本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種菰cDNA文庫的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

隨著分子生物學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，挖掘、克隆新基因、研究新基因的功能已成為功能基因組研究中的一項重要工作。構(gòu)建cDNA文庫是功能基因組學(xué)研究的基本手段之一，其在研究某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定具有特殊的優(yōu)勢，在個體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和凋亡等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價值。然而，以常規(guī)方法構(gòu)建的cDNA文庫面臨的最大問題是高通量分析過程中的重復(fù)拷貝比例高，其主要原因在于高等真核生物的細(xì)胞中基因表達(dá)水平的差異較大。高拷貝基因序列的大量存在給基因的篩選和鑒定帶來了不必要的浪費(fèi)。自1990年以來出現(xiàn)了各種均一化cDNA文庫的構(gòu)建方法，試圖在文庫測序前降低高豐度轉(zhuǎn)錄本的克隆，增加中、低豐度轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)的頻率，以有利于低豐度表達(dá)基因的發(fā)現(xiàn)。

CN102797044A公開了一種高效快速的均一化全長cDNA文庫構(gòu)建方法，該方法利用特定的5-OH寡核苷酸封閉非全長mRNA，在用煙草酸焦磷酸酶除去mRNA5′端的帽子結(jié)構(gòu)，使mRNA5′端帽子結(jié)構(gòu)處的磷酸基團(tuán)暴露出來，用高效的RNA連接系統(tǒng)在mRNA的5′端連上一段優(yōu)化的寡聚核糖核酸作為引發(fā)第二鏈cDNA合成的引物結(jié)合位點(diǎn)，最后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，二鏈合成、分級純化后，將雙鏈DNA克隆于載體中。該方法具有簡潔高效的全長mRNA篩選功能，實(shí)現(xiàn)對真核生物全長mRNA的捕獲，mRNA5′末端含有生物素標(biāo)記，可用于全長mRNA分離，所用寡核苷酸引物含有優(yōu)化的修飾方法及核苷酸序列，可實(shí)現(xiàn)真核生物mRNA全場捕獲、反轉(zhuǎn)錄以及DNA的合成。然而，該方法由于采用了RNaseⅠ切割單鏈RNA，從而影響全長cDNA篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性及cDNA文庫的全長比例；同時，磁珠的非特異性吸附性也將影響全長比例。

CN101597630公開了一種雙鏈特異性DNA酶介導(dǎo)的cDNA均一化消減雜交方法，依次包括第一鏈cDNA的合成、合成雙鏈cDNA、轉(zhuǎn)錄RNA、逆轉(zhuǎn)錄、均一化和消減雜交、雙鏈特異性DNA酶消化、PCR擴(kuò)增、克隆差異表達(dá)基因及鑒定等步驟。與其它方法相比本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：(a)對共同表達(dá)基因的高消減效率，對差異表達(dá)基因的高效富集，同時表達(dá)量很低的差異表達(dá)基因可以被有效富集；(b)能夠得到全長cDNA序列。然而，該方法增加了消減雜交的步驟，實(shí)驗方法繁瑣、復(fù)雜。

羅洪林等為構(gòu)建大片吸蟲成蟲cDNA表達(dá)文庫，用Trizol試劑提取大片吸蟲成蟲總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，應(yīng)用LD-PCR擴(kuò)增方法，合成雙鏈cDNA。用SfiⅠ內(nèi)切酶修飾此雙鏈cDNA，使形成兩端分別帶有SfiⅠA和SfiⅠB的黏性末端。經(jīng)CHROMA SPIN-400柱純化，收集400bp以上的雙鏈cDNA片段，將其連接于帶有SfiⅠA和SfiⅠB末端的λTriplEx2噬菌體載體，經(jīng)體外包裝后，以XL1-Blue為受體菌構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫。經(jīng)測定，庫容量為1.08×10⁶PFU/mL，重組率為96.6％。擴(kuò)增后的文庫滴度為2.41×10⁹PFU/mL，插入片段平均大小約為1 000bp。這些結(jié)果表明已成功構(gòu)建大片吸蟲成蟲cDNA表達(dá)文庫，適合進(jìn)一步篩選大片吸蟲新基因(應(yīng)用LD-PCR法構(gòu)建大片吸蟲成蟲cDNA表達(dá)文庫，《畜牧獸醫(yī)學(xué)報》2005年11期)。然而，該方法存在文庫非均一化的問題，不利于低豐度表達(dá)基因的發(fā)現(xiàn)。

