一種核酸分子低穿孔速度的納米孔測(cè)序方法及其專用的納米孔器件的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種核酸分子低穿孔速度的納米孔測(cè)序方法及其專用的納米孔器件，屬于材料測(cè)試領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]基于固態(tài)納米孔器件的DNA單分子探測(cè)分析被認(rèn)為是最有希望實(shí)現(xiàn)第三代快速低成本人類基因測(cè)序(在24小時(shí)內(nèi)花費(fèi)1000美元以下實(shí)現(xiàn)單個(gè)人的基因組測(cè)序)的技術(shù)路線之一，成為目前研宄和應(yīng)用探索的熱點(diǎn)，除哈佛大學(xué)、波士頓大學(xué)、布朗大學(xué)、加州理工學(xué)院、荷蘭代爾夫特工業(yè)大學(xué)等研宄小組外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人類基因組測(cè)序-1000美元計(jì)劃，以基于納米孔器件的測(cè)序技術(shù)為實(shí)現(xiàn)方法，使納米孔的研宄由基礎(chǔ)研宄開始走向應(yīng)用(D.Branton, et al.Nature B1technology26 (10), 1146(2008)；M.Zwolak and M.Di Ventra, Reviews of Modern Physics 80 (I)，141 (2008).)。通過(guò)在溶液中電泳驅(qū)動(dòng)分子穿過(guò)一個(gè)納米尺度的孔可以實(shí)現(xiàn)基于納米孔器件的單分子探測(cè)和分析能力。在納米孔的有限空間里可以通過(guò)各種手段對(duì)大量分子進(jìn)行快速的分析，當(dāng)高聚物分子穿過(guò)納米孔時(shí)，高聚物分子的結(jié)構(gòu)信息和探測(cè)的信號(hào)特征有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。利用該特性可以直接對(duì)數(shù)千堿基對(duì)長(zhǎng)度的單鏈DNA分子進(jìn)行表征，避免了擴(kuò)增或標(biāo)記實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備環(huán)節(jié)，使得快速低成本DNA測(cè)序技術(shù)成為可能。目前阻礙這一技術(shù)長(zhǎng)足發(fā)展的最大困難在于在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)電壓下，DNA穿孔速度過(guò)快，超出了通用儀器的分辨率，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)單堿基的差別進(jìn)行識(shí)別。
[0003]目前國(guó)際上較為常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)是在納米孔兩端加一個(gè)電壓，通過(guò)電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)，使DNA分子從孔一端電泳通過(guò)納米孔，在外電路收集的離子電流會(huì)出現(xiàn)一個(gè)突然下降，電流的突然下降值和阻滯時(shí)間，可以對(duì)應(yīng)DNA的生物學(xué)信息。但是單純使用電場(chǎng)調(diào)節(jié)，DNA的穿孔速度太快，基本在一個(gè)堿基一微秒的量級(jí)，而目前儀器的最小分辨率為4微秒，也就是說(shuō)，如果想要區(qū)別不同堿基之間的差別，通過(guò)現(xiàn)有手段，時(shí)間分辨率是無(wú)法達(dá)到的。要提高時(shí)間分辨率，就必須使DNA分子的穿孔時(shí)間延長(zhǎng)，有效減慢DNA在孔中的運(yùn)動(dòng)速度。減慢DNA的穿孔速度，才有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)不同堿基的分辨。美國(guó)Boston College的Amit Meller等人通過(guò)改變Cis和Trans腔填充的溶液鹽濃度，可以在5nm的娃化氮(SiN)納米孔中，實(shí)現(xiàn) DNA 分子毫秒量級(jí)的穿孔過(guò)程(M.ffanunu, ff.Morrison, Y.Rabin, A.Y.Grosberg andA.Meller, Nature Nanotechnology, 5, 160, (2010))。但是他們對(duì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機(jī)理解釋不清楚，而且他們使用的納米孔很小，DNA與納米孔壁之間的相互作用可能會(huì)起作用，而這對(duì)實(shí)驗(yàn)的可控性大打折扣。而且直徑很小的納米孔在實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)起來(lái)非常困難，成功率很低。
