一種dna連接酶活性測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種DNA連接酶活性測(cè)定方法，所述方法包括以下步驟：首先根據(jù)單鏈DNA模板合成毗連的兩段引物，其中按引物的5’至3’方向來(lái)說(shuō)，5’方向的引物的3’端與3’方向的引物的5’相鄰，并且5’方向的引物為正常引物，而3’方向的引物為3’末端被磷酸化的引物；然后將這兩段引物與單鏈DNA模板退火，以形成的單鏈DNA模板/正常引物-3’末端磷酸化引物復(fù)合物為底物，在DNA連接酶存在下進(jìn)行連接反應(yīng)；隨后以連接反應(yīng)的產(chǎn)物為底物，在具有鏈置換活性的聚合酶作用下進(jìn)行聚合反應(yīng)，然后檢測(cè)雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量，并以該相對(duì)量為基礎(chǔ)推導(dǎo)出DNA連接酶的活性程度。本發(fā)明方法無(wú)放射性污染；操作簡(jiǎn)單快速；并且可以對(duì)DNA連接酶活性進(jìn)行定量的檢測(cè)分析。
【專利說(shuō)明】一種DNA連接酶活性測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來(lái)說(shuō)涉及一種DNA連接酶活性測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] DNA連接酶是1967年發(fā)現(xiàn)的，它可以封閉DNA鏈上的缺口，通過(guò)ATP或NAD水解提 供的能量催化DNA鏈的5' -磷酸末端和3' -羥基末端生成磷酸二酯鍵，使與同一條互補(bǔ)鏈 配對(duì)結(jié)合并緊鄰(之間沒(méi)有空隙）的兩條寡核苷酸鏈相連。大腸桿菌DNA連接酶，來(lái)源于大 腸桿菌，是最早發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶，可以用于連接粘性末端；T4DNA連接酶，來(lái)源于T4噬菌 體，它可以連接粘性末端和平末端，但是連接效率較低；熱穩(wěn)定的DNA連接酶，是從嗜熱高 溫放線菌菌株中分離純化得到的，它是一種能夠在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接 作用的核酸酶。
[0003] DNA連接酶是基因工程技術(shù)以及分子生物學(xué)研究中一種重要的工具酶，廣泛應(yīng)用 于分子克隆中重組DNA構(gòu)建等領(lǐng)域。（周李華等，中國(guó)測(cè)試.2014March;40(2):64-66)。工 具酶的酶活力檢測(cè)是工具酶產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵，研究和建立工具酶酶活力的測(cè)定方法是 工具酶產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化制定的一個(gè)重點(diǎn)，也是一個(gè)難點(diǎn)。另外有文獻(xiàn)報(bào)道，臨床研究發(fā)現(xiàn)連接 酶的活性水平與乳腺癌及惡性膠質(zhì)瘤等腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，抑制連接酶的活性不僅 能降低腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力，還能顯著提高腫瘤細(xì)胞的藥敏性，因此，定量分析連接酶活性對(duì) 開展腫瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。（劉斌等，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào).2010March; 31 (3):463-467)。
[0004] 目前，對(duì)于DNA連接酶的測(cè)活普遍采用的是一種半定量的檢測(cè)方法。將T4DNA連 接酶(或大腸桿菌DNA連接酶）做一系列的稀釋倍數(shù)，將稀釋后的酶加入到含有雙鏈DNA片 段(經(jīng)HindIII消化的λDNA片段)和IXDNA連接酶反應(yīng)緩沖液的反應(yīng)體系中，在一定溫度 下反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)終止后，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析連接產(chǎn)物即大分子量 片段的量，來(lái)計(jì)算連接酶活性。這種方法實(shí)驗(yàn)成本較低，但是其最大的缺陷在于電泳圖譜的 分析存在相當(dāng)強(qiáng)的主觀性。即使用圖像掃描、灰度分析來(lái)判定連接產(chǎn)物的比例，仍然是一種 半定量的方法，因此不能精確測(cè)定DNA連接酶的活性，從而不能很好地保持批次之間的穩(wěn) 定性。
