一種核酸分子低穿孔速度的納米孔測序方法及其專用的納米孔器件的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種核酸分子低穿孔速度的納米孔測序方法及其專用的納米孔器件，屬于材料測試領域。
【背景技術】
[0002]基于固態(tài)納米孔器件的DNA單分子探測分析被認為是最有希望實現(xiàn)第三代快速低成本人類基因測序(在24小時內花費1000美元以下實現(xiàn)單個人的基因組測序)的技術路線之一，成為目前研宄和應用探索的熱點，除哈佛大學、波士頓大學、布朗大學、加州理工學院、荷蘭代爾夫特工業(yè)大學等研宄小組外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人類基因組測序-1000美元計劃，以基于納米孔器件的測序技術為實現(xiàn)方法，使納米孔的研宄由基礎研宄開始走向應用(D.Branton, et al.Nature B1technology26 (10), 1146(2008)；M.Zwolak and M.Di Ventra, Reviews of Modern Physics 80 (I)，141 (2008).)。通過在溶液中電泳驅動分子穿過一個納米尺度的孔可以實現(xiàn)基于納米孔器件的單分子探測和分析能力。在納米孔的有限空間里可以通過各種手段對大量分子進行快速的分析，當高聚物分子穿過納米孔時，高聚物分子的結構信息和探測的信號特征有一一對應關系。利用該特性可以直接對數(shù)千堿基對長度的單鏈DNA分子進行表征，避免了擴增或標記實驗準備環(huán)節(jié)，使得快速低成本DNA測序技術成為可能。目前阻礙這一技術長足發(fā)展的最大困難在于在電場驅動電壓下，DNA穿孔速度過快，超出了通用儀器的分辨率，從而無法實現(xiàn)對單堿基的差別進行識別。
[0003]目前國際上較為常用的實驗技術是在納米孔兩端加一個電壓，通過電場驅動，使DNA分子從孔一端電泳通過納米孔，在外電路收集的離子電流會出現(xiàn)一個突然下降，電流的突然下降值和阻滯時間，可以對應DNA的生物學信息。但是單純使用電場調節(jié)，DNA的穿孔速度太快，基本在一個堿基一微秒的量級，而目前儀器的最小分辨率為4微秒，也就是說，如果想要區(qū)別不同堿基之間的差別，通過現(xiàn)有手段，時間分辨率是無法達到的。要提高時間分辨率，就必須使DNA分子的穿孔時間延長，有效減慢DNA在孔中的運動速度。減慢DNA的穿孔速度，才有可能實現(xiàn)對不同堿基的分辨。美國Boston College的Amit Meller等人通過改變Cis和Trans腔填充的溶液鹽濃度，可以在5nm的娃化氮(SiN)納米孔中，實現(xiàn) DNA 分子毫秒量級的穿孔過程(M.ffanunu, ff.Morrison, Y.Rabin, A.Y.Grosberg andA.Meller, Nature Nanotechnology, 5, 160, (2010))。但是他們對產生這種現(xiàn)象的機理解釋不清楚，而且他們使用的納米孔很小，DNA與納米孔壁之間的相互作用可能會起作用，而這對實驗的可控性大打折扣。而且直徑很小的納米孔在實驗實現(xiàn)起來非常困難，成功率很低。
[0004]美國阿肯色大學的Jiali Li等通過在溶液中加入甘油，可以增加DNA的穿孔時間，但是實驗條件要求非常茍1刻，對實驗技術要求很高(D.Fologea, J.Uplinger, B.Thomas, D.S.McNabb, and J.L.Li, Nano Letters 5，1734 (2005))。而且隨著甘油的增加，導致溶液粘滯系數(shù)增加，DNA穿孔阻滯電流值幅度下降，這樣測試的信噪比下降，導致測量誤差增大。另外可以通過降低電壓，使DNA穿孔速度減慢，但是電壓降低導致電流信號降低，信噪比變差，導致測量非常困難。可以看到現(xiàn)有的很多減慢DNA穿孔速度的做法都是在犧牲信噪比的基礎上才有可能實現(xiàn)，這樣對準確測量信號增加了很大難度，不容易得到準確相關的生物學信息。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種核酸分子低穿孔速度的納米孔測序方法及其專用的納米孔器件，本發(fā)明在保證了不影響測量信號信噪比的前提下，以瓊脂糖凝膠修飾固態(tài)納米孔薄膜作為減速器件，有效減慢了核酸分子在納米孔中運動的速度，以提高納米孔器件的時間分辨率。
