一種提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物細(xì)胞壁主要由纖維素（cellulose)、半纖維素（hemicellulose)和木質(zhì)素 (lignin)組成。其中，纖維素作為構(gòu)建細(xì)胞壁的主要成分，是一種由8, 000-10, 000個葡萄 糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而形成的天然線性大分子聚合物，以纖維二糖為其基本單元。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前每年至少有7X1011噸纖維素多糖產(chǎn)生，大量存在于植物細(xì)胞壁中。因此植物 細(xì)胞壁是地球上數(shù)量最多的可再生資源，是生產(chǎn)可再生生物燃料的理想原料。而將植物細(xì) 胞壁中的纖維素多糖降解為可發(fā)酵的簡單寡糖和單糖如葡萄糖需要復(fù)雜的纖維素酶酶系 協(xié)同作用。
[0003] 絲狀真菌是工業(yè)應(yīng)用上生產(chǎn)許多酶和有機(jī)代謝物的一類主要的微生物。其中，里 氏木霉具有強(qiáng)大的分泌纖維素酶的能力。工業(yè)上，經(jīng)改造后的里氏木霉，其產(chǎn)纖維素酶的 產(chǎn)量可達(dá)到l〇〇g/L以上，因此，在降解植物細(xì)胞壁多糖以及相關(guān)應(yīng)用上具有重要的應(yīng)用價 值。
[0004] 里氏木霉的纖維素酶系包括兩個外切纖維素酶、五個內(nèi)切纖維素酶、一個葡 萄糖苷酶和三個裂解性多糖單加氧酶（lyticpolysaccharidesmonooxygenases,LPMOs， 即原GH61家族成員）。其中，外切葡聚糖酶主要作用于纖維素線狀分子的末端，水解β-1，4 糖苷鍵，從還原末端（CBH1)或非還原末端（CBH2)進(jìn)行水解，產(chǎn)生纖維二糖；內(nèi)切葡聚糖酶 作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4糖苷鍵產(chǎn)生不同長度的寡糖鏈和新 的還原和非還原糖鏈末端；β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase,EC3. 2. 1. 21)的作用是水 解纖維二糖及低分子量的纖維寡糖生成葡萄糖。
[0005] 里氏木霉的胞外纖維素酶系統(tǒng)由60 %~80 %的外切葡聚糖苷酶，20 %~36 %的 內(nèi)切葡聚糖苷酶和1%的葡萄糖苷酶組成，這些酶協(xié)同作用將纖維素類物質(zhì)轉(zhuǎn)換成葡 萄糖。在纖維素降解過程中，所生成的纖維二糖或寡糖的積累會抑制外切纖維素酶和內(nèi)切 纖維素酶的活性，而β-葡萄糖苷酶能夠從非還原端將上述二者作用形成的纖維二糖或纖 維寡糖水解，最終形成葡萄糖，是纖維素降解過程中關(guān)鍵的限速酶，這也是高效利用纖維物 質(zhì)的關(guān)鍵。
[0006] 里氏木霉的胞外β-葡萄糖苷酶僅占其纖維素酶系的1%，并且其活性相對較低， 從而也限制著纖維素的有效利用。因此在里氏木霉中表達(dá)具有較高活性的葡萄糖苷 酶，增加其在纖維素酶系中的含量，就可能提高纖維素酶系的整體活性，從而提高其對纖維 素的降解效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種提高里氏木霉所分泌纖維素酶酶活的方法。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的提高里氏木霉所分泌纖維素酶酶活的方法包括在里氏木霉中表達(dá) 外源的來自嗜熱真菌Neosartoryafischeri P1的、具有較強(qiáng)活性的β-葡萄糖苷酶基因(NfBgl3A)的步驟。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的提高里氏木霉所分泌纖維素酶酶活的方法，以PRS424為模板， 將cbhl啟動子、cbhl基因片段、NfBgl3A基因片段和cbhl終止子串聯(lián)拼接，構(gòu)建過表達(dá) NfBgl3A基因的重組質(zhì)粒。
[0010] 其中，cbhl啟動子的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示：
[0012] cbhl基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示：


