專利名稱：在高溫下提高酶活性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過使用具有陪伴分子功能的物質(zhì)在高溫下提高酶活性的方法。
一般來說，當溫度高于最適溫度時，酶的活性會降低。我們也知道，當溫度達到一定高度時，酶就會失活。導致這種高溫失活效應的溫度根據(jù)不同種類的酶而有所不同。但是，對于大部分最適溫度在常溫下的酶，當溫度達50℃左右時，酶就會失活。也有一些在高溫下性質(zhì)穩(wěn)定的酶，但這些抗熱性酶本身的最適溫度一般也較高。
根據(jù)使用酶時的具體條件，經(jīng)常需要在高溫下使用酶。在這些情況下，一般要使用上文提到的抗熱性酶。例如，在PCR反應中，經(jīng)常用到的Taq聚合酶就是一種抗熱性酶。但是，在很多情況下，某種適合使用的抗熱性酶還是未知的，或者即使已知某種抗熱性酶，但所使用的其它反應條件卻可能對該酶不適。
例如，Superscript II是一種已知的逆轉(zhuǎn)錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶)，它能夠在體外由mRNA提供cRNA。Superscript II是耐熱酶，最適溫度為42℃，在溫度達50℃時，10分鐘內(nèi)該酶就完全失活。盡管Tth DNA聚合酶具有抗熱性及逆轉(zhuǎn)錄酶活性，但是需要錳離子參與以顯示酶活性。如果在高溫下用Tth DNA聚合酶由mRNA生產(chǎn)cDNA，那么存在于反應系統(tǒng)中的錳離子會導致mRNA鏈斷裂，因而想得到全長cDNA分子就十分困難。
具有耐熱性能的逆轉(zhuǎn)錄酶如上面提到的Superscript II，在反應時所需的錳離子也會在高溫下使存在于緩沖液或水溶液中的mRNA發(fā)生斷裂。根據(jù)本發(fā)明人的研究表明，錳離子顯示出比鎂離子具有更強的斷裂活性，即使使用螯合劑也難于控制因錳離子所產(chǎn)生的斷裂作用。
Taq聚合酶被認為是一種固有抗熱性酶。但是在PCR反應中，一般當反應循環(huán)次數(shù)達到或超過25-30次后，它的酶活性就有所降低。因此，如果能夠防止Taq聚合酶的活性降低，那么就可以用更少量的酶來達到更理想的擴增效果及更多的循壞次數(shù)。
在某些情況下，由于某些原因需要使逆轉(zhuǎn)錄反應在50℃以上的溫度下進行。例如，為了獲得全長cDNA，需要在進行逆轉(zhuǎn)錄反應的同時防止mRNA二級結構的形成。
但是，象Tth DNA聚合酶那樣具有逆轉(zhuǎn)錄活性的抗熱性酶不能提供全長的cDNA。因此，就需要使用某種通常可以得到的在室溫下使用的酶。
不僅在聚合酶、限制酶中，而且在其它酶中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)類似情況。
對于某些酶來講，我們知道可以通過遺傳工程的方法引入突變來獲得具有更高最適溫度的酶。但是，只要涉及到逆轉(zhuǎn)錄酶，所述的抗熱性的改善并不總是可行的，而且也不清楚。
如果某種酶能夠在更高的溫度下顯示出更高的活性，即使已知它是一種抗熱性酶，它的用途也會因此而增加。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種方便而有效的提高酶的抗熱性的方法，從而能夠在高溫下獲得較高的酶活性。
本發(fā)明提供了一種增強的酶活性的方法，該方法涉及在含有該酶的反應混和物中加入一種具有陪伴分子功能的物質(zhì)。


圖1為在實施例1中得到的凝膠電泳的結果顯示。
其中λ＝λHinD III標準參照物1)標準“最適”緩沖液條件反應溫度為42℃2)緩沖液中加入了海藻糖(20％)及甘油(20％)反應溫度為42℃3)緩沖液中加入了海藻糖(20％)及甘油(20％)反應溫度為60℃4)緩沖液中加入了海藻糖(20％)，甘油(20％)及Triton×X-100(0.05％)反應溫度為60℃5)緩沖液中加入了海藻糖(20％)，甘油(20％)及BSA(125ng/μl)反應溫度為60℃在標準緩沖液條件下，Superscript II在≥50℃時失活(沒有在圖中顯示)。
