一種快速測定透明質(zhì)酸酶活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸酶活性的方法，尤其一種快速測定透明質(zhì)酸酶活性的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸酶有三類同工酶，第一類為經(jīng)典的透明質(zhì)酸酶（透明質(zhì)酸酶EC 3.2.1.35)，多存在哺乳動物的睪丸中，蛇毒中的透明質(zhì)酸酶也屬于此類;第二類為透明質(zhì) 酸酶EC 3.2.1.36，多存在水蛭的唾液腺中；第三類為透明質(zhì)酸酶EC 4.2.2.1，多來源于細(xì) 菌、真菌、噬菌體等微生物。不同種屬來源的透明質(zhì)酸酶的最適pH值、等電點(diǎn)以及分子量都 不相同，透明質(zhì)酸酶的活性分為酸性活性(acid active)和中性活性(neutral active)，前 者最適pH值在3與4之間，后者最適pH值在5與6之間。
[0003] 透明質(zhì)酸又名玻尿酸，主要功能有保水，保濕，抗衰老，促進(jìn)傷口愈合，減少傷口炎 癥。其基本結(jié)構(gòu)是一條無支鏈的多聚糖。十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)，是一種陽離子表面活性劑，被廣泛應(yīng)用于DNA的提取、粘多糖的測量、改變 固體表表面的濕潤性、電池穩(wěn)定劑等。1955年，F(xiàn)errante N發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸與CTAB在一定條件 發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生濁度，在紫外分光光度計400nm下呈線性相關(guān);陳永浩等人首次將CTAB測定透 明質(zhì)酸含量的方法稱之為CTAB濁度法（"發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量快速檢測方法研究[J]"，食 品與發(fā)酵工業(yè).2009,35(1))。
[0004] Dorfman A等用牛睪丸酶解透明質(zhì)酸，用酸性蛋白與小分子透明質(zhì)酸反應(yīng)產(chǎn)生池 度，在600nm測吸光度，酸性蛋白需要在4°C操作，其實(shí)驗(yàn)條件要求高，重復(fù)性差。Stern Μ等 用ELISA使透明質(zhì)酸覆蓋在板孔中，時間為10h，然后用透明質(zhì)酸酶進(jìn)行酶解，洗去降解的透 明質(zhì)酸，用牛血清白蛋白進(jìn)行反應(yīng)，在492nm下測吸光度，此方法反應(yīng)時間長，條件要求高， 且不足以反應(yīng)透明質(zhì)酸酶活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速測定透明質(zhì)酸酶活性的方法，該方法操作簡單， 穩(wěn)定性好，靈敏度和可重復(fù)性高，為透明質(zhì)酸酶的規(guī)模化提取、制備及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種快速測定透明質(zhì)酸酶活性的方法， 包括以下步驟：
[0007] (1)配制透明質(zhì)酸溶液:采用醋酸鈉緩沖液配制透明質(zhì)酸溶液，溶液pH為：3〈pH< 7；
[0008] (2)配制十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液；
[0009] (3)制備樣品溶液:取步驟（1)的透明質(zhì)酸溶液，加入透明質(zhì)酸酶溶液在37°C反應(yīng) 0.5~1小時，加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液后37°C下繼續(xù)反應(yīng)8~15分鐘，獲得樣 品溶液；
[0010] (4)制備對照溶液:取步驟（1)的透明質(zhì)酸溶液，加入十六烷基三甲基溴化銨溶液， 37°C下反應(yīng)8~15分鐘，獲得對照溶液；
[0011] (5)測定光密度值:采用酶標(biāo)儀在波長400nm下測定對樣品溶液和對照溶液的光密 度值(0D值）；
[0012] (6)計算結(jié)果:根據(jù)所獲得的樣品溶液和對照溶液的光密度值采用下式計算獲得 透明質(zhì)酸酶的活力及比活力，
[0013]
>知?為對照溶液的光密度值，Α?為樣品溶液的光密度值，
[0014]
，濃度為樣品溶液的濃度，加樣量為樣 品溶液的加樣量。