[0018] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，設(shè)計(jì)引物，從里氏木霉TU-6的基因組DNA中擴(kuò)增 cbhl啟動子片段、cbhl基因片段和cbhl終止子片段，以及從嗜熱真菌N.fischeriP1中擴(kuò) 增β-葡萄糖苷酶基因片段（NfBgl3A)，同時將pRS424質(zhì)粒載體進(jìn)行EcoRI的酶切，電泳 回收這五個片段。將這五個片段同時轉(zhuǎn)化釀酒酵母A109菌株，由于在引物設(shè)計(jì)時，加入了 末端的互補(bǔ)序列，因此PRS424和這五個外源片段可以通過釀酒酵母的體內(nèi)重組無縫拼接 起來。挑取篩選平板上的陽性克隆，通過PCR及質(zhì)粒測序的方法驗(yàn)證這五個外源片段的插 入。將重組轉(zhuǎn)化子接種于土豆培養(yǎng)基平板上產(chǎn)孢，將IX1〇7孢子接種到l〇〇ml以葡萄糖作 為唯一碳源的MM-glucose培養(yǎng)基中，并于30°C，180rpm培養(yǎng)1天。將菌絲過濾、無菌水洗 滌并轉(zhuǎn)移至l〇〇ml以微晶纖維素Avicel做唯一碳源的MM_Avicel培養(yǎng)基中，繼續(xù)于30°C， 180rpm培養(yǎng)7天。
[0019] 本發(fā)明通過在里氏木霉中表達(dá)異源葡萄糖苷酶，獲得了纖維素酶酶活顯著提 高的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子在MM-Avicel中培養(yǎng)6天后，其纖維素酶的濾紙酶活0. 18U/ml，較出發(fā) 菌株分別提高了 3. 7倍。CMC酶活0. 40U/ml，較出發(fā)菌株分別提高了 2. 9倍。
【附圖說明】
[0020] 圖 1 顯示pRS424-cbhl-NfBgl3A質(zhì)粒構(gòu)建；
[0021] 圖2顯示PCR鑒定pRS424-cbhl-NfBgl3A質(zhì)粒在里氏木霉基因組中的插入，M:DNA 分子量；1-10 :轉(zhuǎn)化子1-10 ;
[0022] 圖3顯示.轉(zhuǎn)化子搖瓶發(fā)酵液的纖維素酶酶活測定，A:濾紙酶酶活；B:外切纖維 素酶酶活；c:CMC(內(nèi)切纖維素酶）酶活；D:β-葡萄糖苷酶酶活；
[0023] 圖4顯示轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1構(gòu)建表達(dá)N.fischeriP1來源β-葡萄糖苷酶的重組質(zhì)粒 pRS424-cbhl-NfBgl3A
[0025] 構(gòu)建pRS424-cbhl-NfBgl3A，經(jīng)轉(zhuǎn)入里氏木霉中，在cbhl啟動子的驅(qū)動下，轉(zhuǎn)錄出 mRNA，并翻譯成CBHl-NfBgl3A融合蛋白。在CBH1和NfBgl3A二者之間設(shè)計(jì)有Kex2蛋白酶 的識別位點(diǎn)RDKR序列，因此，融合蛋白被Kex2識別并切割，從而最終得到游離的CBH1和 β-葡萄糖苷酶（NfBgl3A)。
[0026]pRS424-cbhl-NfBgl3A的質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如圖1所示。
[0027] cbhl啟動子的擴(kuò)增
[0028] 以里氏木霉Tu-6 的基因組DNA為模板，以TrcbhlpF(5' -TGAGCGCGCGTAATACGA CTCACTATAGGGCGAATTGATATCTAGAGTTGTGAAGTCGG-3'）和TrcbhlpR(5'-GCACAATACGACTCCGG CGCTGGCCGATGCGCAGTCCGCGGTTGACTATT-3'）為引物對cbhl啟動子進(jìn)行擴(kuò)增。
[0029]PCR反應(yīng)條件為：95°CX5min預(yù)變性；94°CX30s，55°CX30s，72°CXlmin，32 個 循環(huán)；72°CX10min;4°C保存。在1%瓊脂糖膠上電泳，切下PCR產(chǎn)物中的目的條帶，純化 DNA〇
[0030] cbhl結(jié)構(gòu)基_的擴(kuò)增
[0031]以里氏木霉Tu-6 的基因組DNA為模板，以TrCBHIF(5'-CCCAATAGTCAACCGCGGACTG CGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCC-3'）和TrCBHlR(5'-CACCAGAACCGTAGCGCTTGTCG CGCTCGAGCAGGCACTGAGAGTAGTAAGGGTTCAGG-3'）為引物對cbhl結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行擴(kuò)增。