圖2為在實施例4中(用于甜菜堿的)得到的凝膠電泳的結果顯示。
其中1)17)λHind III 11)55℃ 0 M2)37℃ 0 M12)55℃ 0.2 M3)37℃ 0.2 M13)55℃ 0.6 M4)37℃ 0.6 M14)60℃ 0 M
5)45℃ 0 M15)60℃ 0.2 M6)45℃ 0.2 M16)60℃ 0.6 M7)45℃ 0.6 M8)50℃ 0 M9)50℃ 0.2 M10)50℃ 0.6 M圖3為在實施例4中(用了肌氨酸的)得到的凝膠電泳的結果顯示。
其中1)λHind III 14)50℃ 0 M2)37℃ 0 M15)50℃ 0.2 M3)37℃ 0.2 M16)50℃ 0.6 M4)37℃ 0.6 M17)50℃ 1.2 M5)37℃ 1.2 M18)50℃ 2.4 M6)37℃ 2.4 M19)50℃ 3.6 M7)37℃ 3.6 M20)55℃ 0 M8)45℃ 0 M21)55℃ 0.2 M9)45℃ 0.2 M22)55℃ 0.6 M10)45℃ 0.6 M23)55℃ 1.2 M11)45℃ 1.2 M24)55℃ 2.4 M12)45℃ 2.4 M25)55℃ 3.6 M13)45℃ 3.6 M圖4顯示的是實施例4中(用了甜菜堿的)所測試的Sty I的相對活性。
圖5顯示的是實施例4中(用了肌氨酸的)所測試的Sty I的相對活性。
本發(fā)明所使用的方法中，對所述酶沒有作特別的限定，它可以是一種在高溫下沒有失活且顯示出活性的酶。通過使用本發(fā)明所提供的方法有可能在高溫下提高某種酶的活性。例如將本方法用于一種沒有永久性失活但通常條件下高溫時卻基本上不顯示活性的酶，或者是在通常條件下高溫時失活的酶，只要所述酶處于一種在高溫下可能被激活的狀況。
本發(fā)明所述方法可應用的酶的典型例子包括聚合酶及限制酶。聚合酶的例子包括DNA聚合酶，RNA-依賴的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)，DNA復制酶，未端脫氧轉(zhuǎn)移酶，poly A聚合酶以及末端轉(zhuǎn)移酶。但是，所述酶并不僅限于此。
DNA聚合酶的例子包括Sequencease Ver.2，T7 DNA聚合酶，T4 DNA聚合酶，DNA聚合酶I及類似的酶?？篃嵝訢NA聚合酶的例子有Taq聚合酶，Vent DNA聚合酶，pfu聚合酶，Tth聚合酶。Thermosequenes及類似的酶。通過本發(fā)明所述的方法可以使抗熱性DNA聚合酶的抗熱性能進一步提高，因此，增大了PCR反應中的擴增比例及循環(huán)次數(shù)，從而提高了PCR應的穩(wěn)定性。
RNA-依賴的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)的例子有Superscript II，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，Mulv逆轉(zhuǎn)錄酶及類似的酶。
除了上述的聚合酶外，還有一些限制酶，例如，Taq I在高溫下并沒有失活而且顯示了較大的活性。使用本發(fā)明的方法也能使這樣的酶在高溫下穩(wěn)定。使用本發(fā)明的方法可應用的限制酶的例子有Sty I， EcoRt，MluI，NcoI， DNase I，Rnase I，NdeI，Pvu II，Pst I，Dra I，Hin D III及Hinc II。但所述酶并不僅限于此。
在本發(fā)明所述的方法中，一種具有陪伴分子功能的物質(zhì)存在于反應混和物中。
顯示出陪伴分子功能的物質(zhì)有糖類、氨基酸、聚醇及它們的衍生物，陪伴蛋白。但是，所述物質(zhì)并不僅限于這些。所述的“陪伴分子功能”是指能夠使因熱休克等應力而變性的蛋白質(zhì)復性的功能，或者是指為防止因加熱而使蛋白質(zhì)完全變性，從而使蛋白質(zhì)保持天然結構的功能。