[0006]本發(fā)明提供的核酸分子低穿孔速度的納米孔測序方法，包括如下步驟:將待測的核酸分子加入到盛有電解液的納米孔測序裝置中，所述納米孔測序裝置包括:設有正極和負極的電解池以及分隔所述電解池正極和負極的一面覆蓋有瓊脂糖凝膠層的固態(tài)納米孔薄膜；將所述核酸分子置于所述電解池的負極腔室；測定時，在正極和負極間施加電壓，作為核酸分子穿孔的驅動電場。
[0007]上述的方法，所述核酸分子可為DNA、RNA或肽核酸，所述DNA可為單鏈的DNA或者雙鏈的DNA。
[0008]上述的方法，瓊脂糖凝膠層的制備方法，包括如下步驟:將瓊脂糖凝膠水溶液涂覆于所述固態(tài)納米孔薄膜的一面上，所述瓊脂糖凝膠水溶液凝固后即得所述瓊脂糖凝膠層；具體過程為將瓊脂糖凝膠粉末與去離子水混合加熱后冷卻，即得到瓊脂糖凝膠溶液，通過轉移流程，即可實現(xiàn)對所述固態(tài)納米孔薄膜的表面涂覆。
[0009]本發(fā)明中，所述固態(tài)納米孔薄膜涂覆有所述瓊脂糖凝膠層的一面可與電解池的正極或負極相對；優(yōu)選與電解池的負極相對，即所述瓊脂糖凝膠層在負極腔室中。
[0010]上述的方法，所述瓊脂糖凝膠水溶液的質量百分濃度可為0.5?2%，具體可為1%，所述固態(tài)納米孔薄膜上涂覆的所述瓊脂糖凝層的厚度可為10?ΙΟΟμ??，具體可為100 μ m0
[0011]上述的方法，所述瓊脂糖凝膠層均勻覆蓋于所述固態(tài)納米孔薄膜上。
[0012]上述的方法，所述固態(tài)納米孔薄膜的納米孔的直徑為10?20nm，具體可為10nm，孔深為20?lOOnm，具體可為60nm ；
[0013]測定過程中待測的所述核酸分子在進入所述固態(tài)納米孔薄膜上的納米孔時同時受到納米孔外所述瓊脂糖凝膠層的網格的減速作用。
[0014]上述的方法，所述電壓可為100?300mV ；
[0015]所述電解液的摩爾濃度可為0.1?3.2mol/L，具體可為1.6mol/L，所述電解液可為氯化鉀溶液、氯化鈉溶液或氯化鋰溶液；
[0016]所述電解液的pH值可為8?10，具體可為9。
[0017]本發(fā)明還提供了上述的方法的專用的納米孔器件，它由固態(tài)納米孔薄膜及其覆蓋在所述固態(tài)納米孔薄膜上的瓊脂糖凝膠層組成。
[0018]上述的納米孔器件，所述固態(tài)納米孔薄膜的納米孔的直徑可為10?20nm，具體可為10nm，孔深可為20?100nm，具體可為60nm ；
[0019]所述瓊脂糖凝膠層的厚度可為10?100 μ m，具體可為100 ym ;
[0020]制備所述瓊脂糖凝膠層使用的瓊脂糖凝膠水溶液的質量百分濃度可為0.5?2 %，具體可為I %，所述瓊脂糖凝膠以同一厚度均勻的覆蓋在所述固態(tài)納米孔薄膜上。
[0021]本發(fā)明還進一步提供了一種納米孔測序法中降低核酸分子穿孔速度的方法，包括用固態(tài)納米孔薄膜分隔設有正極和負極的電解池；所述固態(tài)納米孔薄膜上覆蓋有瓊脂糖凝膠層。
[0022]本發(fā)明中由于瓊脂糖凝膠層是由瓊脂糖凝膠纖維構成的多孔的三維網格結構，孔道直徑平均為200nm(l%質量濃度時)，因此該網格在不影響離子電流信號的前提下，可以對經由該網格進入納米孔的DNA產生相互作用，從而實現(xiàn)對DNA的減速。而目前報道的納米孔測序法檢測核酸分子只有一個電場驅動，通過降低電場作用來減速DNA，這樣做大大降低了測量信噪比