[0004]美國(guó)阿肯色大學(xué)的Jiali Li等通過(guò)在溶液中加入甘油，可以增加DNA的穿孔時(shí)間，但是實(shí)驗(yàn)條件要求非常茍1刻，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求很高(D.Fologea, J.Uplinger, B.Thomas, D.S.McNabb, and J.L.Li, Nano Letters 5，1734 (2005))。而且隨著甘油的增加，導(dǎo)致溶液粘滯系數(shù)增加，DNA穿孔阻滯電流值幅度下降，這樣測(cè)試的信噪比下降，導(dǎo)致測(cè)量誤差增大。另外可以通過(guò)降低電壓，使DNA穿孔速度減慢，但是電壓降低導(dǎo)致電流信號(hào)降低，信噪比變差，導(dǎo)致測(cè)量非常困難。可以看到現(xiàn)有的很多減慢DNA穿孔速度的做法都是在犧牲信噪比的基礎(chǔ)上才有可能實(shí)現(xiàn)，這樣對(duì)準(zhǔn)確測(cè)量信號(hào)增加了很大難度，不容易得到準(zhǔn)確相關(guān)的生物學(xué)信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種核酸分子低穿孔速度的納米孔測(cè)序方法及其專用的納米孔器件，本發(fā)明在保證了不影響測(cè)量信號(hào)信噪比的前提下，以瓊脂糖凝膠修飾固態(tài)納米孔薄膜作為減速器件，有效減慢了核酸分子在納米孔中運(yùn)動(dòng)的速度，以提高納米孔器件的時(shí)間分辨率。
[0006]本發(fā)明提供的核酸分子低穿孔速度的納米孔測(cè)序方法，包括如下步驟:將待測(cè)的核酸分子加入到盛有電解液的納米孔測(cè)序裝置中，所述納米孔測(cè)序裝置包括:設(shè)有正極和負(fù)極的電解池以及分隔所述電解池正極和負(fù)極的一面覆蓋有瓊脂糖凝膠層的固態(tài)納米孔薄膜；將所述核酸分子置于所述電解池的負(fù)極腔室；測(cè)定時(shí)，在正極和負(fù)極間施加電壓，作為核酸分子穿孔的驅(qū)動(dòng)電場(chǎng)。
[0007]上述的方法，所述核酸分子可為DNA、RNA或肽核酸，所述DNA可為單鏈的DNA或者雙鏈的DNA。
[0008]上述的方法，瓊脂糖凝膠層的制備方法，包括如下步驟:將瓊脂糖凝膠水溶液涂覆于所述固態(tài)納米孔薄膜的一面上，所述瓊脂糖凝膠水溶液凝固后即得所述瓊脂糖凝膠層；具體過(guò)程為將瓊脂糖凝膠粉末與去離子水混合加熱后冷卻，即得到瓊脂糖凝膠溶液，通過(guò)轉(zhuǎn)移流程，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)所述固態(tài)納米孔薄膜的表面涂覆。
[0009]本發(fā)明中，所述固態(tài)納米孔薄膜涂覆有所述瓊脂糖凝膠層的一面可與電解池的正極或負(fù)極相對(duì)；優(yōu)選與電解池的負(fù)極相對(duì)，即所述瓊脂糖凝膠層在負(fù)極腔室中。
[0010]上述的方法，所述瓊脂糖凝膠水溶液的質(zhì)量百分濃度可為0.5?2%，具體可為1%，所述固態(tài)納米孔薄膜上涂覆的所述瓊脂糖凝層的厚度可為10?ΙΟΟμ??，具體可為100 μ m0
[0011]上述的方法，所述瓊脂糖凝膠層均勻覆蓋于所述固態(tài)納米孔薄膜上。
[0012]上述的方法，所述固態(tài)納米孔薄膜的納米孔的直徑為10?20nm，具體可為10nm，孔深為20?lOOnm，具體可為60nm ；
[0013]測(cè)定過(guò)程中待測(cè)的所述核酸分子在進(jìn)入所述固態(tài)納米孔薄膜上的納米孔時(shí)同時(shí)受到納米孔外所述瓊脂糖凝膠層的網(wǎng)格的減速作用。
[0014]上述的方法，所述電壓可為100?300mV ；
[0015]所述電解液的摩爾濃度可為0.1?3.2mol/L，具體可為1.6mol/L，所述電解液可為氯化鉀溶液、氯化鈉溶液或氯化鋰溶液；
[0016]所述電解液的pH值可為8?10，具體可為9。
[0017]本發(fā)明還提供了上述的方法的專用的納米孔器件，它由固態(tài)納米孔薄膜及其覆蓋在所述固態(tài)納米孔薄膜上的瓊脂糖凝膠層組成。
[0018]上述的納米孔器件，所述固態(tài)納米孔薄膜的納米孔的直徑可為10?20nm，具體可為10nm，孔深可為20?100nm，具體可為60nm ；
[0019]所述瓊脂糖凝膠層的厚度可為10?100 μ m，具體可為100 ym ;
[0020]制備所述瓊脂糖凝膠層使用的瓊脂糖凝膠水溶液的質(zhì)量百分濃度可為0.5?2 %，具體可為I %，所述瓊脂糖凝膠以同一厚度均勻的覆蓋在所述固態(tài)納米孔薄膜上。
[0021]本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種納米孔測(cè)序法中降低核酸分子穿孔速度的方法，包括用固態(tài)納米孔薄膜分隔設(shè)有正極和負(fù)極的電解池；所述固態(tài)納米孔薄膜上覆蓋有瓊脂糖凝膠層。
[0022]本發(fā)明中由于瓊脂糖凝膠層是由瓊脂糖凝膠纖維構(gòu)成的多孔的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，孔道直徑平均為200nm(l%質(zhì)量濃度時(shí))，因此該網(wǎng)格在不影響離子電流信號(hào)的前提下，可以對(duì)經(jīng)由該網(wǎng)格進(jìn)入納米孔的DNA產(chǎn)生相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的減速。而目前報(bào)道的納米孔測(cè)序法檢測(cè)核酸分子只有一個(gè)電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)，通過(guò)降低電場(chǎng)作用來(lái)減速DNA，這樣做大大降低了測(cè)量信噪比