專利名稱：基于磁珠法從植物葉片中提取基因組dna的試劑盒及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的試劑盒及其提取方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，基因組DNA成為了一個重要的研究課題，基因組DNA對生物的生長、遺傳、變異等生命過程起著控制作用。對基因組DNA的研究，首先涉及到基因組DNA的提取。對于植物來說，提取基因組DNA的主要步驟是破壁、破膜、去除雜質(zhì)、漂洗和洗脫。首先，在提取的過程當(dāng)中使用SDS或者CTAB等去污試劑可以破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)沉淀下來，從而將細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA釋放；其次，利用高鹽沉淀的方法或者氯仿酚抽提的方法去除蛋白質(zhì)、多酚和多糖等雜質(zhì)；然后，在提取的上清中加入適量體積的乙醇、異丙醇和PEG等溶劑，使得基因組DNA吸附在硅膠柱、硅膠磁珠和玻璃珠離子交換柱等介質(zhì)上；再加入漂洗液進(jìn)行漂洗，最后是加入洗脫液將基因組DNA從介質(zhì)上洗脫下來。目前，市面上核酸純化普遍使用的吸附介質(zhì)是硅膠柱，硅膠柱采取的固體介質(zhì)為纖維狀的硅膠膜，主要成分都是二氧化硅。基本原理為核酸在高鹽，低溫，低PH或者合適濃度的乙醇和異丙醇的情況下(不能低于4. 0)能夠選擇性地與硅膠柱或者磁珠結(jié)合，而在高溫，低鹽，高PH的情況下，能夠從硅膠柱上或者磁珠被洗脫下來。大部分情況下，核酸與硅膠柱的結(jié)合需要加入一定量的乙醇或者異丙醇，片段越小，加入的量越大，吸附率不高。植物基因組DNA的提取方法一般有CTAB法、SDS法和高鹽法。CTAB法有很好的去污效果，因為CTAB是一種去污劑，在加熱的情況下，能有效的裂解植物細(xì)胞，同時CTAB還可以和糖類進(jìn)行結(jié)合，并通過離心作用將多糖去除。CTAB法也被應(yīng)用于多種植物基因組DNA的提取，但是目前通用的CTAB法試劑盒使用起來操作繁瑣，而且，一般會與氯仿酚等有毒的有機(jī)溶液配合使用。SDS法是基因組DNA提取的傳統(tǒng)方法，不但用于植物基因組DNA的提取，也用于其他組織DNA的提取，比如細(xì)胞，動物組織，血液。SDS是一種陰離子表面活性劑，在加熱的情況下，可以裂解研磨過后的植物細(xì)胞，并且SDS還可以與K離子反應(yīng)，產(chǎn)生白色絮狀物質(zhì)，這種物質(zhì)可以與蛋白結(jié)合，通過離心一起沉淀。但是SDS法也有一定的缺陷，在裂解和離開的過程當(dāng)中消耗的時間較長。提供一種現(xiàn)有技術(shù)中的植物基因組DNA的提取方法-CTAB法，其包括如下步驟步驟I、取新鮮植物葉片(不超過IOOmg)或者干燥組織(不超過50mg)，放于研缽，加入液氮研磨充分； 步驟2、研磨后材料全部轉(zhuǎn)移到2mL離心管，加入，加入500 u LCTAB裂解液(IOOmmoI/L Tris-HCl, pH8. 0 ；50mmol/L EDTA, pH8. 0 ；1. Omol/L NaCl ;2 % CTAB ;2 %PVP40)和20 L P -巰基乙醇，瞬時渦旋后置于60°C水浴鍋中，水浴30min (干燥組織可酌情延長時間);步驟3、加入600 i! L氯仿/異戊醇(24 : I)，漩渦振蕩混勻，并在12，OOOrpm下離心 IOmin ；步驟4、小心吸取300 u L上清至一新的2mL離心管中，避免吸起沉淀，加入混合液300 u L無水乙醇和20 ii L磁珠溶液，充分渦旋混勻；步驟5、室溫靜置5min，離心管上磁力架，靜置Imin ；步驟6、吸去上清，加入70%乙醇，離心管下磁力架，充分渦旋混勻，靜置lmin，離心管上磁力架；
步驟7、重復(fù)操作步驟6 —次；步驟8、離心管置于磁力架上風(fēng)干IOmin ；步驟9、加入100-150ii L預(yù)熱(65°C )洗脫液。離心管下磁力架，充分渦旋混勻，在65 °C水中進(jìn)行水浴5min ；步驟10、離心管置于磁力架上，靜置2min ；步驟11、小心將上清吸出，備用。該技術(shù)方案仍然存在一些缺點I、通用性不強(qiáng)。對于提取水稻，小麥等普通植物的基因組DNA效果良好，但是對于提取棉花，葡萄，黑加侖這些多糖、多酚、單寧、脂質(zhì)等次生代謝物含量豐富的植物葉片組織的基因組DNA的時候，其純化成功率較低，無法徹底去除多酚，多酚類物質(zhì)。