本發(fā)明涉及了一種絲素親和肽的篩選方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

我國(guó)是絲綢文明及絲綢文化的發(fā)源地，現(xiàn)今也是世界上生產(chǎn)和出口絲綢最多的國(guó)家，在我國(guó)的世界貿(mào)易總額中占有重要的分量。絲綢的主要成分是絲素纖維蛋白，約占蠶繭總質(zhì)量的70﹪—80﹪，由丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、絲氨酸等18種氨基酸通過(guò)多羧氨鍵連接形成。絲素纖維蛋白除在紡織工業(yè)中有其重要的應(yīng)用外，在其它領(lǐng)域如食品、化工、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域也有著重要的用途。由于絲素蛋白具有生物降解性、生物相容性、生物可降解性和可加工性等優(yōu)良性能，可制備成多種形態(tài)的材料，如多孔狀、膜狀、纖維狀和管狀等，在科學(xué)研究中受到廣泛的關(guān)注和研究。

隨著對(duì)絲素材料功能化研究不斷的深入，開(kāi)發(fā)能夠特異性結(jié)合絲素材料的試劑，用于對(duì)絲素材料的鑒別、結(jié)合、定量分析勢(shì)在必行。申請(qǐng)?zhí)枮?1100056.2的專利，公開(kāi)了一種用絲素蛋白修飾聚羥基酯材料的方法，用于絲素蛋白與其它材料的結(jié)合研究：具體方法是通過(guò)水溶性碳二亞胺(WSC)作為橋梁，將聚羥基酯材料與絲素蛋白進(jìn)行固定，實(shí)現(xiàn)絲素蛋白對(duì)聚羥基酯材料的化學(xué)結(jié)合。然而，該方法主要是一種化學(xué)偶聯(lián)的方法，操作過(guò)程中具有很強(qiáng)的毒性，存在化學(xué)試劑殘留的缺點(diǎn)，還存在非特異性識(shí)別的問(wèn)題(即，對(duì)所有蛋白都能交聯(lián))。時(shí)至今日，還沒(méi)有一種環(huán)保、方便、快捷的方法能夠?qū)Ｒ蛔R(shí)別并結(jié)合絲素材料的方法出現(xiàn)。

噬菌體展示是將遍碼外源多肽的DNA序列通過(guò)基因工程技術(shù)插入到噬菌體基因的適當(dāng)位置，使之穩(wěn)定地在噬菌體外殼蛋白中表達(dá)外源多肽的技術(shù)。噬菌體是一種生物納米纖維病毒，對(duì)人與動(dòng)物無(wú)害，能特異性侵染含F(xiàn)因子的大腸桿菌。噬菌體展示技術(shù)最大的特點(diǎn)是直接將蛋白表型和對(duì)應(yīng)基因型聯(lián)系了起來(lái)，展示后的多肽能在相對(duì)獨(dú)立的空間保持較好的生物活性。隨著噬菌體展示技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究人員構(gòu)建了大容量的噬菌體展示多肽庫(kù)，在噬菌體外殼蛋白中展示約含1×10¹²種不同序列的多肽片段。通過(guò)對(duì)目標(biāo)物的篩選，就能得到與目標(biāo)物特異性結(jié)合的多肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)傳統(tǒng)方法中存在的不足，本發(fā)明提出了一種絲素親和肽的篩選方法，以絲素材料為目標(biāo)物，利用商業(yè)化的M13-12噬菌體隨機(jī)展示文庫(kù)對(duì)其進(jìn)行親和篩選，篩選出與絲素材料高親和性的多肽序列，具有安全、實(shí)用、方便和高效的優(yōu)勢(shì)。

因此可以用絲素材料對(duì)噬菌體展示文庫(kù)進(jìn)行親和篩選，得到與絲素材料特異性結(jié)合的多肽，用于科學(xué)研究中絲素材料的鑒別、結(jié)合及分析，賦予絲素材料更多的功能。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是篩選過(guò)程中，通過(guò)洗滌去除非特異性結(jié)合絲素材料的噬菌體，通過(guò)洗脫將特異性結(jié)合絲素材料的噬菌體分離，然后對(duì)與絲素材料特異性結(jié)合的噬菌體基因測(cè)序，獲得噬菌體外殼蛋白展示的多肽序列。

