一種推斷寡核苷酸在基因組上結(jié)合位點的方法和系統(tǒng)的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種推斷寡核苷酸結(jié)合位點的方法和系統(tǒng)，尤其涉及一種推斷寡核苷 酸在基因組上結(jié)合位點的方法和系統(tǒng)。
【背景技術】
[0002] 寡核苷酸（oligonucleotide或oligo)是一類短鏈核苷酸的總稱，通過與其互補 序列匹配，常作為探針以確定目標基因的結(jié)構(gòu)，或作為引物來有效擴增模板序列。目前基于 寡核苷酸雜交的分子生物技術（如芯片探針、PCR引物等）在二代測序、病原微生物檢測、 芯片雜交、臨床診斷等領域中廣泛應用并發(fā)揮重要作用。其根本原理是核酸分子雜交，即互 補的核苷酸序列在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）通過Watson-Crick堿基配對 形成非共價鍵，從而形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過程。
[0003] 由于這些分子生物學技術的穩(wěn)定性與敏感性強烈依賴于設計出的寡核苷酸（在 芯片中對應探針，在PCR中對應引物）的質(zhì)量，即設計出寡核苷酸自身需要具有高穩(wěn)定性， 同時能與目標序列的目標區(qū)域高特異性結(jié)合，而與其它區(qū)域不結(jié)合。如果設計不佳，以PCR 為例，非特異的引物會觸發(fā)非特異擴增，進而導致假陽性的檢測結(jié)果。所以設計合適的寡核 苷酸探針以及PCR引物至關重要，而通過預測設計的寡核苷酸在目標序列上結(jié)合位點，是 一種有效的判斷該寡核苷酸是否適用于該目標序列的方法。
[0004] 當前寡核苷酸設計軟件廣泛使用BLAST進行序列相似性分析來對設計的寡核苷 酸進行質(zhì)量控制，BLAST是一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或核酸數(shù)據(jù)庫中進行序列相似性比較的局 部比對分析工具，通過序列相似性打分來說明序列之間的相似程度。所謂序列相似性又名 序列一致性，是序列相似程度的一種描述，值的大小取決于序列比對過程中檢測序列和目 標序列之間對應位置上相同字符的個數(shù)，值越大，表示兩條序列越相似。由于BLAST具備較 快的比對速度和較高的比對精度，因此在常規(guī)序列比對分析中應用最為廣泛。例如目前流 行的PCR引物設計軟件PerlPrimer，芯片探針設計軟件Mprobe、oligoarray以及siRNA設 計軟件siRNA Target Finder等都使用了 BLAST序列比對的思想。
[0005] 然而，BLAST不能準確反映寡核苷酸結(jié)合的真實情況。BLAST的打分體制是根據(jù)序 列之間對應位置上的堿基相同（如AA、TT等）或不相同（如AT、GC等）賦予不同的分數(shù)， 或者進一步對不相同的堿基根據(jù)不同的匹配度（嘌呤與嘌呤之間或嘧啶與嘧啶之間的轉(zhuǎn) 換如AG或者CT之間的匹配，嘌呤與嘧啶之間的顛換如AC、AT、GC、GT之間的匹配）給出不 同的打分，從而以各部分匹配分數(shù)的總和決定整體的相似程度，進而衡量結(jié)合效果。而寡核 苷酸雜交過程是一種生物化學反應，分子之間相互作用并非是匹配了多少個堿基，而依賴 于是否能夠在包含了溫度、鹽離子濃度、pH值等復雜的熱力學環(huán)境下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。 因此寡核苷酸結(jié)合的本質(zhì)是一個熱力學的穩(wěn)定性過程而不是序列比對。因此，BLAST中對 于AT、GC之間匹配賦予一致的打分就不能反應GC之間由于三個氫鍵的連接穩(wěn)定性高于AT 之間的兩個氫鍵的結(jié)合能力這一事實。并且某些錯配結(jié)構(gòu)在熱力學結(jié)合能力上表現(xiàn)穩(wěn)定， 而BLAST統(tǒng)一給予相同的罰分處理容易導致對這些結(jié)合位點喪失預測能力。