多酚在提取的過程中會有氧化而產(chǎn)生褐變，多糖等物質(zhì)與基因組DNA結(jié)合后會產(chǎn)生粘稠的膠狀物，這2種情況都容易造成基因組DNA降解，導(dǎo)致提取的基因組DNA純度不高。2、裂解液在裂解研磨后的葉片組織，需要在60°C水浴加熱30min，同時需要離心時間IOmin,這些步驟消耗的時間過多。3、提取棉花等次生代謝物含量豐富的植物葉片組織的基因組DNA時，需要加入有害的有機(jī)溶劑氯仿等，對于操作人員的健康不利，同時產(chǎn)生的廢液也會造成污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種可以適用于棉花，葡萄，黑加侖等植物的基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的試劑盒及其提取方法。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供的基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的試劑盒，其包括預(yù)處理溶液，快速裂解液，DNA結(jié)合液、磁珠懸浮液和洗脫液，預(yù)處理溶液0. 05M 0. 2M Tris-HcUO. 01 0. 05M EDTA (乙二胺四乙酸)、體積比為I % 3 %的巰基乙醇、質(zhì)量/體積比為0. 5 % 2 %的PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，快速裂解液50 100mmol/L KAC(醋酸鉀)，PH = 5. 2、10 50mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)、4 6M GHCL(鹽酸狐)、5 25mM sodium citrate (朽1樣酸納)、I 5%Tween 20 (聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯)，DNA結(jié)合液質(zhì)量/體積比為5 % 10 %的PEGS000(聚乙二醇8000)、1. 5-4MGITC (異硫氰酸胍)，0. 5-1M NaCl，磁珠懸浮液磁珠溶于超純水中，其中磁珠的濃度為50-100mg/mL,洗脫液1 IOmM Tris-HCl、l-2mM EDTA (乙二胺四乙酸)，pH = 8.0。
其有益效果是，預(yù)處理溶液可以有效的破解細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，但是不能破壞細(xì)胞核，由于基因組DNA位于細(xì)胞核內(nèi)，而多糖、多酚、單寧等則存在于細(xì)胞質(zhì)中，由于多糖、多酚、單寧會溶于預(yù)處理溶液內(nèi)，所以通過預(yù)處理溶液可以有效的去除多糖、多酚、單寧等雜質(zhì)對于基因組DNA提取的干擾裂解液以鹽酸胍和Tween 20為主要成分，常溫條件下能夠在2min內(nèi)充分裂解植物細(xì)胞，并且后續(xù)的離心步驟只要2min即可，大大節(jié)約了操作時間。鹽酸胍為強(qiáng)變性劑，其裂解細(xì)胞的效果遠(yuǎn)好于CTAB和SDS。采用2倍體積的5% PEG, 4M GITC和0. 5M NaCl溶液代替無水乙醇作為DNA結(jié)合
液，效果更好，得率更高。而且，本發(fā)明采用的技術(shù)方案當(dāng)中，不需要加入有機(jī)溶劑氯仿等，不會對操作人員
產(chǎn)生危害，安全可靠。在一些實施方式中，磁珠的顆粒直徑為100-200nm,磁珠表面包被娃輕基。其有益效果是，通過磁珠對基因組DNA產(chǎn)生吸附作用，從而實現(xiàn)對基因組DNA的提取操作，由于納米級別的磁珠外表面為一層二氧化硅，由于磁珠顆粒小，比表面積大，磁珠法的得率一般都要高于硅膠柱式法，更為重要的是，磁珠方更容易實行自動化和高通量。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供的基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的試劑盒的提取方法，其包括步驟一、取植物葉片放于研缽內(nèi)研磨充分，研磨時間為l_2min ；步驟二、若所取植物葉片為棉花，黑加侖，草莓，葡萄等多糖、多酚、單寧、脂質(zhì)含量豐富類的植物葉片，加入500 u L預(yù)處理液，若所取植物為水稻，小麥或者玉米類簡單植物葉片，則直接進(jìn)入步驟三；步驟三、加入500 U L快速裂解液；步驟四、在8，000-12, OOOrpm 下離心 l_3min ；步驟五、小心吸取400 U