技術領域

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種雙基因干擾提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法。

背景技術：

里氏木霉纖維素酶是一種廣泛應用的酶類，里氏木霉具有胞外表達酶量大等優(yōu)點，是工業(yè)生產(chǎn)酶制劑中廣泛應用的菌種。里氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶酶系組成中，葡糖苷酶的活力相對較低。已有的提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法是通過基因工程的手段導入纖維素葡糖苷酶基因，提高葡糖苷酶的酶活；或者敲除某一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，從而提高纖維素酶蛋白的分泌量。目前這些方法中，每次只能剔除一個基因或增強一個基因的表達。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種雙基因干擾提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法，以及通過該方法得到的里氏木霉菌株。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：

一種雙基因干擾提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法，為通過RNAi降低里氏木霉木聚糖酶基因、纖維素內(nèi)切酶基因的表達，提高里氏木霉纖維素酶酶活。

優(yōu)選的，所述的雙基因干擾提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法，包括如下步驟：

（1）將兩端有限制性內(nèi)切酶識別位點且含有SEQ ID NO.1所示序列的干擾片段通過相應限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶構(gòu)建到pSilent-1上。

（2）將步驟（1）構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化到里氏木霉中，轉(zhuǎn)化有重組載體的里氏木霉纖維素酶酶活得到提高。

步驟（1）中所述的限制性內(nèi)切酶優(yōu)選為SnaBI和ApaI。

步驟（2）優(yōu)選通過農(nóng)桿菌將所構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化到里氏木霉中。

步驟（2）中所述的里氏木霉優(yōu)選為里氏木霉ATCC24449。

一種里氏木霉菌株，為上述轉(zhuǎn)化有重組載體的里氏木霉。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果：本發(fā)明通過RNAi干擾序列的合理設計，不僅顯著降低木聚糖酶的表達（不表達），而且還適度降低纖維素內(nèi)切酶的表達、增強葡糖苷酶的表達，優(yōu)化了纖維素酶酶系中三種酶的活性比例，提高了里氏木霉纖維素酶酶活。木聚糖酶表達的消失也有利于葡糖苷酶表達量的增加和纖維素酶的純化。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

1、材料

里氏木霉ATCC24449，質(zhì)粒pSilent-1（Biovector），農(nóng)桿菌EHA105，大腸桿菌DH5α，限制性內(nèi)切酶（TakaRA）等。

合成的兩端有SnaBI、ApaI酶切位點的干擾片段1（SEQ ID NO.1），序列組成為：GGTACGTA（SnaBI酶切位點序列）-木聚糖酶mRNA互補片段1序列（SEQ ID NO.2）-纖維素內(nèi)切酶mRNA互補片段序列（SEQ ID NO.4）-內(nèi)含子片段序列（SEQ ID NO.6）-纖維素內(nèi)切酶mRNA互補片段的反義序列（SEQ ID NO.7）-木聚糖酶mRNA互補片段1的反義序列（SEQ ID NO.9）- GGGCCCGG（ApaI酶切位點序列）。

2、方法

一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

（1）質(zhì)粒pSilent-1的提取

含有pSilent-1的大腸桿菌DH5α接種到含有氨芐霉素的LB培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基：氯化鈉1%，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，121℃滅菌20min，加入微孔過濾的氨芐霉素，氨芐霉素在LB中的終濃度為30μg/mL）中，35℃培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司，DP103）按照說明書說明提取pSilent-1質(zhì)粒，提取步驟如下：

使用前請先在漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標簽。

1）柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（13400×g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

2）取2mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機，12000rpm（13400×g）離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。

3）向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。

4）向離心管中加入250μL溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。

5）向離心管中加入350μL溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm（13400×g）離心10min。

6）將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意盡量不要吸出沉淀。12000rpm（13400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

7）可選步驟：向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm（13400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒DNA，推薦采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），這步可省略。

8）向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm（13400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

9）重復操作步驟8）。

10）將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm（13400×g）離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

11）將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100μL洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm（13400×g）離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

注意：洗脫緩沖液體積不應少于50μL，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若后續(xù)做測序，需使用ddH₂O做洗脫液，并保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。且DNA產(chǎn)物應保存在-20℃，以防DNA降解。為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm（13400×g）離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

（2）質(zhì)粒pSilent-1、干擾片段1的酶切和電泳

往41μL pSilent-1質(zhì)粒溶液或干擾片段1溶液中加入2μL SnaBI、2μL ApaI和5μL酶切緩沖液，總體積為50.0μL，在30℃酶切2h。使用瓊脂糖凝膠電泳試劑盒（上海一基實業(yè)有限公司）進行電泳。