具體包括以下步驟：

1)制備絲素膜材料；

2)利用絲素膜材料對(duì)各種噬菌體進(jìn)行篩選，獲得能夠與絲素膜特異性結(jié)合的噬菌體；

3)將步驟(2)中與絲素材料特異性結(jié)合的噬菌體進(jìn)行基因測(cè)序，獲得相應(yīng)的基因序列，進(jìn)而可推到出其氨基酸序列。

所述步驟1)中的絲素膜材料采用以下方式進(jìn)行制備：先將蠶絲蛋白粉末溶于有機(jī)溶劑或者水中形成蠶絲蛋白溶液，將蠶絲蛋白溶液滴在聚乙烯板上風(fēng)干，加酒精處理使蠶絲蛋白固化，得到不溶解于水的絲素膜。

所述步驟2)具體為：

a.封閉絲素材料：將家蠶絲素膜材料加入含有TBS和BSA的緩沖液，TBS和BSA各自的濃度可在0.1-10mg/ml的范圍內(nèi)變動(dòng)；

b.絲素材料對(duì)噬菌體庫(kù)的篩選：將噬菌體肽加入到絲素膜的緩沖液中，常溫?fù)u床中以160rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u振0.5-8h；

c.洗滌：用洗滌液將絲素膜洗滌1-10遍；

d.洗脫：將洗滌液除去，加入洗脫液常溫孵育1-20分鐘，將與絲素材料特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)；

e.中和：加入中和液，使得洗脫后的噬菌體液與中和液混勻后呈中性；

f.噬菌體擴(kuò)增：將中和后的噬菌體液轉(zhuǎn)入到ER2738菌中，在37℃溫度的搖床中以150-220rpm轉(zhuǎn)速搖振3-24h，得到噬菌體和ER2738菌混合液；

g.噬菌體純化：將噬菌體和ER2738菌混合液進(jìn)行離心，再加入到PEG和NaCl的混合液中進(jìn)行純化，得到親和絲素材料的噬菌體菌液；

i.上述步驟a～g過(guò)程為一次循環(huán)，將步驟a～g經(jīng)過(guò)2-6次重復(fù)循環(huán)之后，得到與絲素材料特異性結(jié)合的噬菌體液。

本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步采用以下方式處理，來(lái)驗(yàn)證步驟(2)中與絲素材料特異性結(jié)合的噬菌體的親和性：將篩選后的與絲素材料特異性結(jié)合的噬菌體進(jìn)行涂板，具體是將噬菌體再次侵染ER2738菌，并均勻涂布在含有Xgal/IPTG的固體LB板上，如次日LB板上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則表明噬菌體具有高親和性。從而說(shuō)明并不是由于噬菌體自身出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，而是通過(guò)篩選與絲素材料特異性結(jié)合后出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。

所述絲素膜材料替換為但不限于絲素膜、絲素多孔支架、絲素粉末、絲素納米纖維、絲素微/納球、絲素水凝膠、絲織物等絲素材料。

所述步驟2)中的洗滌包括用TBST洗滌，還可選用磷酸鹽緩沖液(PBS)、模擬體液(SBF)、生理鹽水、Tris-HCl緩沖液等非烈性緩沖液，洗滌次數(shù)為1-10遍，優(yōu)選次數(shù)為3-7遍。

所述步驟2)中的洗脫包括用Gly-HCl洗脫液，還可選用酸性、堿性或者烈性洗脫液。

所述步驟2)中的中和液采用Tris-HCl中和液。

由此本發(fā)明獲得了包含活性成分的絲素親和肽，所述小肽是通過(guò)噬菌體展示技術(shù)得到。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出特點(diǎn)：

(1)安全：比起傳統(tǒng)的化學(xué)耦聯(lián)，采用噬菌體篩選出的多肽的更加溫和、不存在化學(xué)試劑殘留的缺點(diǎn)；

(2)高效：具有與絲素材料結(jié)合的專一性，而不結(jié)合其它蛋白；

(3)方便：有效成分單一(短肽)，與絲素材料結(jié)合的時(shí)候不存在復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程。同時(shí)通過(guò)洗脫試劑能夠達(dá)到絲素親和肽與絲素材料之間的解脫，突破了其它連接方式連接方式不可逆的問(wèn)題；

