專(zhuān)利名稱：一種Ⅳ型膠原酶含量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定人體血漿、血清中IV型膠原酶含量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
IV型膠原酶是生物體內(nèi)重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，又稱基底膜性膠原酶，在細(xì)胞遷移、創(chuàng)傷修復(fù)、惡性腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要的病理生理作用。目前研究表明， 血漿IV型膠原酶含量的異常增高常與心臟衰竭、肺氣腫、自身免疫性疾病、腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等重大疾病密切相關(guān)。為了更廣泛的研究IV型膠原酶的病理生理作用， 建立快捷、精確、低成本、高通量的檢測(cè)方法具有重要意義。
目前檢測(cè)血漿IV型膠原酶活性的方法主要有3種底物膠電泳酶譜法、ELISA和 HPLC。底物膠電泳酶譜法分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)天，分析步驟復(fù)雜。ELISA法雖具有特異性、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，但所需標(biāo)記抗體成本高，試劑盒昂貴，測(cè)定出的酶含量不能表現(xiàn)出酶的生物學(xué)活性，同時(shí)分析速度慢。HPLC雖具有分析速度快，定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但方法特異性差，不能進(jìn)行大樣本同時(shí)檢測(cè)，難以滿足臨床檢測(cè)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決上述問(wèn)題而提供了一種IV型膠原酶含量測(cè)定方法，利用該方法可以準(zhǔn)確、快速的測(cè)定到人體血漿或血清中IV型膠原酶的含量。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種IV型膠原酶含量測(cè)定方法，包括以下步驟
a)分別準(zhǔn)備空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品管；首先向空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品加入底物溶液，所述底物溶液為5mg/ml 10mg/ml琥珀酰明膠；接著向空白管中加入樣品稀釋液，向標(biāo)準(zhǔn)管中加入標(biāo)準(zhǔn)品，向待測(cè)樣品管中加入待測(cè)樣品，所述樣品稀釋液為體積百分比為 40mmol/l 60mmol/lTris 緩沖液、5mmol/l 15mmol/lCaCl2、10 μ mol/1 20ymol/ IZnCl2以及質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 05% 0. 1%月桂醇聚氧乙烯醚混合而成，所述標(biāo)準(zhǔn)品為已知濃度的IV型膠原酶；最后向標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品管中加入樣品稀釋液，在35°C 45°C水浴反應(yīng) 30 120分鐘；
b)在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品管中加入終止液終止酶切反應(yīng)，再加入檢測(cè)溶液A和檢測(cè)溶液B，最后加入檢測(cè)稀釋液，在35°C 45°C水浴下顯色反應(yīng)30 60分鐘，使其顯色反應(yīng)充分進(jìn)行，所述終止液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 05% 0. 2%HCL,檢測(cè)溶液A為0. IM 0. 5MNaOH,檢測(cè)溶液B為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 01% 0. 05%三硝基苯磺酸，檢測(cè)稀釋液為雙蒸水；
c)各管冷卻至室溫后，取各管溶液至酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度；
d)以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)定出的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的待測(cè)樣品的IV型膠原酶含量；或者用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與吸光度值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，將待測(cè)樣品的吸光度值代入方程，計(jì)算出待測(cè)樣品的IV型膠原酶含量。
優(yōu)選地，所述標(biāo)準(zhǔn)管的數(shù)量至少為六個(gè)。
進(jìn)一步地，所述待測(cè)樣品為血清或血漿。
優(yōu)選地，所述酶標(biāo)儀在400nm 440nm處測(cè)定吸光度。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明利用IV型膠原酶具有水解明膠的特異性結(jié)合位點(diǎn)，而血漿中存在的其它基質(zhì)金屬蛋白酶難以水解明膠，采用TNBS對(duì)明膠的水解產(chǎn)物進(jìn)行顯色，可以對(duì)人體血漿和血清中的IV型膠原酶進(jìn)行特異性的定量分析。該測(cè)定方法以琥珀酰明膠作為酶切底物，采用TNBS 顯色劑對(duì)酶切產(chǎn)生的末端氨基顯色，TNBS與末端氨基結(jié)合的情況下顏色變黃，顏色的深淺和樣品中的IV型膠原酶含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度。 本方法可以快速、準(zhǔn)確的測(cè)定出人體血漿或血清中IV型膠原酶的含量，且測(cè)量結(jié)果直接體現(xiàn)出血漿當(dāng)中具有活性意義的IV型膠原酶含量，無(wú)需再進(jìn)一步檢測(cè)抑制物的含量。


圖1為實(shí)施例1 IV型膠原酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖2為健康人血漿IV型膠原酶含量分布圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 本實(shí)施例來(lái)測(cè)定一個(gè)血清樣本的IV型膠原酶含量。首先對(duì)待測(cè)血樣進(jìn)行處理，將全血標(biāo)本2500轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20°c或-80°c保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。需要注意的是血清在檢測(cè)前應(yīng)稀釋8倍再做檢測(cè)，在置4°C保存應(yīng)小于1周，-20 V或-80 V均應(yīng)密封保存，-20 V或-80 V不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
接著開(kāi)始對(duì)血清樣本進(jìn)行的IV型膠原酶含量進(jìn)行測(cè)定，在測(cè)定前請(qǐng)?zhí)崆芭渲坪盟性噭?。試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 如樣品濃度過(guò)高時(shí)，均應(yīng)用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)允箻悠贩蠝y(cè)定方法的檢測(cè)范圍。