糖類中顯示出陪伴分子功能的例子有寡糖、及單糖，例如海藻糖，麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖，木二糖，瓊脂二糖、纖維二糖、果二糖、quitobiose，2-β-glucuronosylglucuronic acid，阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、山梨醇、果糖，木糖醇及阿糖醇。但是，所述糖類并不限于這些。上述糖類可以單獨使用也可以任意組合使用。這些糖中，海藻糖、山梨醇、木糖醇、果糖及阿糖醇在用于在高溫下激活酶時體現(xiàn)出了強的陪伴分子功能及顯著的效果。
氨基酸及其衍生物的例子有Ne-乙?；?β-賴氨酸，丙氨酸，γ-氨基丁酸，甜菜堿，Na-氨基甲酰-谷氨酸-1-酰氨，膽堿，二甲基噻亭，ecotine(1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸)，谷氨酸，β-谷氨酰氨、甘氨酸，章魚堿，脯氨酸，肌氨酸，?；撬峒叭装種-氧化物(TMAO)。但是，所述氨基酸及其衍生物不止限于這些。前邊提到的這些氨基酸可以單獨使用或者以任意組合使用。這些氨基酸中，甜菜堿及肌氨酸在用于高溫下激活酶時體現(xiàn)出了更強的陪伴分子功能及顯著的效果。
顯示出陪伴分子功能的物質(zhì)也包括聚醇類。糖類包含在聚醇類中，其它的聚醇類的例子還有甘油、乙二醇，聚乙二醇及類似物質(zhì)。這些聚醇可單獨使用也可以任何組合方式使用。
顯示出陪伴分子功能的物質(zhì)還包括陪伴蛋白。陪伴蛋白的例子有嗜熱菌的陪伴蛋白及象HSP90、HSP70及HSP60一樣的熱休史蛋白。這些陪伴蛋白可單獨使用也可以任何組合方式使用。
具有陪伴分子功能的物質(zhì)在對酶產(chǎn)生穩(wěn)定作用時會因酶的種類的不同而有不同的最適濃度，即使對同一種酶，不同的底物其最適濃度也不一樣。因此，加入到特定反應系統(tǒng)中的特定物質(zhì)的濃度需要根據(jù)該物質(zhì)的種類及酶(比如反轉(zhuǎn)錄酶)的種類來進行適當?shù)倪x擇。
為了增強象糖類，氨基酸類及陪伴蛋白這些物質(zhì)的陪伴分子功能效果，除了使用以上一種或幾種物質(zhì)外，還應加入一種或多種聚醇類物質(zhì)。聚醇類物質(zhì)包括甘油，乙二醇，聚乙二醇及類似物質(zhì)。
按照本發(fā)明提供的方法，可以在高溫下提高象聚合酶或限制酶一類酶的活性。例如，本文所用術語“高溫”是指例如45-110℃。但是，一種酶在多少攝氏度下可以穩(wěn)定是根據(jù)酶的不同種類而有所不同。一種通常在常溫下使用的酶在高于常溫的高溫下能夠穩(wěn)定，一種抗熱性酶在比其最適溫度更高的溫度下能穩(wěn)定。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，不僅象聚合酶及限制酶這一類酶的抗熱性能夠提高，而且通過使用上述具有陪伴分子功能的物質(zhì)還能使這些酶在高溫下的酶活性增強。
實施例現(xiàn)在根據(jù)以下實施例對本發(fā)明作進一步詳細的闡述。實施例1通過逆轉(zhuǎn)錄酶的抗熱性來提高逆轉(zhuǎn)錄效率為了在高溫下檢測Superscript II的逆轉(zhuǎn)錄活性，在體外通過T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的以RNA為模板來合成cDNA，并對產(chǎn)物進行鑒定。通過利用在體外轉(zhuǎn)錄的RNA為模板并用電泳檢測所得產(chǎn)物，可以對樣品的逆轉(zhuǎn)錄效率進行相互比較，這樣就可以評價會導致逆轉(zhuǎn)錄提前終止的非特異性轉(zhuǎn)錄終止和/或反應效率的降低。模板RNA是由T7 RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄pBluescript iI SK獲得的，在限制酶NotI的作用下，pBluesecript II SK已被裂解為線性分子。該反應起始于T7啟動子。這一點已在pBluescript II SK的說明書中進行了描述。