[0005] 基于熒光技術(shù)發(fā)展的分子信標(biāo)法及AP標(biāo)記法雖然簡(jiǎn)單快速，但探針設(shè)計(jì)復(fù)雜，成 本高，檢測(cè)過(guò)程中容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，無(wú)法滿足人們研究的不同需求。（劉斌等，高等學(xué)校 化學(xué)學(xué)報(bào)· 2010March;31 (3) :463-467)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明建立了一種簡(jiǎn)便、快速、非放射性且定量的DNA連接酶測(cè)活方法，其原理如 圖1所示。
[0007] 具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明采用的是如下技術(shù)方案： 一種DNA連接酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：首先根據(jù)單鏈 DNA模板合成毗連的兩段引物，其中按引物的5'至3'方向來(lái)說(shuō)，5'方向的引物的3'端與 3'方向的引物的5'相鄰，并且5'方向的引物為正常引物，而3'方向的引物為3'末端被 磷酸化的引物；然后將這兩段引物與單鏈DNA模板退火，形成單鏈DNA模板/正常引物-3' 末端磷酸化引物復(fù)合物；接著以該單鏈DNA模板/正常引物-3'末端磷酸化引物復(fù)合物為 底物，在DNA連接酶存在下進(jìn)行連接反應(yīng)；隨后以連接反應(yīng)的產(chǎn)物為底物，在具有鏈置換活 性的聚合酶作用下進(jìn)行聚合反應(yīng)，聚合反應(yīng)完成后檢測(cè)雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量，并以 該相對(duì)量為基礎(chǔ)推導(dǎo)出DNA連接酶的活性程度。
[0008] 優(yōu)選地，雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是利用熒光染料，通過(guò)熒光法測(cè)得的，并且 雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是以熒光強(qiáng)度表示的。更優(yōu)選，所采用的熒光染料是雙鏈DNA 特異性熒光染料。在一個(gè)實(shí)施例中，所采用的染料是業(yè)內(nèi)常用的商購(gòu)染料Picogreen染料。
[0009] 優(yōu)選地，所采用的單鏈DNA模板是單鏈環(huán)狀DNA模板，聚合反應(yīng)所形成的雙鏈DNA 是在該單鏈環(huán)狀DNA模板上形成互補(bǔ)鏈而形成的雙鏈環(huán)狀DNA。更優(yōu)選，所采用的單鏈DNA模板是M13噬菌體單鏈DNA，以便于建立可以在業(yè)內(nèi)通用并且更方便的標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法。 [0010] 所用的具有鏈置換活性的聚合酶可以采用多種來(lái)源的該類聚合酶，在一個(gè)實(shí)施方 案中，所采用的具有鏈置換活性的聚合酶是大腸桿菌聚合酶I。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 1. 操作步驟簡(jiǎn)單快速，重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)； 2. 可以對(duì)DNA連接酶活性進(jìn)行定量的檢測(cè)分析，引物設(shè)計(jì)容易，便于操作。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1是本發(fā)明的測(cè)定方法的原理圖。
[0013] 圖2是作為一個(gè)實(shí)例的T4DNA連接酶活性-熒光強(qiáng)度曲線圖。
[0014] 圖3是作為另一個(gè)實(shí)例的大腸桿菌DNA連接酶活性-熒光強(qiáng)度曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明的目的在于建立一種簡(jiǎn)便、快速、非放射性且定量的DNA連接酶測(cè)活方法， 其原理如圖1所示。
[0016] 如圖1所示，我們?cè)O(shè)計(jì)兩個(gè)M13單鏈環(huán)狀DNA的引物：一個(gè)為與之匹配的正常引 物，另一個(gè)為3'末端磷酸化修飾的引物(若引物3'末端發(fā)生磷酸化修飾，則它本身雖然能 以Ml3單鏈環(huán)狀DNA匹配，但因?yàn)? '-OH被封閉，不能發(fā)生聚合反應(yīng))，其中正常引物與3 ' 末端磷酸化引物是M13單鏈環(huán)狀DNA上兩個(gè)順次的引物，正常引物的3'端與3'末端磷酸 化引物的5'端有一個(gè)缺刻(沒(méi)有磷酸二酯鍵相連)。DNA連接酶可將正常引物的3'-OH末 端與3'末端磷酸化引物的5'-P末端連接起來(lái)，生成磷酸二酯鍵，使兩條引物連成一條長(zhǎng)的 3'末端磷酸化修飾的引物。大腸桿菌聚合酶I是一種有聚合活性和鏈置換活性的酶，當(dāng)正 常引物與3'末端磷酸化引物未發(fā)生連接時(shí)，它可以M13單鏈環(huán)狀DNA為模板，以正常引物 為引物，將3'末端磷酸化引物置換下來(lái)，發(fā)生聚合反應(yīng)，生成M13雙鏈DNA。M13雙鏈DNA 可被雙鏈特異性的picogreen染料結(jié)合，產(chǎn)生突光。而當(dāng)正常引物與3'末端磷酸化引物連 接時(shí)，大腸桿菌聚合酶I不能以3'末端磷酸化修飾的引物為引物，進(jìn)行聚合反應(yīng)，由此不能 生成M13雙鏈DNA，picogreen染料不能結(jié)合單鏈DNA，從而不能產(chǎn)生熒光。