1）打開試劑盒，依照說明書清點各種試劑，并按實驗需要量將50×電泳緩沖液稀釋為1×電泳緩沖液待用；將核酸熒光染料與6×Loading Buffer按1:1比例混合備用。

2）把U型凝膠托盤放入制膠槽中，插好梳子，置于一水平面上。

3）將0.25g瓊脂糖加到盛有適當體積1×電泳緩沖液的三角瓶或玻璃瓶中（常用凝膠濃度0.8-1.2%）。

4）將瓶口用封口膜輕輕蓋住，在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖完全熔化（熔化到?jīng)]有小顆粒物為止）。

5）將溫熱的凝膠溶液倒入U型凝膠托盤中（超過二分之一處）。

6）將凝膠室溫放置15-30min完全冷卻至凝固，小心拔除梳子，將凝膠托盤移入電泳槽，梳井（點樣孔）一端朝負極方向，加入1×電泳緩沖液，使凝膠全部被浸沒。

7）將樣品與6×Loading Buffer和核酸熒光染料充分混合（20μL樣品+1μL 6×Loading Buffer+1μL核酸熒光染料），用微量移液器將以上混合物緩慢加入梳井內(nèi)，注意避免引入氣泡。

8）蓋上電泳槽蓋，樣品應向陽極（紅色插頭）泳動，提供5-10V/cm的電壓。

9）當樣品與染料在凝膠中遷移到足夠距離時，關上電源，拔出電極插頭和打開電泳槽蓋，在DNA電泳圖譜觀察儀中觀察核酸條帶。

（3）膠回收

使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收質(zhì)粒pSilent-1、干擾片段1的酶切、電泳產(chǎn)物。

1）從瓊脂糖凝膠中割下含目的條帶的膠塊，稱重。

2）加入膠塊重量3-6倍的Buffer B2，50℃水浴5-10分鐘溶膠。

3）選做，對于<500bp的片段，加入1/3 Buffer B2體積的異丙醇。

4）將溶膠液移入吸附柱中，8000×g離心30秒。倒掉收集管中液體。

5）加入500μL Wash Solution，9000×g離心30秒，倒掉收集管中液體。

6）重復步驟5）一次。

7）空吸附柱于9000×g離心1分鐘。

8）將吸附柱放入一個干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入15-40μL Elution Buffer，室溫靜置1分鐘后，離心1分鐘。保存管中DNA溶液。

（4）質(zhì)粒pSilent-1和干擾片段1的連接

使用DNA Ligation Kit Ver.2.1（Takara）進行連接。

1）將酶切的質(zhì)粒pSilent-1與酶切的干擾片段1混合制備成體積為10μL的DNA溶液，質(zhì)粒和干擾片段的體積比為1:3。

2）向上述DNA溶液中加入等體積的 Solution I，充分混勻。

3）16℃反應12h。

（5）大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和篩選

1）從-80℃冰箱中取100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞懸液，冰上溶解10分鐘。

2）取10μL上述連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞中，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。

3）42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻2分鐘。

4）加入890μL LB 液體培養(yǎng)基（不含Amp），混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）。

5）將上述菌液搖勻后取100μL 涂布于含Amp的LB篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24小時。

大腸桿菌轉(zhuǎn)化子長出后挑取部分轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)12-16-小時后，提質(zhì)粒驗證，驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pSilent-RNAi-1。

二、農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化里氏木霉及里氏木霉轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵

（1）農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備

1）在新活化的農(nóng)桿菌EHA105的LB平板（LB液體培養(yǎng)基添加5%瓊脂）上，挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基。

2）28℃、220r/min振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀達到0.6-0.7。

3）取1.5mL無菌離心管，每管分裝1mL菌液，6000r/min離心10min。

4）去除上清，用1mL 10%無菌甘油重懸菌體，6000r/min離心10min，重復此過程3次，充分洗滌菌體以去除殘留的培養(yǎng)基。

5）洗好的菌體用100μL 20%無菌甘油重懸，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

1）將100μL農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞置于冰上，加入10μL重組質(zhì)粒pSilent-RNAi-1，充分混勻，冰上放置30min。

