專利名稱：單管內(nèi)雜交誘捕為基礎(chǔ)的核酸檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文涉及一種核酸提取及檢測方法2、技術(shù)背景核酸的提取是進行許多核酸操作分析的基礎(chǔ)。目前核酸提取方法很多，如SDS法，CTAB法、離心柱法等，這些方法各有優(yōu)缺點。這些核酸粗提物中往往含有大量的蛋白質(zhì)、多糖、單寧和色素等，這些雜質(zhì)有時很難從核酸中去除。大多數(shù)蛋白質(zhì)可以通過氯仿或苯酚處理后變性，沉淀去除。在DNA提取中的RNA可以利用Rnase去除，但多糖、單寧等物質(zhì)很難去除。這些雜質(zhì)濃度高時，常常使核酸提取物呈膠狀，更重要的是即使在很低濃度下他們也會干擾后續(xù)操作，如抑制PCR中DNA聚合酶的活性，抑制某些核酸修飾酶包括限制性內(nèi)切酶的活性，阻礙Southern雜交或基因克隆，同時多糖雜質(zhì)還會影響分光光度計對核酸濃度的測量。
核酸提取的目的是對某一段核酸進行操作，而我們提取的核酸往往是基因組核酸，基因組核酸中絕大部分不是我們需要的，它在核酸操作中起干擾作用。如在PCR操作中容易出現(xiàn)非特異性擴增等。誘捕法提取核酸可以去除非目標核酸，但用于誘捕的探針多非共價的固定在雜交膜上，誘捕后直接進行雜交，難以將誘捕到的核酸作為模板進行PCR擴增。而且這種雜交很容易造成核酸污染。靈敏度遠遠低于以誘捕到的核酸作模板擴增檢測后檢測的靈敏度。目前對核酸的操作中是將純化的核酸轉(zhuǎn)移到別的管中，而本發(fā)明雜交誘捕法將雜交誘捕與后續(xù)操作結(jié)合在一起，如在雜交、PCR、實時熒光PCR等全在同一管內(nèi)操作，減少了核酸污染的可能。直接利用標記的雜交探針對雜交誘捕到的核酸進行雜交檢測，檢測速度快、結(jié)果準確。
將雜交誘捕后的核酸作為模板進行PCR，PCR引物設(shè)計中以誘捕用寡核苷酸作為反向引物，在PCR擴增中，該誘捕鏈也參與擴增，在Taq酶的作用下，PCR產(chǎn)物沿著該誘捕鏈方向延伸，形成一條固定在管壁上的雙鏈。將雙鏈變性后用標記的探針與固定在管壁上的單鏈雜交，再用堿性磷酸酶進行ELISA反應(yīng)檢測。同時對液相產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。該方法將PCR與ELISA有機結(jié)合起來，利用了PCR的高效性與ELISA的高特異性。通過雙重檢測PCR產(chǎn)物，PCR-ELISA的結(jié)果判定是通過酶標儀數(shù)字輸出。結(jié)果準確可靠，無人為因素。在核酸誘捕后，也可以利用實時熒光PCR對誘捕到的核酸直接進行檢測，快速靈敏準確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將核酸提取與雜交、PCR、實時熒光PCR結(jié)合起來，建立了一種在同一PCR管內(nèi)快速準確靈敏的核酸檢測方法。
(1)技術(shù)方案為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明分為以下幾個步驟誘捕PCR管的制備向PCR管中加入新配置包被液，一定溫度下溫育，洗液洗后、干燥后保存。包被液中含有寡核苷酸、甲基咪唑及EDC。包被液中寡核苷酸的濃度為10-1000nM，10mM EDC的濃度為5-20mM，甲基咪唑濃度為10mM。溫育的溫度為40-60℃，溫育時間為(4-24h)。
核酸的雜交誘捕適量樣品中加入DNA抽提液，抽提蛋白后將抽提液加入到包被好的PCR管中，高溫下使核酸變性，一定溫度下誘捕。DNA抽提液可以為SDS法或CTAB法的抽提液，優(yōu)化過的誘捕溫度為40-60℃。如果對誘捕鏈直接進行雜交檢測，誘捕的同時在誘捕液中加入標記探針。
PCR擴增雜交誘捕到的核酸作為PCR擴增的模板，擴增條件因核酸序列不同而有差異。若要進行固相產(chǎn)物的雜交檢測，加入到擴增體系中的固相引物濃度低于液相引物的濃度。固相引物為與包被在誘捕PCR管上序列相同的序列，液相引物為另一條引物。若要進行實時熒光PCR，在反應(yīng)體系中加入標記探針。