[0017]DNA連接酶的活性在一定范圍內(nèi)同生成的長(zhǎng)的3'末端磷酸化修飾的引物的量成 正比；而在大腸桿菌DNA聚合酶I活性一定的情況下，生成的長(zhǎng)的3'末端磷酸化修飾的引 物的量同熒光強(qiáng)度成反比。因此，本發(fā)明將DNA連接酶的測(cè)活體系同大腸桿菌DNA聚合酶 I的聚合反應(yīng)體系偶聯(lián)起來(lái)。
[0018] 本發(fā)明人進(jìn)一步證明了上述假設(shè)，從而建立了非放射性、簡(jiǎn)便、快速且可以定量的 DNA連接酶測(cè)活方法。
[0019] 下面將結(jié)合具體實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
[0020] 實(shí)施例1. "轉(zhuǎn)化法"測(cè)定T4DNA連接酶活性的可行性驗(yàn)證 M13模板/正常引物-3'末端磷酸化引物復(fù)合物的制備： M13 單鏈DNA:M13mpl8 單鏈DNA(NEB); 正常M13 引物：5，-aagccatccgcaaaaatgacctct-3，； 3'末端磷酸化M13引物：5' -tatcaaaaggagcaattaaagg-3'（3，末端輕基進(jìn)行了磷酸 化修飾） M13模板/正常引物-3'末端磷酸化引物復(fù)合物：將M13mpl8單鏈DNA同正常M13引 物、3'末端磷酸化M13引物按摩爾比1:1:1混合，在退火緩沖液（10mMTris-HClpH8.0， 50mMNaCl)中，70°C加熱5分鐘后，緩慢降至室溫，使模板引物退火。
[0021]M13模板/3'末端磷酸化引物復(fù)合物的制備： M13 單鏈DNA:M13mpl8 單鏈DNA(NEB); 3'末端磷酸化M13引物：5' -tatcaaaaggagcaattaaagg-3'（3，末端輕基進(jìn)行磷酸化 修飾） M13模板/3'末端磷酸化引物復(fù)合物：將M13mpl8單鏈DNA同3'末端磷酸化M13引物 按摩爾比1:1混合，在退火緩沖液（10mMTris-HClpH8.0，50mMNaCl)中，70°C加熱5 分鐘后，緩慢降至室溫，使模板引物退火。
[0022] 連接反應(yīng)： T4DNA連接酶為NEBM0202

【權(quán)利要求】
1. 一種DNA連接酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：首先根據(jù)單 鏈DNA模板合成毗連的兩段引物，其中按引物的5'至3'方向來(lái)說(shuō)，5'方向的引物的3'端 與3'方向的引物的5'相鄰，并且5'方向的引物為正常引物，而3'方向的引物為3'末端被 磷酸化的引物；然后將這兩段引物與單鏈DNA模板退火，形成單鏈DNA模板/正常引物-3' 末端磷酸化引物復(fù)合物；接著以該單鏈DNA模板/正常引物-3'末端磷酸化引物復(fù)合物為 底物，在DNA連接酶存在下進(jìn)行連接反應(yīng)；隨后以連接反應(yīng)的產(chǎn)物為底物，在具有鏈置換活 性的聚合酶作用下進(jìn)行聚合反應(yīng)，聚合反應(yīng)完成后檢測(cè)雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量，并以 該相對(duì)量為基礎(chǔ)推導(dǎo)出DNA連接酶的活性程度。
2. 如權(quán)利要求1所述的DNA連接酶活性測(cè)定方法，其特征在于，雙鏈DNA或單鏈DNA 的相對(duì)量是利用熒光染料，通過(guò)熒光法測(cè)得的，并且雙鏈DNA或單鏈DNA的相對(duì)量是以熒光 強(qiáng)度表不的。
3. 如權(quán)利要求2所述的DNA連接酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的熒光染料是 雙鏈DNA特異性熒光染料。
4. 如權(quán)利要求3所述的DNA連接酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的染料是 picogreen 染料。
5. 如權(quán)利要求1所述的DNA連接酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的單鏈DNA模 板是單鏈環(huán)狀DNA模板，聚合反應(yīng)所形成的雙鏈DNA是在該單鏈環(huán)狀DNA模板上形成互補(bǔ) 鏈而形成的雙鏈環(huán)狀DNA。
6. 如權(quán)利要求5所述的DNA連接酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的單鏈DNA模 板是Ml3噬菌體單鏈DNA。
7. 如權(quán)利要求1所述的DNA連接酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的具有鏈置換 活性的聚合酶是大腸桿菌聚合酶I。
【文檔編號(hào)】C12Q1/48GK104278090SQ201410502851
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】徐曉昱, 王靜 申請(qǐng)人:南京諾唯贊生物科技有限公司