[0015] CTAB中氮原子與透明質(zhì)酸中羧基的氧原子形成配對，從而形成不溶于水的復(fù)合 物，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，CTAB與透明質(zhì)酸結(jié)合所產(chǎn)生的濁度與溶液中透明質(zhì)酸的量成正相關(guān)。利 用透明質(zhì)酸酶對透明質(zhì)酸的專一性，讓透明質(zhì)酸酶部分分解透明質(zhì)酸，將大分子透明質(zhì)酸 分解為小分子化合物，與CTAB反應(yīng)形成的復(fù)合物減少，降低了樣品溶液的濁度，因而可根據(jù) 樣品溶液和對照溶液的0D值差值計算獲得透明質(zhì)酸酶的活性。由于透明質(zhì)酸分子量小于 15000Da不能產(chǎn)生足夠的電荷與CTAB產(chǎn)生連續(xù)的吸附，以至不產(chǎn)生濁度，不遵循朗伯-比爾 定律，導(dǎo)致無法獲得準(zhǔn)確的測定結(jié)果。因此，在測定過程中應(yīng)避免過度酶解，酶解反應(yīng)時間 不宜過長，一般控制在0.5~1小時，以保留部分透明質(zhì)酸不被分解，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確 性。CTAB既能和未被酶解成小分子的透明質(zhì)酸合成，使溶液產(chǎn)生濁度，又能終止透明質(zhì)酸酶 的酶解反應(yīng)，優(yōu)化了終止酶解步驟，因而簡化了本發(fā)明的操作步驟。
[0016] 在本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)離子強(qiáng)度和pH值均對CTAB與透明質(zhì)酸結(jié)合產(chǎn)生的濁 度有較大影響。其中離子強(qiáng)度越高，對CTAB與透明質(zhì)酸結(jié)合產(chǎn)生的濁度影響越大，在離子強(qiáng) 度高于0.5M后，不產(chǎn)生濁度;而pH值的影響較為溫和，當(dāng)pH值2 5的時候?qū)TAB濁度法基本 無影響，pH值=3時CTAB與透明質(zhì)酸結(jié)合不產(chǎn)生濁度。CTAB與透明質(zhì)酸結(jié)合不產(chǎn)生濁度，會 導(dǎo)致無法準(zhǔn)確檢測透明質(zhì)酸酶的活性。故，所述步驟(1)的醋酸鈉緩沖液的離子強(qiáng)度在0.5M 以下且3〈pH <7。具體地，以0.2M醋酸鈉緩沖液為基礎(chǔ)添加氯化鈉以調(diào)整離子強(qiáng)度，調(diào)整離 子強(qiáng)度在〇~〇. 5M范圍內(nèi)。本發(fā)明中所述離子強(qiáng)度均為氯化鈉的離子強(qiáng)度。
[0017] 所述步驟(1)的透明質(zhì)酸溶液濃度為0.5~1.5ygAil。
[0018] 所述步驟(2)的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液為，2 · 5gCTAB溶解于100ml 2 % (w/v)的NaOH中，濃度為2.5%(w/v)，在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)20°C時候會出現(xiàn)大量成 團(tuán)結(jié)晶，因此該溶液要在25°C以上儲存，防止溫度太低導(dǎo)致CTAB結(jié)晶。
[0019] 所述步驟(3)中透明質(zhì)酸酶溶液由透明質(zhì)酸酶溶解于醋酸鈉緩沖液構(gòu)成，在測透 明質(zhì)酸酶活性的過程中，蛋白量很重要，量太少，0D值減少不明顯，容易出現(xiàn)假陰性，但是也 要防止過度酶解，特別是經(jīng)過提純的透明質(zhì)酸酶，其量應(yīng)該要比粗蛋白減少到它的提純倍 數(shù)。所以若含透明質(zhì)酸酶的粗蛋白進(jìn)行配制，則配成的蛋白濃度為3~5ygAU，加樣量為20 ~40μ1;若純透明質(zhì)酸酶進(jìn)行配制，則配成的蛋白濃度為0.1~0.3yg/yl，加樣量為3~8μ1。 本發(fā)明所述的透明質(zhì)酸酶可以從各種來源獲得，作為本發(fā)明的一個實(shí)施例，所述透明質(zhì)酸 酶來源于蛇毒。
[0020] 所述步驟(3)和(4)的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液的添加量為200μ 1。
[0021 ]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0022] (1)本發(fā)明運(yùn)用CTAB與透明質(zhì)酸結(jié)合的原理來測透明質(zhì)酸酶活性，以透明質(zhì)酸為 指示劑，通過CTAB法測定透明質(zhì)酸酶活性。
[0023] CTAB中氮原子與透明質(zhì)酸中羧基的氧原子形成配對，從而形成不溶于水的復(fù)合 物，且CTAB與透明質(zhì)酸結(jié)合所產(chǎn)生的濁度與溶液中透明質(zhì)酸的量成正相關(guān)。透明質(zhì)酸酶水 解部分透明質(zhì)酸，將部分大分子透明質(zhì)酸分解為小分子化合物，那么與CTAB形成不溶于水 的復(fù)合物減少，溶液的濁度就會降低，從而與對照溶液的檢測結(jié)果進(jìn)行計算，獲得透明質(zhì)酸 酶的活性。