液相產(chǎn)物的凝膠電泳檢測取液相產(chǎn)物8ul，80V電壓2％瓊脂糖凝膠電泳40min，EB染色30min，凝膠成像儀觀察結(jié)果。
(2)技術(shù)效果采用本方法對核酸進行檢測，從核酸提取到檢測全部在一個PCR管中進行。減少了檢測步驟，提高了檢測速度，降低了核酸污染的可能性，而且結(jié)果準確可靠。
(3)實施例實施例1誘捕到的核酸的雜交檢測1.誘捕PCR管的制備
(1)每PCR孔加新配置包被液100ul，50℃溫育5h(4-24h)。
(2)棄包被液，洗液洗3次，浸5min，再洗3次。
(3)無菌雙蒸水水洗3次，浸5min，再洗3次。
(4)室溫干燥，4℃或更低溫度保存。
包被液100nM 5′氨基化引物，10mM EDC，10mM甲基咪唑(1-Melm)(pH7.0)。EDC(Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide碳二亞氨)洗液100mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，0.1％Tween-20。
2、核酸的雜交誘捕(1)取適量樣品加入5倍體積的DNA抽提液，研磨，95℃水浴5min，加入等體積的酚/氯仿/異物醇抽提一次。
(2)抽提上清夜100ul，加入10ul 10nM的DIG標記探針，加入包被好的誘捕PCR管中，95℃溫育2min，置于冰上1min，45℃溫育10-60min。
3.雜交鏈的檢測(1)棄誘捕液，0.5×SSC，0.1％Tween-20，洗4次，每次浸3min。
(2)加100ul DIG-AP(1∶2500，溶于含0.5％BR洗液)。
(6)50℃密封1h，棄液體，洗液洗4次，每次浸3min。
(7)加100ul顯色液，室溫顯色30-60min。
(8)酶標儀405nm讀數(shù)，讀數(shù)減去空白，高于1.0為陽性，低于0.2為陰性。
顯色液0.1％PNPP，1M二乙醇胺(PH 9.8)，1mM MgCl2實施例2雜交誘捕PCR-ELISA檢測1、誘捕PCR管的制備(步驟同上)2、核酸的雜交誘捕(1)取適量樣品加入5倍體積的DNA抽提液，研磨，95℃水浴5min，加入等體積的酚/氯仿/異物醇抽提一次。
(2)抽提上清夜100ul，加入包被好的誘捕PCR管中，95℃溫育2min，置于冰上1min，45℃溫育10-60min。
(3)洗液洗3次，完成核酸的誘捕。
DNA抽提液0.8M NaCL，100mM Tris-HCL(PH8.0)，20mM EDTA，1％SDS3.PCR擴增擴增條件因序列不同而有差異，為使液相產(chǎn)物和固相產(chǎn)物相平衡，液相引物與固相引物的濃度比為8∶1，固相引物為與包被在誘捕PCR管上序列相同的引物，液相引物為另一條引物4.液相產(chǎn)物的凝膠電泳檢測取液相產(chǎn)物8ul，80V電壓2％瓊脂糖凝膠電泳40min，EB染色30min，凝膠成像儀觀察結(jié)果。
5.固相產(chǎn)物的雜交檢測(1)棄液相產(chǎn)物，新配變性液洗4次，每次浸3min。
(2)洗液洗4次，每次浸3min。
(3)加100ul雜交液，50℃密封溫育1h。
(4)棄雜交液，0.5×SSC，0.1％Tween-20，洗4次，每次浸3min。
(5)加100ulDIG-AP(1∶2500，溶于含0.5％BR洗液)。
(6)50℃密封1h，棄液體，洗液洗4次，每次浸3min。
(7)加100ul顯色液，室溫顯色30-60min。
(8)酶標儀405m讀數(shù)，讀數(shù)減去空白，高于1.0為陽性，低于0.2為陰性。
變性液0.2M NaOH，0.1％Tween-20雜交液50nM DIG-probe，5×SSC，0.1％Tween-20，0.5％BR顯色液0.1％PNPP，1M二乙醇胺(PH9.8)，1mM MgCl2實施例3雜交誘捕實時熒光檢測1.誘捕PCR管的制備他(步驟同上)。
2、核酸的雜交誘捕(步驟同上)。