L上清至一新的2mL離心管中，避免吸起沉淀，加入混合液400-1000 u L DNA結(jié)合液和10-50 u L磁珠懸浮液，充分渦旋混勻；步驟六、在18-25°C下靜置5-10min后，將離心管置于磁力架上，靜置l_3min ；步驟七、吸去上清，加入體積比為70%的乙醇，將離心管從磁力架上取下，充分渦旋混勻后靜置l_3min，再將離心管置于磁力架上；步驟八、將離心管置于磁力架上風(fēng)干5_15min ；步驟九、加入100-150 ii L預(yù)熱65°C的DNA結(jié)合液，將離心管從磁力架上取下，充分渦旋混勻，并在55-80°C水中水浴2-8min ；步驟十、將離心管置于磁力架上，靜置l_2min ；步驟^^一、小心將上清吸出，備用。其有益效果是，本發(fā)明的提取方法尤其適用于棉花，葡萄，黑加侖這些多糖、多酚、單寧、脂質(zhì)等次生代謝物含量豐富的植物葉片組織的基因組DNA提取。在一些實施方式中，在步驟一中，若所取植物葉片為新鮮植物葉，則取量不超過lOOmg，若所取植物葉片為干燥組織，則取量不超過50mg，。其有益效果是，因為新鮮植物葉中含水份較多，所以取量稍大些，而干燥組織的含水量較少，所以取量可以稍小些。在一些實施方式中，在步驟一中，在研缽內(nèi)加入液氮后再進(jìn)行研磨。其有益效果是，利用液氮創(chuàng)造一個低溫環(huán)境，一方面，低溫可以抑制核酸酶的活性，使得基因組DNA免受核酸酶的侵襲，另一方面，低溫可以使物體的脆性增強(qiáng)，從而更便于研磨，而且研磨時也更省力。在一些實施方式中，在步驟七與步驟八之間還包括一步驟，吸去上清，加入體積比為70%乙醇，將離心管從磁力架上取下，充分渦旋混勻后靜置l_3min，再將離心管置于磁力架上。其有益效果是，通過兩次同樣的重復(fù)操作，使得提取的基因組DNA的純度更加的聞。


圖I是本發(fā)明的試劑盒及其提取方法提取的基因組DNA的瓊脂糖電泳對比圖；其中M道為標(biāo)記泳道，1,2泳道為實驗1-1中CTAB方法提取的棉花新鮮嫩葉基因組DNA條帶，3，4泳道為實驗1-1中采用本發(fā)明提取的棉花新鮮嫩葉基因組DNA條帶，5，6泳道為實驗1-2中CTAB方法提取的棉花老葉基因組DNA條帶，7，8泳道為實驗1_2中采用本發(fā)明提取的棉花老葉基因組DNA條帶。圖2是本發(fā)明的試劑盒及其提取方法提取的基因組DNA的又一瓊脂糖電泳對比圖；其中，1，2泳道為實驗2中采用CTAB方法提取的水稻葉片基因組DNA條帶；3，4泳道為實驗2中采用本發(fā)明提取的水稻葉片基因組DNA條帶。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例來進(jìn)一步的闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于解釋說明本發(fā)明，可以有不同形式的等效替換，本實施例不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。I、試劑盒一種基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的試劑盒，其包括預(yù)處理溶液，快速裂解液，DNA結(jié)合液、磁珠懸浮液和洗脫液，預(yù)處理溶液包括0. 2M tris-HCL、0. 05M EDTA、體積比為2%的巰基乙醇和質(zhì)量/體積比為2%的PVP，快速裂解液包括100mmol/LKAC, PH = 5. 2、50mmol/L EDTA、6MGHCl、5mM sodiumcitrate^2% Tween 20,DNA 結(jié)合液包括5% PEG8000、4M GITC，0. 5M NaCl,磁珠懸浮液包括磁珠溶于超純水中，其中磁珠的濃度為50mg/mL，磁珠的顆粒直徑為100-200nm，磁珠表面包被硅羥基，洗脫液包括5mMTris-HClUM EDTA, pH = 8. O其中tris-HCL采用加拿大生物技術(shù)公司(BBI)的BB0079，EDTA采用美國西格瑪公司(Sigma)的E6758，PVP采用加拿大生物技術(shù)公司(BBI)的#PB0436，KAC采用加拿大生物技術(shù)公司(BBI)的PB0438，GHCL采用美國西格瑪公司(Sigma)的#G3272，sodiumcitrate采用美國西格瑪公司(Sigma)的#C8532, Tween 20采用美國西格瑪公司(Sigma)的# 9416沖￡68000采用加拿大生物技術(shù)公司(BBI)的#PB0433，GITC采用美國西格瑪公司(Sigma)的#69277，似(1采用加拿大生物技術(shù)公司(BBI)的ST1218。2、基因組DNA提取方法采用該試劑盒從植物當(dāng)中提取基因組DNA的方法，其步驟包括步驟一、取植物葉片放于研缽內(nèi)，并加入液氮研磨充分，研磨時間為2min ； 步驟二、若所取植物葉片為棉花，黑加侖，草莓，葡萄等多糖、多酚、單寧、脂質(zhì)含量豐富類的植物葉片，加入500 U L預(yù)處理液，若所取植物為水稻，小麥或者玉米類簡單植物葉片，則直接進(jìn)入步驟三；