第一步分別準(zhǔn)備空白管一個(gè)、標(biāo)準(zhǔn)管六個(gè)和待測(cè)樣品管一個(gè)，向空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品加入15 μ 1底物溶液，底物溶液為8mg/ml的琥珀酰明膠；向空白管中加入 185ul樣品稀釋液，向標(biāo)準(zhǔn)管中加入20ul標(biāo)準(zhǔn)品，向待測(cè)樣品管中加入20ul待測(cè)樣品；樣品稀釋液為體積百分比為50mmol/lTris緩沖液、10mmol/lCaCl2、100 μ mol/lZnCl2以及質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 05%月桂醇聚氧乙烯醚混合而成，標(biāo)準(zhǔn)品為已知濃度的IV型膠原酶，臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為 10mg/ml，做系列稀釋后，分別稀釋成 1. 5mg/L、3mg/L、5mg/L、7mg/L、8. 5mg/L、10mg/L，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度，臨用前15分鐘內(nèi)配制；向標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品管中加入165ul 樣品稀釋液，在37°C水浴反應(yīng)30分鐘；為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。第二步在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品管中加入20 μ 1終止液終止酶切反應(yīng)，再加入20 μ 1檢測(cè)溶液A和20 μ 1檢測(cè)溶液B，最后加入140 μ 1檢測(cè)稀釋液，在40°C水浴下顯色反應(yīng)30分鐘，使其顯色反應(yīng)充分進(jìn)行；終止液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 1%HCL,檢測(cè)溶液A為 0. 2MNa0H，檢測(cè)溶液B為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 025%三硝基苯磺酸，檢測(cè)稀釋液為雙蒸水。第三步各管冷卻至室溫后，取各管溶液取150μ 1至酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀在405nm處測(cè)定吸光度。第四步以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(X坐標(biāo))，測(cè)定出的吸光度值為縱坐標(biāo)(Y坐標(biāo))，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。待測(cè)樣品的吸光度值為0. 563，根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的值5. 707，再乘以稀釋倍數(shù)8即為待測(cè)樣品的IV型膠原酶含量為 45. 656mg/L。
或者用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與吸光度值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，該回歸方程為 Y=O. 0898X+0. 0507，R2=O. 9993，Ρ<0· 01，線性范圍 1. 5 10. Omg/L,將待測(cè)樣品的吸光度值代入方程，0. 563=0. 0898X+0. 0507，X=5. 707計(jì)算出待測(cè)樣品的IV型膠原酶含量 8XX=8X5. 707=45. 656mg/L。
實(shí)施例2 利用本發(fā)明的方法，本實(shí)施例測(cè)定112名健康人血漿IV型膠原酶含量， 其含量范圍31. 51 49. 99mg/L，平均值41. 59mg/L，標(biāo)準(zhǔn)差4. 19mg/L。統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)健康人血漿IV型膠原酶含量服從正態(tài)分布，因此由—χ 士 1. 965得出雙側(cè)95%的界限值為33. 38
49. 80mg/L。該112名健康人血漿IV型膠原酶含量分布圖如圖2所示。
最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種IV型膠原酶含量測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟a)分別準(zhǔn)備空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品管；首先向空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品加入底 物溶液，所述底物溶液為5mg/ml 10mg/ml琥珀酰明膠；接著向空白管中加入樣品稀釋 液，向標(biāo)準(zhǔn)管中加入標(biāo)準(zhǔn)品，向待測(cè)樣品管中加入待測(cè)樣品，所述樣品稀釋液為體積百分比 為 40mmol/l 60mmol/lTris 緩沖液、5mmol/l 15mmol/lCaCl2、10 μ mol/1 20ymol/ IZnCl2以及質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 05% 0. 1%月桂醇聚氧乙烯醚混合而成，所述標(biāo)準(zhǔn)品為已知濃 度的IV型膠原酶；最后向標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品管中加入樣品稀釋液，在35°C 45°C水浴反應(yīng) 30 120分鐘； b)在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和待測(cè)樣品管中加入終止液終止酶切反應(yīng)，再加入檢測(cè)溶液A和 檢測(cè)溶液B，最后加入檢測(cè)稀釋液，在35°C 45°C水浴下顯色反應(yīng)30 60分鐘，使其顯 色反應(yīng)充分進(jìn)行，所述終止液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 05% 0. 2%HCL,檢測(cè)溶液A為0. IM 0. 5MNaOH,檢測(cè)溶液B為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 01% 0. 05%三硝基苯磺酸，檢測(cè)稀釋液為雙蒸 水；c)各管冷卻至室溫后，取各管溶液至酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度；d)以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)定出的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè) 樣品的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的待測(cè)樣品的IV型膠原酶含量；或者用標(biāo)準(zhǔn)物的濃 度與吸光度值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，將待測(cè)樣品的吸光度值代入方程，計(jì)算出待測(cè)樣品的 IV型膠原酶含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IV型膠原酶含量測(cè)定方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)管的數(shù)量 至少為六個(gè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IV型膠原酶含量測(cè)定方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品為血 清或血漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的IV型膠原酶含量測(cè)定方法，其特征在于，所述酶 標(biāo)儀在400nm 440nm處測(cè)定吸光度。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種Ⅳ型膠原酶含量測(cè)定方法，涉及一種測(cè)定人體血漿、血清中Ⅳ型膠原酶含量的測(cè)定方法。該方法利用Ⅳ型膠原酶具有水解明膠的特異性結(jié)合位點(diǎn)，而血漿中存在的其它基質(zhì)金屬蛋白酶難以水解明膠，采用TNBS對(duì)明膠的水解產(chǎn)物進(jìn)行顯色，可以對(duì)人體血漿活血清中的Ⅳ型膠原酶進(jìn)行特異性的定量分析。本發(fā)明能夠準(zhǔn)確、快速的測(cè)定到人體血漿或血清中Ⅳ型膠原酶的含量。
文檔編號(hào)G01N21/78GK101846632SQ20101020154
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者凌青, 余謹(jǐn), 趙云斌 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)