2）置液氮中快速冷卻約1min后迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中，待其融化。

3）加1mL無抗生素的YM 液體培養(yǎng)基（酵母膏0.3%，胰蛋白胨0.5%，麥芽糖0.5%，自然pH）于28℃、230r/min培養(yǎng)2-4h。

4）3000r/min離心2min收集菌體，將上清吸去500μL，剩余液體重懸培養(yǎng)菌后直接涂布含氨芐霉素30μg/mL的YM平板，在28℃、230r/min培養(yǎng)36h。

5）挑取單菌落接種到含氨芐霉素的YM液體培養(yǎng)基中，28℃、250r/min 培養(yǎng)48h，將菌液用于保存-20℃，得到含有重組質(zhì)粒pSilent-RNAi-1的農(nóng)桿菌。

（3）里氏木霉菌絲的制備

1）從-80℃冰箱取出甘油管保藏的里氏木霉ATCC24449菌株，置于室溫下，快速解凍。

2）吸取適量菌液加到淀粉培養(yǎng)基平板上，用涂布棒將菌液涂布均勻（或者用無菌接種環(huán)蘸取適量菌液作平板劃線分離），34℃恒溫培養(yǎng)5天。

3）待平板上長出單菌落后，用無菌牙簽挑取單菌落移至裝有察氏培養(yǎng)基的三角瓶中，34℃培養(yǎng)5天。

4）將三角瓶中菌液全部轉(zhuǎn)移至50mL離心管，8000rpm離心5min，棄去上清。

5）加入20mL生理鹽水，反復吹打混勻，8000rpm離心洗滌 5min，棄上清，再加入適量生理鹽水重懸使菌體濃度OD600值達到1.5左右，留待轉(zhuǎn)化用。

（4）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化里氏木霉

1）試劑的配制

無機鹽液：將2.61g KCl、7.48g KH₂PO₄和29.8g NaNO₃溶于80mL水中，再加水定容至100mL，用5M KOH調(diào)pH至5.5，高壓滅菌，4℃保存。

50%葡萄糖（w/v）：50g葡萄糖溶于90mL蒸餾水中，定容至100mL，高壓滅菌。

1M MgSO₄：24.7g MgSO₄溶于90mL蒸餾水中，定容至100mL，高壓滅菌。

MM微量元素溶液：將1.1g H₃BO₃、2.1g ZnSO₄·7H₂O、0.16g CuSO₄·5H₂O、0.5g MnC1₂·4H₂O、0.5g FeSO₄·7H₂O、0.17g CoC1₂·6H₂O、0.15g Na₂MoO₄·2H₂O和0.1g EDTA溶于90mL蒸餾水中，定容至100mL，高壓滅菌，4℃保存。

MM選擇培養(yǎng)平板：取20mL無機鹽溶液、20mL 50%葡萄糖溶液、2mL 1M MgSO₄溶液、1mL MM微量元素溶液加入到957mL經(jīng)高壓滅菌含有20g瓊脂粉的蒸餾水中使總體積至1L，充分混勻（即瓊脂濃度2%）。當溫度降至60℃，加入1mL 100mg/mL潮霉素B（終濃度100μg/mL）和1mL 0.2M頭孢噻肟（終濃度0.2mM），加入1mL 200mM乙酰丁香酮（終濃度0.2mM)，混合均勻后制成MM選擇培養(yǎng)平板。

PDA培養(yǎng)基：①稱量和熬煮：按培養(yǎng)基配方逐一稱取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000mL，在加熱器上加熱至沸騰，維持20-30min，用2層紗布趁熱在量杯上過濾，濾渣棄取。②加熱溶解：把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂15-20g（提前搞碎），然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補充水分至所1000mL。

2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化里氏木霉

在含有200μM乙酰丁香酮的IM培養(yǎng)基平板上貼一層玻璃紙濾膜（盡量不要產(chǎn)生氣泡），將100μL里氏木霉菌絲懸液與100μL轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pSilent-RNAi-1的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液等體積混合均勻后涂布于濾膜上，22.5℃避光培養(yǎng)3天。將濾膜轉(zhuǎn)移至含有200μM頭孢噻肟（目的殺死農(nóng)桿菌細胞）和100μg/mL潮霉素的MM選擇培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)4-6天，篩選轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子命名為里氏木霉-RNAi-1。