[0024] (2)本發(fā)明耗時短：
[0025] 透明質(zhì)酸分子量小于15000Da不能產(chǎn)生足夠的電荷與CTAB產(chǎn)生連續(xù)的吸附，以至 不產(chǎn)生濁度，不遵循朗伯-比爾定律，因此，在測定過程中應(yīng)避免過度酶解，因而酶解反應(yīng)時 間不宜過長，一般控制在0.5~1小時，以保留部分透明質(zhì)酸不被分解，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確 性。
[0026] (3)CTAB既能和未被酶解成小分子的透明質(zhì)酸合成，使溶液產(chǎn)生濁度，又能終止透 明質(zhì)酸酶的酶解反應(yīng)，優(yōu)化了終止酶解步驟，因而簡化了操作步驟。
[0027] (4)透明質(zhì)酸酶是透明質(zhì)酸的專一性水解酶，不會受其他雜蛋白的影響，故透明質(zhì) 酸酶無需經(jīng)過提純，也能獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，測定穩(wěn)定性好，靈敏度高，可重復(fù)性高。
[0028] (5)本發(fā)明用酶標(biāo)儀代替紫外分光光度計來檢測，可同時測定多個樣品，一次性可 進(jìn)行96孔檢測，非常便捷，還能減少比色皿的誤差，可取得更好的測定效果。
[0029] (6)本發(fā)明操作簡單、快速、穩(wěn)定性好且靈敏度高，在透明質(zhì)酸及透明質(zhì)酸酶的制 備、檢測等方面具有較高的應(yīng)用價值。
[0030] (7)本發(fā)明尤其適用于對蛇毒來源的透明質(zhì)酸酶活性的檢測
【具體實(shí)施方式】
[0031 ]圖1是CTAB與透明質(zhì)酸反應(yīng)產(chǎn)生濁度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(酶標(biāo)儀檢測0D值）；
[0032]圖2是不同離子強(qiáng)度對CTAB法測透明質(zhì)酸0D值的影響；
[0033]圖3-A是離子強(qiáng)度為0M的CTAB法測透明質(zhì)酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0034]圖3-B是離子強(qiáng)度為0.1M的CTAB法測透明質(zhì)酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0035]圖3-C是離子強(qiáng)度為0.2M的CTAB法測透明質(zhì)酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0036]圖3-D是離子強(qiáng)度為0.3M的CTAB法測透明質(zhì)酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0037]圖3-E是離子強(qiáng)度為0.4M的CTAB法測透明質(zhì)酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0038]圖3-F是離子強(qiáng)度為0.5M的CTAB法測透明質(zhì)酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0039]圖4是不同pH值對CTAB法測透明質(zhì)酸0D值的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0040]
[0041] 以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于此，本技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過以上本發(fā)明公開內(nèi)容均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0042] 實(shí)施例1:酶標(biāo)儀代替紫外分光光度計做透明質(zhì)酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0043]食品與發(fā)酵工業(yè).2009，35( 1)中的"發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量快速檢測方法研究 [J]"公開的CTAB法測透明質(zhì)酸含量檢測儀器多為紫外分光光度計，然而紫外分光光度計不 能同時測量多個樣品，且需要樣品量較大。酶標(biāo)儀能同時測量多個樣品，用一次性96孔板， 操作非常便捷，還能減少比色皿的誤差。
[0044] 將5~50μ1透明質(zhì)酸(濃度為lyg/yl)加入有200μ1醋酸鈉緩沖液1.5ml EP管，不足 250ul的用醋酸鈉緩沖液補(bǔ)