作為對照，使用如下的標準緩沖液條件50mM Tris-鹽酸，pH為8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇(DTT)，0.75mMdNTP(dATP，dGTP，dCTP及dTTP中各一種)。
在上述標準緩沖液的條件下，準備1μg模板RNA，400ng引物(20merSK引物，CGCTCTAGAACTAGTGGATC)及200個單位的Superscript II，最終將溶液體積調(diào)整到20μl。用0.2μl的[α32-P]dGTP標記逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在其它的底物加入之前將RNA及其引物在65℃下溫育。然后，在42℃下反應一小時。用變性瓊脂糖電泳對反應產(chǎn)物進行檢測，通過放射自顯影對泳帶的檢測來評價全長cDNA的回收情況及由于不完全延長獲得的短鏈產(chǎn)物的產(chǎn)率。結果見圖1中的第一泳道。
在上述標準緩沖液條件下，逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript II在50℃時失活。
在逆轉(zhuǎn)錄反應中使用如下的緩沖液條件是為了證明加入寡糖后能夠?qū)γ阜磻鸱€(wěn)定作用50mM Tris-鹽酸，pH為8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，0.75mM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP各0.75mM)，20％(WN)海藻糖及20％(w/v)的甘油。
在上述緩沖液條件下，將1μg的模板RNA，400ng的引物(20merSK引物)及200單位的約Superscript II在24μl的水溶液中反應。用0.2μl的[α32-P]dGTP對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行標記。在這種條件下，逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII顯示出比在將反應控制在常溫(42℃)下更高的活性。在37℃下，將引物及模板退火2分鐘且在60℃下測定酶活性。
同上文描述的一樣，用變性瓊脂糖電泳對反應產(chǎn)物進行檢測，通過放射性自顯影進行檢測，從而評價全長cDNA的回收率及由于不完全延長而獲得的短鏈產(chǎn)物的產(chǎn)率。結果見圖1。
如泳道1所示，可以看到在42℃標準緩沖液條件下由于逆轉(zhuǎn)錄非特異性終止或在特異性位點上逆轉(zhuǎn)錄提前終止而獲得的產(chǎn)物。
如泳道2所示，類似泳道1在42℃下，既使加入20％的海藻糖及20％的甘油，上述由于逆轉(zhuǎn)錄提前終止而獲得的產(chǎn)物仍可見到。
如泳道3所示，將溫度提高到60℃后，由于逆轉(zhuǎn)錄提前終止而合成的產(chǎn)物的量變得很少而合成了全長產(chǎn)物。
如泳道5所示，當在泳道3的反應條件下加入0.125μg/μl的牛血清白蛋白(BSA)后，酶活性得到了進一步穩(wěn)定。但是，如果不加入20％的海藻糖和20％的甘油，而只加入BSA，那么就不能使酶具有足夠的抗熱性能。