（5）里氏木霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵

轉(zhuǎn)化子選育：將里氏木霉-RNAi-1接種到PDA平板上，30℃培養(yǎng) 6d，得到孢子。挑取的孢子用無菌水稀釋到孢子濃度為1×10⁷/mL，涂布PDA平板，30℃培養(yǎng)72h得到單菌落，單菌落接種到PDA斜面，30℃培養(yǎng)108h左右，得到里氏木霉-RNAi-1選育的孢子。同時以出發(fā)菌株里氏木霉ATCC24449作為對照。

接種發(fā)酵：選育的孢子接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，孢子最終濃度為1×10⁸孢子/mL發(fā)酵培養(yǎng)液，30℃、130r/m培養(yǎng)96h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成：MM微量元素液5mL，麩皮20g，甘蔗渣（粉碎過20目篩）15g，玉米芯12g，葡萄糖5g，蛋白胨2g，自來水定容至1L。

發(fā)酵結(jié)束后，用濾紙過濾發(fā)酵液，測定濾液的纖維素酶、木聚糖酶酶活，纖維素酶酶活測定方法依據(jù)文獻（魏艷紅等，纖維素酶產(chǎn)生菌HS-F9的篩選鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化。應用與環(huán)境生物學報，2010，16 (2 ): 274-278），木聚糖酶酶活測定方法依據(jù)文獻（劉超剛等，里氏木霉誘導合成木聚糖酶的調(diào)控。南京林業(yè)大學學報(自然科學版)，1999，23(3):29-32）。測定的里氏木霉-RNAi-1發(fā)酵液的濾紙酶活為4.3U/mL，葡糖苷酶酶活為8.68U/mL，纖維素內(nèi)切酶酶活為15.9U/mL，外切酶酶活為1.84U/mL，木聚糖酶酶活為0U/mL。里氏木霉ATCC24449發(fā)酵液的濾紙酶活為3.6U/mL，葡糖苷酶酶活為6.9U/mL，纖維素內(nèi)切酶酶活為20.1U/mL，外切酶酶活為1.85U/mL，木聚糖酶酶活為2.9U/mL。從結(jié)果可以看出，里氏木霉-RNAi-1的纖維素酶酶活顯著增加，葡糖苷酶的酶活增加，內(nèi)切酶的酶活下降，木聚糖酶的酶活下降到零。通過RNAi干擾技術，實現(xiàn)了葡糖苷酶酶活的適度上升，纖維素內(nèi)切酶酶活適度下降，酶活性比例的改變更適宜于纖維素酶復合酶系降解纖維素；同時木聚糖酶表達的消失也有利于纖維素酶的純化和葡糖苷酶表達量的增加。

對比試驗1

按照實施例1的操作，將干擾片段1替換為干擾片段2，其余操作同實施例1。合成兩端有SnaBI、ApaI酶切位點的干擾片段2的序列組成為：GGTACGTA（SnaBI酶切位點序列）-木聚糖酶mRNA 互補片段2序列（SEQ ID NO.3）-纖維素內(nèi)切酶mRNA互補片段序列（SEQ ID NO.4）-內(nèi)含子片段序列（SEQ ID NO.6）-纖維素內(nèi)切酶mRNA互補片段的反義序列（SEQ ID NO.7）-木聚糖酶mRNA 互補片段2的反義序列（SEQ ID NO.10）- GGGCCCGG（ApaI酶切位點序列）。

最后篩選得到的里氏木霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液的濾紙酶活為3.9U/mL，葡糖苷酶酶活為8.32U/mL，纖維素內(nèi)切酶酶活為16.2U/mL，外切酶酶活為1.85U/mL，木聚糖酶酶活為1.3U/mL。

對比試驗2

按照實施例1的操作，將干擾片段1替換為干擾片段3，其余操作同實施例1。合成兩端有SnaBI、ApaI酶切位點的干擾片段3的序列組成為：GGTACGTA（SnaBI酶切位點序列）-木聚糖酶mRNA互補片段1序列（SEQ ID NO.2）-纖維素內(nèi)切酶mRNA互補候選片段序列（SEQ ID NO.5）-內(nèi)含子片段序列（SEQ ID NO.6）-纖維素內(nèi)切酶mRNA互補候選片段的反義序列（SEQ ID NO.8）-木聚糖酶mRNA互補片段1的反義序列（SEQ ID NO.9）- GGGCCCGG（ApaI酶切位點序列）。