[0006] 同時寡核苷酸雜交狀態(tài)會呈現(xiàn)多種模式，除了最穩(wěn)定的狀態(tài)完美匹配之外，在多 數(shù)情況下，結(jié)合雙鏈中也會出現(xiàn)錯配、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、內(nèi)環(huán)、膨脹環(huán)等復雜結(jié)構(gòu)。BLAST算法自身 的局限性使得只能對其中的一部分結(jié)構(gòu)進行預測，只允許序列中段少數(shù)幾個堿基的錯配， 致使相當一部分結(jié)構(gòu)的丟失，而對于末端錯配、loop、hairpin等復雜結(jié)構(gòu)束手無策。
[0007] 最近鄰模型（Nearest-Neighbor Model,簡稱NN model或最臨近法模型）是廣為 流行和應用的最可靠的熱力學計算方法，該模型指出一個給定的堿基對的穩(wěn)定性依賴于其 臨近堿基對的穩(wěn)定性，其主要思想是將DNA分子雜交反應過程的標準焓變和熵變計算轉(zhuǎn)化 為由組成DNA分子的4個堿基A、T、G、C所形成的10個二聚體（duplex)的標準焓變和熵 變的累加和。然而對設計的寡核苷酸序列與其結(jié)合序列雜交的熱力學穩(wěn)定性的計算，現(xiàn)有 技術中通常將該方法應用于從前至后逐一堿基的計算，即遍歷的思路，運算復雜，搜索過程 緩慢且效率較低。
[0008] 因此，需要一種高效的，能真正反映寡核苷酸結(jié)合熱力學性質(zhì)的方法和系統(tǒng)，來確 定設計的寡核苷酸在目標序列上的結(jié)合位點以及結(jié)合穩(wěn)定性，進而判斷該寡核苷酸是否為 針對該目標序列的高質(zhì)量寡核苷酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供一種推斷寡核苷酸在基因組上結(jié)合位點的方法。通過構(gòu)建任意7-mer 寡核苷酸的熱力學信息的索引表，利用所述索引表獲取待推斷寡核苷酸在熱力學上穩(wěn)定的 結(jié)合序列，并在基因組上定位該結(jié)合序列的位置，能高效地實現(xiàn)對待推斷寡核苷酸結(jié)合位 點的推斷，進而為判斷該寡核苷酸是否為針對該基因組中目標序列的高質(zhì)量寡核苷酸提供 依據(jù)。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種推斷寡核苷酸在基因組上結(jié)合位點的系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用上述 方法能高效地從熱力學性質(zhì)上反映寡核苷酸與基因組中目標序列結(jié)合的真實情況，能為待 推斷寡核苷酸質(zhì)量判斷提供準確依據(jù)。
[0011] 本發(fā)明提供的一種推斷寡核苷酸在基因組上結(jié)合位點的方法，包括：
[0012] 構(gòu)建任意7-mer寡核苷酸的熱力學信息的索引表，所述熱力學信息為所述寡核苷 酸與其所有結(jié)合序列兩兩雜交的信息，包括雜交結(jié)構(gòu)、雜交序列、焓、熵以及自由能；
[0013] 利用所述索引表獲取待推斷寡核苷酸的熱力學信息，并在獲得的熱力學信息基礎 上確定在熱力學上穩(wěn)定的結(jié)合序列；
[0014] 在基因組上尋找所述結(jié)合序列，并定位其在基因組上的位置。