(4)實(shí)用：所篩選出是絲素親和肽能夠用于對(duì)所有類型的絲素材料進(jìn)行特異性結(jié)合、鑒定及分析。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1絲素膜材料對(duì)噬菌體庫(kù)經(jīng)過(guò)4輪篩選后噬菌體的數(shù)量柱狀圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。

本發(fā)明的實(shí)施例如下：

實(shí)施例1：

1)制備絲素膜：

a.獲取蠶絲蛋白水溶液，濃度為0.5mg/mL；

b.將蠶絲蛋白溶液滴在聚乙烯板中風(fēng)干，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90％的甲醇水溶液處理使其固化，得到不溶解于水的家蠶絲素膜。

2)篩選與絲素蛋白結(jié)合的多肽序列

a.封閉絲素材料：家蠶絲素膜中加入TBS+BSA(0.1mg/ml)的緩沖液；

b.絲素材料對(duì)噬菌體庫(kù)的篩選：這對(duì)每一噬菌體種類，將商業(yè)化的M13-12噬菌體隨機(jī)展示文庫(kù)10微升加入到絲素膜中，常溫?fù)u床中160rpm搖0.5h；

c.洗滌：用TBST洗滌液將絲素膜洗滌1遍；

d.洗脫：將聚乙烯板孔板中的TBST洗滌液盡量除去，加入Gly-HCl洗脫液(加入了BSA)，常溫孵育1分鐘，將與絲素材料特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)。

e.中和：加入Tris-HCl中和液，混勻后為中性；

f.噬菌體擴(kuò)增：將噬菌體洗脫液轉(zhuǎn)入到已過(guò)夜搖的ER2738菌中(OD600約為0.5)，37℃搖床中搖150rpm，3h，得到的噬菌體/ER2738菌的混合液。

g.噬菌體純化：將上述得到的噬菌體/ER2738菌混合液離心，再加入到PEG/NaCl混合液中進(jìn)行純化，PEG和NaCl混合液中各自的濃度是20g/L和40g/L，得到噬菌體液。

h：上述過(guò)程為1個(gè)循環(huán)，重復(fù)步驟a～g經(jīng)過(guò)4輪循環(huán)之后，得到富集的絲素親和噬菌體溶液。

3)驗(yàn)證所篩選的噬菌體與絲素材料的親和性：將篩選后的噬菌體進(jìn)行涂板：將噬菌體再次侵染ER2738菌，并均勻涂布在含有Xgal/IPTG的固體LB板上，如次日LB板上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則表明噬菌體具有親和性。并進(jìn)行計(jì)數(shù)，四輪的計(jì)數(shù)分別如圖1所示，其中，最高的一組噬菌體擴(kuò)增前數(shù)目能夠達(dá)到4.9×10⁶個(gè)，表明獲得的噬菌體與絲素膜材料具有很高的親和性。

4)基因測(cè)序獲得絲素親和肽；對(duì)篩選的得噬菌體進(jìn)行基因測(cè)序，獲得基因序列，進(jìn)而推到出親和噬菌體外殼蛋白展示的多肽序列，實(shí)施例獲得的基因序列有上百種，因此獲得多肽序列也有上百種。

實(shí)施例2：

1)制備絲素膜：

a.獲取蠶絲蛋白水溶液；

b.將蠶絲蛋白溶液滴在聚乙烯板中風(fēng)干，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％的酒精處理使其固化，得到不溶解于水的絲素膜。

