；其中，復(fù)合蛋白酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶；木瓜蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的0.5%，菠蘿蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的1%，胰蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的1%；
（6）、超濾濃縮
將步驟（5）中得到的類海膽酶切溶液利用2000Kd的超濾管進(jìn)行超濾，收集濾過液，即得2000Kd以下的2～6個氨基酸大小的類海膽肽溶液；
（7）、調(diào)配
稱取步驟（6）中得到的類海膽肽溶液加入其質(zhì)量6.5%的枸杞提取液、1%的薄荷提取液、0.00018%的乳酸鏈球菌素混合均勻，得調(diào)配液；其中，枸杞提取液其是稱取枸杞采用去離子水沖洗后，按照料液比1:30添加去離子水，浸泡2h，蒸煮20min，過濾，收集濾液后進(jìn)行抽濾，澄清透過液即得枸杞提取液；薄荷提取液其稱取薄荷采用去離子水沖洗后，按照料液比1:30添加去離子水，浸泡2h，打漿，蒸煮20min，過濾，收集濾液后進(jìn)行抽濾，澄清透過液即為薄荷提取液；
（8）、滅菌
將步驟（7）中得到的調(diào)配液經(jīng)孔徑為0.5微米的精濾膜精濾后，進(jìn)行高溫瞬時滅菌，其滅菌溫度為120℃，滅菌時間為6s；
（9）、灌裝
將步驟（8）中得到的滅菌后的精濾液用灌裝機(jī)按每瓶80g進(jìn)行分瓶真空灌裝，其真空度為0.05Mpa，灌裝溫度控制在60℃，封口，獲得類海膽肽口服液。
本實施例得到隨機(jī)基因編碼的隨機(jī)蛋白的氨基酸組成與海膽黃細(xì)胞的氨基酸組成基本類似，克服了生產(chǎn)原料受限的問題。其采用的原核表達(dá)方法技術(shù)成熟，易于操作，生產(chǎn)成本低。本實施例將類海膽肽與枸杞提取液和薄荷提取液進(jìn)行調(diào)配，得到類海膽肽口服液口感淳厚，酸甜適中。其制備方法工藝合理，操作可行，易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
實施例3
一種類海膽肽口服液及其制備方法，經(jīng)過下列工藝步驟：
（1）、海膽黃細(xì)胞RNA的提取
（1.1）、勻漿處理
稱取100mg海膽黃組織在液氮中磨碎，加入1ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理；
（1.2）、靜置
將步驟（1.1）中得到的勻漿后的混合物在室溫控制為15℃條件下靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；
（1.3）、離心去雜質(zhì)
將步驟（1.2）中得到的靜置后的混合物于2℃條件下，10000g離心10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
將步驟（1.3）中得到的上清液中加入其體積10%的氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2min；
（1.5）、離心
將步驟（1.4）中得到的室溫靜置后的混合物于2℃條件下，10000g離心10min；樣品分為三層：有機(jī)相、水相和中間層；
（1.6）、沉淀
將步驟（1.5）中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中，按體積比1:1的比例加入異丙醇，室溫靜置8min，于2℃條件下，10000g離心8min，管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗滌
向步驟（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1ml、濃度為75%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌，再于2℃條件下，6000g離心5min，棄上清液，得洗滌后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
將步驟（1.7）中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥5min，然后加入25μl無RNase的水，用槍頭吸打混勻，于55℃條件下靜置10min，使RNA溶解，-70℃保存，備用；
（2）、反轉(zhuǎn)錄
將步驟（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得海膽黃細(xì)胞的cDNA；
（3）、構(gòu)建表達(dá)載體
將步驟（2）中得到的海膽黃細(xì)胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用大量隨機(jī)引物：引物L(fēng)-隨機(jī)和R-隨機(jī) PCR擴(kuò)增25個循環(huán)后回收，酶切后，回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到含有表達(dá)載體pET32(a)-隨機(jī)的大腸桿菌，挑取菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基，待菌液濃度為OD值接近1.0時，向其中加入菌液體積10%的甘油，-70℃保存，得到轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體的菌株；
（4）、蛋白表達(dá)
挑取步驟（3）中保存的菌株，接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)8h；將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8h；將500ml菌液接種至50L發(fā)酵罐中，跟蹤菌體生長指標(biāo)，待OD600≈0.4，向其中加入IPTG至終濃度為0.3mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h；開罐取菌液，12000g離心30s，用發(fā)酵液體積10%的、濃度為1%的SDS溶液進(jìn)行重懸，混勻，冰上超聲破碎；12000g離心30s，取上清液，即為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物；
（5）、酶切
將步驟（4）中的海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行充分酶切，得到類海膽酶切溶液；其中，所述的復(fù)合蛋白酶為木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶；木瓜蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的0.6%，菠蘿蛋白酶使用量為海膽黃RNA隨機(jī)原核表達(dá)粗產(chǎn)物質(zhì)量的0.4%；
（6）、超濾濃縮
將步驟（5）中得到的類海膽酶切溶液利用2000Kd的超濾管進(jìn)行超濾，收集濾過液，即得2000Kd以下的2～6個氨基酸大小的類海膽肽溶液；
（7）、調(diào)配
稱取步驟（6）中得到的類海膽肽溶液加入其質(zhì)量6%的枸杞提取液、1.5%的薄荷提取液、0.00015%的乳酸鏈球菌素混合均勻，得調(diào)配液；其中，枸杞提取液其是稱取枸杞采用去離子水沖洗后，按照料液比1: 40添加去離子水，浸泡3h，蒸煮30min，過濾，收集濾液后進(jìn)行抽濾，澄清透過液即得枸杞提取液；薄荷提取液其稱取薄荷采用去離子水沖洗后，按照料液比1: 40添加去離子水，浸泡3h，打漿，蒸煮30min，過濾，收集濾液后進(jìn)行抽濾，澄清透過液即為薄荷提取液；
（8）、滅菌
將步驟（7）中得到的調(diào)配液經(jīng)孔徑為0.5微米的精濾膜精濾后，進(jìn)行高溫瞬時滅菌，其滅菌溫度為140℃，滅菌時間為4s；
（9）、灌裝
將步驟（8）中得到的滅菌后的精濾液用灌裝機(jī)按每瓶120g進(jìn)行分瓶真空灌裝，其真空度為0.04Mpa，灌裝溫度控制在75℃，封口，獲得類海膽肽口服液。
本實施例得到隨機(jī)基因編碼的隨機(jī)蛋白的氨基酸組成與海膽黃細(xì)胞的氨基酸組成基本類似，營養(yǎng)價值高和抗氧化功效好。將類海膽肽與枸杞提取液和薄荷提取液進(jìn)行調(diào)配，得到類海膽肽口服液含有豐富的枸杞多糖、有機(jī)酸、苷類和黃酮類物質(zhì)，其抗氧化活性高，口感淳厚，酸甜適中。該制備方法工藝合理，操作可行。