[0032]PCR反應(yīng)條件為：95°CX5min;94°CX30s，55°CX30s，72°CXlmin，32 個循環(huán)； 72°CX10min;4°C保存。在1%瓊脂糖膠上電泳，切下PCR產(chǎn)物中的目的條帶，純化DNA。
[0033]NfBgl3A基通放
[0034]以嗜熱真菌N.fischeriP1 的基因組DNA為模板，以NfBgl3AF(5'-TTACTACTCTCA GTGCCTGCTCGAGCGCGACAAGCGCTACGGTTCTGGTGGCAGCAACTGGGATC-3'）和NfBgl3AR(5'-TACGG GCTCACCAAGAATCTACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCCACGGAGCTTCACCATCCGCGACGGACCCTGAAAGAG-3'） 為引物對NfBgl3A基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。
[0035]PCR反應(yīng)條件為：95°CX5min;94°CX30s，55CX30s，72°CXlmin，32 個循環(huán)； 72°CX10min;4°C保存。在1%瓊脂糖膠上電泳，切下PCR產(chǎn)物中的目的條帶，純化DNA。
[0036] cbhl終丨卜.子的擴(kuò)增
[0037]以里氏木霉Tu-6 的基因組DNA為模板，以TrcbhltF(5'-ACCACCACCACCACCACTAACT CGAGAGCTCCGTGGCGAAAGCCTGACGCACCGG-3')和TrcbhltR(5'-CCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGA ACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGGCGGCCGCAACACTTCGGTGGAGGTGTCGAGTACG-3'）為引物對cbhl 基因終止子進(jìn)行擴(kuò)增。
[0038] PCR反應(yīng)條件為：95°CX5min;94°CX30s，55°CX30s，72°CXlmin，32 個循環(huán)； 72°CX10min;4°C保存。在1%瓊脂糖膠上電泳，切下PCR產(chǎn)物中的目的條帶，純化DNA。
[0039]DRS424-cbhl-NfBgl3A質(zhì)粒的構(gòu)律
[0040] 將pRS424質(zhì)粒用EcoRI酶切，電泳、回收線性化質(zhì)粒載體。將其和cbhl啟動子、 cbhl結(jié)構(gòu)基因、NfBgl3A基因片段和cbhl終止子的DNA片段按1:1:2:1的摩爾比，用氯化 鋰法共同轉(zhuǎn)化釀酒酵母A109的感受態(tài)細(xì)胞，涂布在SD-Trp培養(yǎng)基上，30°C靜置培養(yǎng)48h。 對平板上長出的酵母菌落做菌落PCR，以鑒定三個片段是否已經(jīng)連接到pRS424上。將PCR 鑒定為陽性的酵母菌落挑取并接種于3mlYH)培養(yǎng)基上，30°C、180rpm振搖培養(yǎng)過夜，提取 質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transl感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100μg/ml的LB瓊脂平板 上，37°C靜置培養(yǎng)16h。挑取單克隆菌落，接種于3mlLB培養(yǎng)基（含100μg/ml氨芐）中， 37°C、180rpm振搖培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，備用于轉(zhuǎn)化。
[0041] 實(shí)施例2.將pRS424-cbhl-NfBgl3A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入里氏木霉
[0042] Dvr4基_表汰盒DNA的準(zhǔn)備
[0043] 從里氏木霉QM9414的基因組DNA中PCR擴(kuò)增pyr4基因表達(dá)盒，在1 %瓊 脂糖膠上電泳，切下PCR產(chǎn)物中的目的條帶，純化DNA備用。所用引物為：Ppyr4f: 5' -GACTAGACTGACCCCCCCGGTTGGG-3' 和Ppyr4r:5'-CAACTGCATCCAAACCATCCTACC-3'。
[0044] PCR反應(yīng)條件為：95°CX5min;94°CX30s，55°CX30s，72