2)篩選與絲素膜的多肽序列

a.封閉絲素材料：家蠶絲素膜中加入TBS+BSA(10mg/ml)的緩沖液；

b.絲素材料對(duì)噬菌體庫(kù)的篩選：將培養(yǎng)皿中的噬菌體加入到絲素膜中，常溫?fù)u床中160rpm搖8h；

c.洗滌：用TBST洗滌液將絲素膜洗滌10遍；

d.洗脫：將聚乙烯板孔板中的TBST洗滌液盡量除去，加入Gly-HCl洗脫液(加入了BSA)，常溫孵育20分鐘，將與絲素材料特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)。

e.中和：加入Tris-HCl中和液，混勻后中性；

f.噬菌體擴(kuò)增：將噬菌體洗脫液轉(zhuǎn)入到已過(guò)夜搖的ER2738菌中，37℃搖床中搖220rpm，24h，得到的噬菌體/ER2738菌的混合液。

g.噬菌體純化：將上述得到的噬菌體/ER2738菌混合液離心，再加入到PEG/NaCl混合液中進(jìn)行純化，PEG和NaCl混合液中各自的濃度是20g/L和40g/L，得到噬菌體液。

h：上述過(guò)程為1個(gè)循環(huán)，重復(fù)步驟a～g經(jīng)過(guò)6輪循環(huán)之后，得到富集的絲素親和噬菌體液。

3)驗(yàn)證所篩選的噬菌體與絲素材料的親和性：將篩選后的噬菌體進(jìn)行涂板：將噬菌體再次侵染ER2738菌，并均勻涂布在含有Xgal/IPTG的固體LB板上，如次日LB板上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則表明噬菌體具有親和性。

4)基因測(cè)序獲得絲素親和肽：對(duì)篩選的得噬菌體進(jìn)行基因測(cè)序，獲得基因序列，進(jìn)而推到出親和噬菌體外殼蛋白展示的多肽序列。

實(shí)施例3：

1)制備絲素納米纖維：

a.將絲素蛋白溶解在六氟異丙醇溶液中；

b.通過(guò)靜電紡絲儀器制備得到納米級(jí)的絲素納米纖維。

2)篩選與絲素納米纖維的多肽序列

a.封閉絲素納米纖維：家蠶絲素膜中加入TBS+BSA(5mg/ml)的緩沖液；

b.絲素材料對(duì)噬菌體庫(kù)的篩選：將培養(yǎng)皿中的噬菌體加入到絲素納米纖維中，常溫?fù)u床中160rpm搖4h；

c.洗滌：用TBST洗滌液將絲素納米纖維洗滌5遍；

d.洗脫：將孔板中的TBST洗滌液盡量除去，加入Gly-HCl洗脫液(加入了BSA)，常溫孵育10分鐘，將與絲素納米纖維特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)。

e.中和：加入Tris-HCl中和液，混勻后中性；

f.噬菌體擴(kuò)增：將噬菌體洗脫液轉(zhuǎn)入到已過(guò)夜搖的ER2738菌中，37℃搖床中搖220rpm，12h，得到的噬菌體/ER2738菌的混合液。

g.噬菌體純化：將上述得到的噬菌體/ER2738菌混合液離心，再加入到PEG/NaCl混合液中進(jìn)行純化，得到噬菌體液。

h：上述過(guò)程為1個(gè)循環(huán)，重復(fù)步驟a～g經(jīng)過(guò)3輪循環(huán)之后，得到富集的絲素親和噬菌體液體

3)驗(yàn)證所篩選的噬菌與絲素納米纖維的親和性：將篩選后的噬菌體進(jìn)行涂板：將噬菌體再次侵染ER2738菌，并均勻涂布在含有Xgal/IPTG的固體LB板上，如次日LB板上出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則表明噬菌體具有親和性。并進(jìn)行計(jì)數(shù)，經(jīng)過(guò)第3輪篩選，最高的一組噬菌體擴(kuò)增前數(shù)目能夠達(dá)到3.5×10⁵個(gè)，表明獲得的噬菌體與絲素納米纖維具有很高的親和性。

4)基因測(cè)序獲得絲素親和肽：對(duì)篩選的得噬菌體進(jìn)行基因測(cè)序，獲得基因序列，進(jìn)而推到出親和噬菌體外殼蛋白展示的多肽序列。

由上述實(shí)施例可見(jiàn)，本發(fā)明所篩選的噬菌體對(duì)絲素材料具有很高的親和性，為絲素材料的鑒定與分析提高更多的選擇，應(yīng)用前景廣闊。