如泳道4所示，當在泳道3的反應條件下加入0.05％的Triton×100后，不完全逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將進一步減少。但是，逆轉(zhuǎn)錄酶的全部活性也略微有所降低。實施例2除了用葡萄糖和甘露糖來代替海藻糖外，其它反應條件均與實施例1中的泳道3一樣。電泳圖再一次表明由提前終止合成所得產(chǎn)物的量變得很少，同時與實施例1中泳道3一樣，合成了全長分子產(chǎn)物。實施例3除了用阿糖醇、山梨糖、果糖、木糖糖或甜菜堿來代替海藻糖外，其余的反應條件均與實施例1中的泳道3一樣。電泳圖再次顯示出與實施例1中的泳道3的結果相類似，由提前終止合成所得產(chǎn)物的量變得很少而合成了全長分子產(chǎn)物。實施例4反應溶液(每份20μl)包括一種限制酶，0.5單位的StyI，它的底物，0.5μgλDNA及0～0.6M的甜菜堿或者0～3.6M的肌氨酸，將它們分別在37℃、45℃、50℃、55℃或60℃下溫育1小時。為了防止酶反應在溫育前就開始進行，樣品的準備工作應在冰浴下盡快完成。溫育結束后，應在反應液中加入0.25％的溴藍，0.26％的二甲苯靛(XC)，30％的甘油及120mM的EDTA(4μl)以終止反應。將所得溶液在65℃下加熱5分鐘從而使COS位點解鏈，再用含0.05％溴化乙錠的0.8％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。用了甜菜堿的樣品的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。用了肌氨酸的樣品的瓊脂糖凝膠電泳結果的照片如圖3所示。
電泳后，對凝膠進行圖像分析。通過與1kbp處(帶箭頭)的泳帶強度進行比較來表示酶活。用了甜菜堿的樣品是以使用0M甜菜堿并在37℃下溫育的樣品作為標準(100)的。使用了甜菜堿的Sty I的相對活性的檢測結果見圖4。用了肌氨酸的樣品是以使用0M肌氨酸并在37℃下溫育的樣品作為標準(100)的。用了肌氨酸的StyI的相對活性的檢測結果見圖5。
從結果中可以看出，通過加入適宜濃度的甜菜堿或肌氨酸可以使限制酶的活性在高溫下被激活。
權利要求
1.一種在高溫下提高酶活性的方法，包括在含有該酶的反應混和物中加入具有陪伴分子功能的物質(zhì)。
2.權利要求1所述的方法，其中反應混和物處于45～110℃。
3.權利要求1所述的方法，其中具有陪伴分子功能的物質(zhì)是選自糖，聚醇、氨基酸及其衍生物以及陪伴蛋白中的一種或幾種。
4.權利要求3所述的方法，其中糖是選自海藻糖，甘露糖、葡萄糖、庶糖、乳糖、木二糖、瓊脂二糖、纖維二糖、果二糖、quitobiose、2-β-glucuronosylglucuronic acid，阿洛糖、半乳糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、山梨醇、果糖、木糖醇及阿糖醇中的一種或幾種。
5.權利要求4所述的方法，其中糖類是指海藻糖，山梨醇，果糖、木糖醇及阿糖醇。
6.權利要求3所述的方法，其中氨基酸是選自Ne-乙?；?β-賴氨酸，丙氨酸，γ-氨基丁酸，甜菜堿，Na-氨基甲酰-L-谷氨酸-酰氨，膽堿，二甲基噻亭，ecotine，谷氨酸，β-谷氨酰氨，甘氨酸，章魚堿，脯氨酸，肌氨酸，?；撬峒叭装種-氧化物中的一種或幾種。
7.權利要求6所述的方法，其中的氨基酸及其衍生物是指甜菜堿或肌氨酸。
8.權利要求3所述的方法，其中的陪伴蛋白來自嗜熱菌或熱休克蛋白。
9.權利要求1的方法，其中反應混和物中加入一種或多種聚醇。
10.權利要求1的方法，共中的酶是聚合酶或限制酶。
11.權利要求10的方法，其中的聚合酶是逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶。
全文摘要
一種將糖類等具有陪伴分子功能的物質(zhì)加入到含有酶的反應混和物中,從而在高溫下提高酶活的方法。本方法能夠方便而高效地提高酶的活性,從而能在高溫下使酶活性提高。
文檔編號C12N9/12GK1177638SQ97118060
公開日1998年4月1日 申請日期1997年7月25日 優(yōu)先權日1996年7月25日
發(fā)明者林崎良英 申請人:理化學研究所