[0015] 在本發(fā)明的方案中，所述基因組可以為從生物體中提取獲得的基因組。進一步的， 該基因組可以是經(jīng)本領域現(xiàn)有方法例如測序等獲知其序列的基因組。因此，本發(fā)明的方法 還可以包括從生物體中提取基因組，以及獲得該基因組序列的步驟。所述生物體例如可以 是動物、細菌、植物、真菌等。所述待推斷寡核苷酸例如可以是針對該基因組設計的探針或 引物，設計方法可以為本領域常規(guī)的探針或引物設計方法。
[0016] 在本發(fā)明的方案中，構(gòu)建任意7-mer寡核苷酸的熱力學信息索引表，目的在于快 速獲取待推斷寡核苷酸的熱力學信息；索引表中寡核苷酸長度取7,是通過比較不同長度 的寡核苷酸（從3~12)，然后綜合考慮存儲空間和計算效率后確定的。任意7-mer寡核 苷酸包括4 7條寡核苷酸序列。對于各7-mer寡核苷酸，當其與結(jié)合序列雜交時，7-mer寡核 苷酸上的任一堿基（如A)都會在結(jié)合序列中遇到五種情況（1'4、6工、-;其中1'表示匹配， 其余三個堿基表示錯配，表示空位gap即沒有匹配上，從而產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)），因此理論上 其應該具有57條結(jié)合序列，受可計算的熱力學參數(shù)限制，實際上進行熱力學評估的結(jié)合序 列要少于上述值。在構(gòu)建任意7-mer寡核苷酸的熱力學信息的索引表過程中，不限定雜交 雙鏈上最大錯配和未匹配的數(shù)目，利用最近鄰方法和實驗驗證的所有可靠的熱力學參數(shù)計 算出任意7-mer序列（純堿基組成，不含空位結(jié)構(gòu)）與其所有結(jié)合序列（可能含有空位結(jié) 構(gòu)）兩兩雜交的熱力學數(shù)據(jù)包括雜交結(jié)構(gòu)、雜交序列、焓、熵以及自由能。所述雜交結(jié)構(gòu)包 括完美匹配的二聚體結(jié)構(gòu)和非完美匹配結(jié)構(gòu)。
[0017] 在本發(fā)明的另一個【具體實施方式】中，利用所述索引表獲取待推斷寡核苷酸的熱力 學信息，并在獲得的熱力學信息基礎上確定在熱力學上穩(wěn)定的結(jié)合序列包括：
[0018] 將待推斷寡核苷酸以7-mer的長度自5'端方向至3'端進行分割，得到長度為 7-mer的寡核苷酸片段和/或長度小于7-mer的寡核苷酸片段；
[0019] 對于長度為7-mer的寡核苷酸片段，其熱力學信息通過查找上述索引表獲得，對 于長度小于7-mer的寡核苷酸片段，其熱力學信息通過重新構(gòu)建獲得；
[0020] 將各分割得到的寡核苷酸片段的熱力學信息進行組合，并將每個組合中的各項熱 力學信息進行加和，得到待推斷寡核苷酸的熱力學信息；
[0021] 根據(jù)待推斷寡核苷酸的熱力學信息中的自由能的大小，確定所述待推斷寡核苷酸 在熱力學上穩(wěn)定的結(jié)合序列。
[0022] 在本發(fā)明的方案中，熱力學上穩(wěn)定的結(jié)合序列，以-llkcal/mol作為雜交雙鏈呈 現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)的默認閾值（這是根據(jù)以往研究經(jīng)驗以及文獻信息而得到的閾值，用戶可以 根據(jù)實際情況進行調(diào)整），與所述寡核苷酸雜交后自由能在-llkcal/mol (即絕對值大于 llkcal/mol)以下的結(jié)合序列認為是所述寡核苷酸在熱力學上穩(wěn)定的結(jié)合序列。
[0023] 在本發(fā)明的另一個【具體實施方式】中，在基因組上尋找所述結(jié)合序列，并定位它們 在基因組上的位置包括：
[0024] 根據(jù)已有的9-mer索引算法構(gòu)建基因組中任意9-mer序列，從5'端至3'端方向， 在正義鏈和反義鏈的位置信息，
[0025] 在基因組上定位已獲得的待推斷寡核苷酸在熱力學上穩(wěn)定的結(jié)合序列。