菰(Zizania latifolia(Griseb.)Stapf)是國家二級保護(hù)植物品種，也是水稻的近緣屬，具有生物量大、抗病蟲、耐寒等許多優(yōu)良性狀，近年來被眾多研究學(xué)者作為水稻育種優(yōu)良基因資源庫的重要來源。然而，針對菰的分子生物學(xué)研究仍然處于起步階段，菰的遺傳信息獲得還很不完整，對菰基因信息的有限所知嚴(yán)重阻礙了其作為水稻育種優(yōu)良基因資源庫的研究與應(yīng)用。因此開發(fā)一種快速、簡單、高效的菰cDNA文庫的構(gòu)建方法，解決常規(guī)操作步驟復(fù)雜，RNA容易降解的問題，克服基因轉(zhuǎn)錄水平上的巨大差異，提高發(fā)現(xiàn)隨機(jī)序列和稀有基因的幾率，對于開展菰功能基因的利用研究十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種菰cDNA文庫的構(gòu)建方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種菰cDNA文庫的構(gòu)建方法，其中，為了提高cDNA反轉(zhuǎn)錄效率，本發(fā)明通過SMART法，利用反轉(zhuǎn)錄酶PowerScript RT的末端轉(zhuǎn)移酶活性來實(shí)現(xiàn)cDNA反轉(zhuǎn)錄。

進(jìn)一步地，DSN酶均一化效率的高低是構(gòu)建均一化cDNA文庫的關(guān)鍵，本發(fā)明通過對雜交后的cDNA利用不同濃度梯度的DSN進(jìn)行消化，富集低豐度表達(dá)基因，顯著提高了DSN酶均一化效率。

具體而言，本發(fā)明所述的菰cDNA文庫的構(gòu)建方法包括如下步驟：

S1、菰總RNA獲得；

S2、cDNA第一鏈合成；

S3、LD PCR；

S4、蛋白酶K消化；

S5、cDNA文庫均一化：

S51、雜交；

S52、DSN消化；

S6、DSN消化后兩次PCR放大；

S7、擴(kuò)增產(chǎn)物純化；

S8、Sfi I消化；

S9、酶切cDNA純化。

進(jìn)一步地，所述構(gòu)建方法還包括如下步驟：

S10、cDNA與PUC19載體連接；

S11、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化；

S12、克隆鑒定。

進(jìn)一步地，本發(fā)明針對菰的特殊性優(yōu)化了反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及所用引物序列。

其中，S2具體包括如下步驟：

a.在PCR管中加入以下試劑：

b.72℃溫浴2min；

c.冰浴2min，離心后加入下列試劑：

d.42℃溫浴1h。

其中，CDS III的序列為：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCd(T)20VN*-3'；N＝A,C,G or T；V＝A,G or C。

其中，S52具體包括如下步驟：

a.設(shè)置不同濃度的DSN酶：

①將DSN storage buffer和DSN酶等體積混勻，標(biāo)記為1/2DSN；

②將3倍體積的DSN storage buffer和1倍體積的DSN酶混勻，標(biāo)記為1/4DSN；

③DSN storage buffer，標(biāo)記為control；

④DSN酶，標(biāo)記為DSN；

b.68℃預(yù)熱DSN master buffer；

c.依次加入下列試劑后，混勻；

d.將4個PCR管68℃反應(yīng)25min；

e.在各管中加入2×DSN stop buffer，混勻；

f.室溫放置5min；

g.-20℃保存。

其中，S6具體包括如下步驟：

S61、第一次放大

a.分別向S52得到的四個消化后產(chǎn)物中加入以下試劑，混勻；

其中，Primer M1為5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

b.PCR：95℃1min；95℃15sec、66℃20sec、72℃3min，11cycles；

c.從各管中分別取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測；

d.根據(jù)電泳結(jié)果，選擇條帶大小為1000-2000bp、亮度一致、分散均勻的產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次放大。

其中，S6具體包括如下步驟：

S62、第二次放大

a.在兩個PCR管中依次加入以下試劑，混勻；

其中，Primer M2為5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAG-3’；

b.PCR：

c.取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

作為優(yōu)選，構(gòu)建過程中所需要的葉片為新鮮、幼嫩的組織，從而保證獲得數(shù)量足夠的高質(zhì)量的起始RNA。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供了一種菰cDNA文庫的構(gòu)建方法，以菰的幼嫩葉片作為試驗材料，由RNA提取，cDNA第一鏈合成，LD PCR，蛋白酶K消化，cDNA文庫均一化，兩次PCR放大，擴(kuò)增產(chǎn)物純化，Sfi I消化，酶切cDNA純化，cDNA與PUC19載體連接，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，以及克隆鑒定等12個步驟完成；該方法構(gòu)建文庫便捷，文庫容量大，重組率高，完整性好，均一化后高豐度基因明顯降低，為功能基因的驗證奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明構(gòu)建的菰cDNA文庫庫容量大，達(dá)到了3.6×10⁶pfu·mL^-1，插入片段平均長度為1000bp，重組率為97.9％，均一化全長cDNA文庫能有效富集低豐度表達(dá)基因，降低冗余率。該文庫適用于目的基因的篩選，以及后續(xù)的基因、蛋白互作分析。