3、實時熒光PCR在誘捕有核酸的PCR管內(nèi)作實時熒光PCR，反應(yīng)體系10×PCR緩沖液2.5μl，25mmol/LMgCl2 5μl，10mMdATP、dUTP、dGTP、dCTP各0.5μl，20μmol/L引物各0.5μl，20μlmol/L探針1μl，1U/μl UNG酶0.15μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，模板DNA 1μl，加滅菌雙蒸水使總體積為25μl。將加有PCR反應(yīng)液的PCR管放入ABIPRISM7700 96孔反應(yīng)板上，打開Sequence Detection 1.71，設(shè)置PCR反應(yīng)條件，第一個循環(huán)為50℃，2min，95℃，10min；后40個循環(huán)為94℃，15S；68℃，1min。點擊運行，進行PCR反應(yīng)，1小時56分鐘反應(yīng)結(jié)束，保存文件，打開分析軟件，儀器自動分析試驗結(jié)果。給出ΔRn(第n循環(huán)時的熒光信號增加值)與循環(huán)數(shù)圖象。
權(quán)利要求
1.一種核酸提取方法，其特征在于利用雜交誘捕方法進行核酸提取，提取的核酸通過雜交共價結(jié)合在PCR管壁上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸提取方法，雜交誘捕的同時，利用標記探針在同一管中與目標核酸雜交，對誘捕到的核酸進行檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸提取方法，利用結(jié)合在PCR管壁上的誘捕鏈對核酸粗體液中的目標核酸進行誘捕。
4.根據(jù)權(quán)利要求3，利用共價結(jié)合在PCR管壁上的誘捕鏈對核酸粗體液中的核酸進行誘捕。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4，誘捕鏈的類型為寡核苷酸DNA、RNA、肽核酸或DNA與肽核酸復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4，誘捕鏈的5′端或3′端進行磷酸化或氨基化。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4，結(jié)合在PCR管壁上的誘捕鏈與管壁之間有一個臂，臂可以是核苷酸或有機大分子物質(zhì)。
8.一種核酸擴增方法，其特征在于在雜交誘捕管中以誘捕到的核酸為模板作PCR擴增，在雜交誘捕管中，加入PCR緩沖液，正反向引物、dNTP、Taq酶等進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物分為兩部分，一部分為以誘捕鏈為一條引物擴增的產(chǎn)物，其固定在PCR管壁上，稱之為固相產(chǎn)物。以液體中的兩條引物擴增的產(chǎn)物為液相產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8，在雜交誘捕管中，以誘捕到的RNA為模板作反轉(zhuǎn)錄PCR。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9，PCR擴增后，在PCR管內(nèi)利用標記探針對固相產(chǎn)物進行雜交檢測。
11.根據(jù)權(quán)利要求8或9，雜交誘捕后在該管內(nèi)以誘捕到的DNA為模板作實時熒光PCR。
全文摘要
利用共價結(jié)合在PCR管壁上的誘捕鏈定向誘捕核酸粗體液中的目的片段，目的片段通過雜交結(jié)合在PCR管的內(nèi)壁上，洗掉雜質(zhì)，可以利用標記探針直接雜交檢測誘捕到的核酸，也可以在該管內(nèi)以誘捕到的核酸為模板作PCR，并對固相PCR產(chǎn)物進行雜交檢測，或直接在該管中作實時熒光PCR。
文檔編號C12P19/34GK1521269SQ03102460
公開日2004年8月18日 申請日期2003年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月28日
發(fā)明者朱水芳, 趙文軍, 黃文勝, 陳紅運 申請人:國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局動植物檢疫實驗所, 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局動植物檢疫