最后篩選得到的里氏木霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液的濾紙酶活為2.9U/mL，葡糖苷酶酶活為8.36U/mL，纖維素內(nèi)切酶酶活為12.1U/mL，外切酶酶活為1.85U/mL，木聚糖酶為0.2U/mL。從對比試驗看出，纖維素內(nèi)切酶mRNA互補序列的選取對纖維素酶活的提升要重要影響，不適當選取的纖維素內(nèi)切酶的反義序列反而會過度抑制纖維素內(nèi)切酶的表達，從而降低纖維素酶的活性。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工業(yè)大學

<120> 一種雙基因干擾提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法

<130> 1

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1454

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 干擾片段1

<400> 1

gttgcctttt ccagcctcat ctgcgctctc accagcatcg ccagtactct ggcgatgccc 60

acaggcctcg agcctgagag cagtgtcaac gtcacagagc gtggcatgta cgactttgtt 120

cttggagctc acaatgatca tcgccgtcgt gctagcatca actacgacca aaactaccaa 180

actggcggac aagtcagcta ttcgccttcc aacactggct tctcagtgaa ctggaacact 240

caagatgact ttgttgtggg cgttggttgg acgactgact cacgccgaat gtactacaaa 300

taacattgac ggcgcctttt ctccgcttgc cacttggctc cgacagaaca atcgccaggc 360

tatcctgaca gaaaccggtg gtggcaacgt tcagtcctgc atacaagaca tgtgccagca 420

aatccaatat ctcaaccaga actcagatgt ctatcttggc tatgttggtt ggggtgccgg 480

atcatttgat agcacgtatg tcctgacgga aacaccgact ggcagtggta actcatggac 540

ggacacatcc ttggtcagct cgtgtctcgc aagaaagtag cactctgagc tgaatgcaga 600

agcctcgcca acgtttgtat ctcgctatca aacatagtag ctactctatg aggctgtctg 660

ttctcgattt cagctttata tagtttcatc aaacagtgta ggaggactcc tcatcattct 720

gcactttgaa agcatcttct gaccaaaagc ttctcttact gtttgatgaa actatataaa 780

gctgaaatcg agaacagaca gcctcataga gtagctacta tgtttgatag cgagatacaa 840

acgttggcga ggcttctgca ttcagctcag agtgctactt tcttgcgaga cacgagctga 900

ccaaggatgt gtccgtccat gagttaccac tgccagtcgg tgtttccgtc aggacatacg 960

tgctatcaaa tgatccggca ccccaaccaa catagccaag atagacatct gagttctggt 1020

tgagatattg gatttgctgg cacatgtctt gtatgcagga ctgaacgttg ccaccaccgg 1080

tttctgtcag gatagcctgg cgattgttct gtcggagcca agtggcaagc ggagaaaagg 1140

cgccgtcaat gttatttgta gtacattcgg cgtgagtcag tcgtccaacc aacgcccaca 1200

acaaagtcat cttgagtgtt ccagttcact gagaagccag tgttggaagg cgaatagctg 1260

acttgtccgc cagtttggta gttttggtcg tagttgatgc tagcacgacg gcgatgatca 1320

ttgtgagctc caagaacaaa gtcgtacatg ccacgctctg tgacgttgac actgctctca 1380

ggctcgaggc ctgtgggcat cgccagagta ctggcgatgc tggtgagagc gcagatgagg 1440

ctggaaaagg caac 1454

<210> 2

<211> 277

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 木聚糖酶mRNA 互補片段1

<400> 2

gttgcctttt ccagcctcat ctgcgctctc accagcatcg ccagtactct ggcgatgccc 60

acaggcctcg agcctgagag cagtgtcaac gtcacagagc gtggcatgta cgactttgtt 120

cttggagctc acaatgatca tcgccgtcgt gctagcatca actacgacca aaactaccaa 180

actggcggac aagtcagcta ttcgccttcc aacactggct tctcagtgaa ctggaacact 240

caagatgact ttgttgtggg cgttggttgg acgactg 277

<210> 3

<211> 170

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 木聚糖酶mRNA互補片段 2

<400> 3

gtacgacttt gttcttggag ctcacaatga tcatcgccgt cgtgctagca tcaactacga 60

ccaaaactac caaactggcg gacaagtcag ctattcgcct tccaacactg gcttctcagt 120

gaactggaac actcaagatg actttgttgt gggcgttggt tggacgactg 170

<210> 4

<211> 420

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 纖維素內(nèi)切酶mRNA互補片段

<400> 4

actcacgccg aatgtactac aaataacatt gacggcgcct tttctccgct tgccacttgg 60