附圖說明

圖1為雙鏈cDNA合成后的電泳檢測圖，其中，M為Marker(TAKARA公司的DL2000)。

圖2為均一化后一次放大的電泳檢測圖，其中，M為Marker(TAKARA公司的DL2000)。

圖3為均一化后二次放大的電泳檢測圖，其中，M為Marker(TAKARA公司的DL2000)。

圖4為驗證均一化效率的電泳檢測圖，其中，M代表Marker(TAKARA公司的DL2000)，N代表均一化模板，UN代表未均一化模板，C代表cycle數(shù)目。

圖5為菌落的生長情況。

圖6為插入片段鑒定的電泳檢測圖，其中，M為Marker(TAKARA公司的DL2000)，從左至右依次為挑選的第1-24個克隆的PCR產(chǎn)物。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

本發(fā)明的菰均一化cDNA文庫的構(gòu)建方法主要包括以下步驟：總RNA的提取，利用SMART方法合成cDNA雙鏈，cDNA變性后重新雜交，經(jīng)雙鏈特異性核酸酶降解雙鏈cDNA后完成cDNA的均一化過程，均一化后的單鏈cDNA成分經(jīng)PCR擴(kuò)增并插入載體等。

具體步驟如下：

(1)菰總RNA獲得：

a.取1g菰的幼嫩葉片，在預(yù)冷的研缽中用液氮研成粉末，然后轉(zhuǎn)入15mL RNase free離心管中；

b.加入10mL的Trizol試劑，振蕩混勻，室溫靜置10min充分裂解細(xì)胞；

c.加入2mL的氯仿，劇烈震蕩15sec，室溫靜置5min；

d.12，000×g，4℃，離心15min；

e.取上清至新15mL RNase free離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置5min；

f.12，000×g，4℃，離心10min；

g.棄上清，加入5mL的75％乙醇(RNase free)洗滌沉淀，12，000×g高速冷凍離心5min；

h.重復(fù)上述步驟一次；

i.棄上清，超凈工作臺中空氣干燥RNA沉淀，然后溶解于500μLDEPC水中。

(2)cDNA第一鏈合成

a.在0.2mL PCR管中加入以下試劑：

CDS III/3'PCR Primer：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCd(T)₂₀VN*-3'；N*＝A,C,G or T；V＝A,G or C。

b.72℃溫浴2min；

c.冰浴2min，離心加入下列試劑：

d.42℃溫浴1h。

(3)LD PCR

a.在0.2mL反應(yīng)管中加入下列試劑：

b.輕拍混勻各組分，稍稍離心后放到已預(yù)熱(95℃)的PCR儀。按下面程序開始PCR：

圖1所示為擴(kuò)增后cDNA的1％瓊脂糖凝膠電泳圖，可見200bp-2000bp之間亮度不同的彌散條帶，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。