ctccgacaga acaatcgcca ggctatcctg acagaaaccg gtggtggcaa cgttcagtcc 120

tgcatacaag acatgtgcca gcaaatccaa tatctcaacc agaactcaga tgtctatctt 180

ggctatgttg gttggggtgc cggatcattt gatagcacgt atgtcctgac ggaaacaccg 240

actggcagtg gtaactcatg gacggacaca tccttggtca gctcgtgtct cgcaagaaag 300

tagcactctg agctgaatgc agaagcctcg ccaacgtttg tatctcgcta tcaaacatag 360

tagctactct atgaggctgt ctgttctcga tttcagcttt atatagtttc atcaaacagt 420

<210> 5

<211> 410

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 纖維素內(nèi)切酶mRNA互補候選片段

<400> 5

aacaagtccg tggctccatt gctgcttgca gcgtccatac tatatggcgg cgccgctgca 60

cagcagactg tctggggcca gtgtggaggt attggttgga gcggacctac gaattgtgct 120

cctggctcag cttgttcgac cctcaatcct tattatgcgc aatgtattcc gggagccact 180

actatcacca cttcgacccg gccaccatcc ggtccaacca ccaccaccag ggctacctca 240

acaagctcat caactccacc cacgagctct ggggtccgat ttgccggcgt taacatcgcg 300

ggttttgact ttggctgtac cacagagtga gtacccttgt ttcctggtgt tgctggctga 360

aaagttgggc gggtatacag cgatgcggac tgcaagaaca ccgccggtcc 410

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 內(nèi)含子片段

<400> 6

gtaggaggac tcctcatcat tctgcacttt gaaagcatct tctgaccaaa agcttctctt 60

<210> 7

<211> 420

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 纖維素內(nèi)切酶mRNA互補片段反義序列

<400> 7

actgtttgat gaaactatat aaagctgaaa tcgagaacag acagcctcat agagtagcta 60

ctatgtttga tagcgagata caaacgttgg cgaggcttct gcattcagct cagagtgcta 120

ctttcttgcg agacacgagc tgaccaagga tgtgtccgtc catgagttac cactgccagt 180

cggtgtttcc gtcaggacat acgtgctatc aaatgatccg gcaccccaac caacatagcc 240

aagatagaca tctgagttct ggttgagata ttggatttgc tggcacatgt cttgtatgca 300

ggactgaacg ttgccaccac cggtttctgt caggatagcc tggcgattgt tctgtcggag 360

ccaagtggca agcggagaaa aggcgccgtc aatgttattt gtagtacatt cggcgtgagt 420

<210> 8

<211> 410

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 纖維素內(nèi)切酶mRNA互補候選片段反義序列

<400> 8

ggaccggcgg tgttcttgca gtccgcatcg ctgtataccc gcccaacttt tcagccagca 60

acaccaggaa acaagggtac tcactctgtg gtacagccaa agtcaaaacc cgcgatgtta 120

acgccggcaa atcggacccc agagctcgtg ggtggagttg atgagcttgt tgaggtagcc 180

ctggtggtgg tggttggacc ggatggtggc cgggtcgaag tggtgatagt agtggctccc 240

ggaatacatt gcgcataata aggattgagg gtcgaacaag ctgagccagg agcacaattc 300

gtaggtccgc tccaaccaat acctccacac tggccccaga cagtctgctg tgcagcggcg 360

ccgccatata gtatggacgc tgcaagcagc aatggagcca cggacttgtt 410

<210> 9

<211> 277

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 木聚糖酶mRNA互補片段1的反義序列

<400> 9

cagtcgtcca accaacgccc acaacaaagt catcttgagt gttccagttc actgagaagc 60

cagtgttgga aggcgaatag ctgacttgtc cgccagtttg gtagttttgg tcgtagttga 120

tgctagcacg acggcgatga tcattgtgag ctccaagaac aaagtcgtac atgccacgct 180

ctgtgacgtt gacactgctc tcaggctcga ggcctgtggg catcgccaga gtactggcga 240

tgctggtgag agcgcagatg aggctggaaa aggcaac 277

<210> 10

<211> 170

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 木聚糖酶mRNA互補片段2的反義序列

<400> 10

cagtcgtcca accaacgccc acaacaaagt catcttgagt gttccagttc actgagaagc 60

cagtgttgga aggcgaatag ctgacttgtc cgccagtttg gtagttttgg tcgtagttga 120

tgctagcacg acggcgatga tcattgtgag ctccaagaac aaagtcgtac 170