(4)蛋白酶K消化

a.每50μL擴(kuò)增的雙鏈cDNA中加入2μL蛋白酶K(20μg/μL)；混勻并短暫離心；

b.45℃溫浴20min，短暫離心；

c.加入等體積酚:氯仿:異戊醇劇烈震蕩1-2min；

d.14,000rpm離心5min；

e.收集上層液體到另一干凈的離心管中，棄去中間層和下層溶液；

f.加入等體積的氯仿:異戊醇劇烈震蕩1-2min；

g.14,000rpm離心5min；

h.收集上層液體到另一干凈的離心管中，棄去中間層和下層溶液；

i.加入1/10體積的3M乙酸鈉，2.5倍體積95％的室溫乙醇，室溫條件下立即14,000rpm離心20min；

g.棄上清，用100μL 80％乙醇洗沉淀物；空氣干燥沉淀物約10min；

k.加25μL的去離子水溶解沉淀；

l.取5μL樣品電泳檢測。

(5)cDNA文庫均一化

①雜交

a.將下列試劑于0.2mL PCR管中混勻；

b.將上述溶液平均分成4份，置于0.2mL PCR管中；

c.將PCR管在PCR儀上98℃放置2min；

d.然后將PCR管迅速轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的68℃PCR儀中5h。

②DSN消化

a.在雜交完成前準(zhǔn)備好以下濃度的DSN酶：

①將1μL DSN storage buffer和1μL DSN酶混勻，標(biāo)記為1/2DSN；

②將3μL DSN storage buffer和1μL DSN酶混勻，標(biāo)記為1/4DSN；

③直接取1μL DSN storage buffer，標(biāo)記為control；

b.68℃預(yù)熱DSN master buffer；

c.依次加入下列試劑后，混勻

d.將4個PCR管68℃反應(yīng)25min；

e.在各管中加入10μL 2×DSN stop buffer，混勻；

f.室溫放置5min；

g.-20℃保存。

(6)DSN消化后兩次PCR放大

①第一次放大

a.在四個PCR管中依次加入以下試劑，混勻，分別標(biāo)記為DSNP1，1/2DSNP1，1/4DSNP1，controlP1

Primer M1：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

b.輕拍混勻各組分，按下面程序開始PCR：

c.從各管中分別取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測；

d.根據(jù)電泳結(jié)果，選擇合適的產(chǎn)物(如1/4DSN)為模板進(jìn)行第二次放大。

②第二次放大

a.在兩個PCR管中依次加入以下試劑，混勻，分別標(biāo)記為1/4DSNP2，controlP2

Primer M2：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAG-3’；

b.彈指混勻各組分，短暫離心后放到已預(yù)熱(95℃)的PCR儀，按下面程序開始PCR：

c.從各管中分別取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

從圖2可以看出，高拷貝基因1倍酶、1/2酶處理過度，1/4酶處理合適，因此用1/4酶處理進(jìn)行二次PCR。由圖3可以看出，通過二次PCR使一次PCR更集中。

(7)擴(kuò)增產(chǎn)物純化

a.加入等體積酚:氯仿:異戊醇劇烈震蕩1-2min；

b.14,000rpm離心5min；

c.收集上層液體到另一干凈的離心管中，棄去中間層和下層溶液；

d.加入等體積的氯仿:異戊醇劇烈震蕩1-2min；

e.14,000rpm離心5min；

f.收集上層液體到另一干凈的離心管中，棄去中間層和下層溶液；

g.加入1/10體積的3M乙酸鈉，2.5倍體積95％乙醇，室溫條件下立即14,000rpm離心20min；

h.倒掉上清，用100μL 80％乙醇洗沉淀物；

i.空氣干燥沉淀物約10min；

j.加84μL的去離子水溶解沉淀；

k.取5μL樣品電泳檢測。

經(jīng)過DSN消化后的兩次PCR放大，對均一化效率進(jìn)行驗證。以1/2DSN和control為模板，用18S管家基因進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)電泳后用Tanon GIS軟件分析灰度，驗證結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示本文庫均一化后比非均一化的豐度下降26倍以上。

(8)Sfi I消化

a.在一1.5mL離心管中加入下列試劑：

b.充分混勻，50℃溫浴2h；

(9)酶切cDNA純化

a.加入等體積酚:氯仿:異戊醇劇烈震蕩1-2min；

b.14,000rpm離心5min；

c.收集上層液體到另一干凈的離心管中，棄去中間層和下層溶液；

d.加入等體積的氯仿:異戊醇劇烈震蕩1-2min；

e.14,000rpm離心5min；

f.收集上層液體到另一干凈的離心管中，棄去中間層和下層溶液；

g.加入1/10體積的3M乙酸鈉，2.5倍體積95％的室溫乙醇，室溫條件下立即14,000rpm離心20min；

h.倒掉上清，用100μL 80％乙醇洗沉淀物；

i.空氣干燥沉淀物約10min；

j.加100μL去離子水溶解沉淀。

(10)cDNA與PUC19載體連接

a.反應(yīng)管中加入下列試劑：

b.4℃反應(yīng)過夜。

(11)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

a.取200μL感受態(tài)宿主菌(DH-5α)，放置冰上融化；

b.加入上述1μL連接液，輕輕混勻后置于冰上30min；

c.42℃水浴熱休克90sec，迅速放入冰上2min；

d.加入300μL SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，置于37℃搖床，轉(zhuǎn)速200rpm，復(fù)蘇45min；

e.菌液涂布于15cm培養(yǎng)皿上(Ap^r-IPTG/x-gal LB固體培養(yǎng)基)，37℃過夜。

由圖5可知，菌落總數(shù)為2440，其中藍(lán)斑50；重組率為：(克隆總數(shù)-藍(lán)斑總數(shù))/克隆總數(shù)，重組率為(2440-50)/2440＝97.9％。

(12)克隆鑒定：

a、挑24個克隆，37℃，200rpm培養(yǎng)過夜，取1μL菌液作為PCR模板。在PCR管中依次加入以下試劑，混勻：

M13F：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’；

M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。

b、輕拍混勻各組分，稍稍離心后放到PCR儀。按下面程序開始PCR：

c、從各管中分別取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

由圖6的結(jié)果可知，插入片段多大于750bp且分布在0.75-2.0k之間，符合建庫標(biāo)準(zhǔn)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110> 廣東菰稻農(nóng)業(yè)有限公司

<120> 一種菰cDNA文庫的構(gòu)建方法

<130> KHP161118838.2

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (57)..(57)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (58)..(58)

<223> v is a, g, or c

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agtggccgag gcggcctttt tttttttttt ttttttnv 58

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcagtggt atcaacgcag 20

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtaaaacgac ggccag 16

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caggaaacag ctatgac 17