步驟三、加入500 U L快速裂解液；步驟四、在12，OOOrpm下離心2min ；步驟五、小心吸取400 u L上清至一新的2mL離心管中，在吸取的時候避免吸起沉淀，加入混合液800 u L DNA結(jié)合液和20 ii L磁珠懸浮液，充分渦旋混勻；步驟六、在20°C下靜置5min后，將離心管置于磁力架上，靜置Imin ；步驟七、吸去上清，加入70%乙醇，將離心管從磁力架上取下，充分渦旋混勻后靜置lmin,再將離心管置于磁力架上；步驟八、重復(fù)步驟七的全部操作一次步驟九、將離心管置于磁力架上風(fēng)干IOmin ；步驟十、加入150 預(yù)熱65°C的DNA洗脫液，將離心管從磁力架上取下，充分渦旋混勻，并在65 °C水中水浴5min ；步驟^^一、將離心管置于磁力架上，靜置2min ；步驟十二、小心將上清吸出，備用。3、結(jié)果對比分析將本發(fā)明技術(shù)方案的實驗結(jié)果與現(xiàn)有技術(shù)的CTAB方法的實驗結(jié)果進(jìn)行對比分析。實驗1-1選用IOOmg棉花新鮮嫩葉進(jìn)行基因組DNA的提取。同時采用本發(fā)明的提取方法與現(xiàn)有技術(shù)的CTAB方法同時進(jìn)行。最后均用150 ii L洗脫液實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)對比如表所示
權(quán)利要求
1.基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的試劑盒，其包括預(yù)處理溶液，快速裂解液，DNA結(jié)合液、磁珠懸浮液和洗脫液，預(yù)處理溶液0. 05M 0. 2M Tris-Hcl、0. 01 0. 05M EDTA (乙二胺四乙酸)、I % 3%巰基乙醇、0. 5% 2% PVP(聚乙烯吡咯烷酮)， 快速裂解液50 100mmol/L KAC (醋酸鉀)，PH = 5. 2、10 50mmol/LEDTA (乙二胺四乙酸)、4 6M GHCL (鹽酸狐)、5 25mM sodium citrate (朽1 樣酸納)、I 5% Tween20 (聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯)， DNA 結(jié)合液5% 10%PEG8000(聚乙二醇 8000)、1. 5-4M GITC (異硫氰酸胍)，0. 5-1MNaCl, 磁珠懸浮液磁珠溶于超純水中，其中磁珠的濃度為50-100mg/mL, 洗脫液1 IOmM Tris-HCl、l-2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH = 8. O。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的試劑盒，其中，磁珠的顆粒直徑為100-200nm，磁珠表面包被硅羥基。
3.權(quán)利要求I或2所述的基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的試劑盒的提取方法，其包括 步驟一、取植物葉片放于研缽內(nèi)研磨充分，研磨時間為l_2min ； 步驟二、若所取植物葉片為多糖、多酚、單寧、脂質(zhì)含量豐富類的植物葉片，加入500 u L預(yù)處理液，若所取植物為水稻，小麥或者玉米類簡單植物葉片，則直接進(jìn)入步驟三； 步驟三、加入500 u L快速裂解液； 步驟四、在 8, 000-12, OOOrpm 下離心 l_3min ； 步驟五、小心吸取400 u L上清至一新的2mL離心管中，避免吸起沉淀，加入混合液400-1000 u L DNA結(jié)合液和10-50 u L磁珠懸浮液，充分渦旋混勻； 步驟六、在18-25°C下靜置5-10min后，將離心管置于磁力架上，靜置l_3min ； 步驟七、吸去上清，加入體積比為70%的乙醇，將離心管從磁力架上取下，充分渦旋混勻后靜置l-3min,再將尚心管置于磁力架上； 步驟八、將離心管置于磁力架上風(fēng)干5-15min ； 步驟九、加入100-150 ii L預(yù)熱65°C的DNA結(jié)合液，將離心管從磁力架上取下，充分渦旋混勻，并在55-80°C水中水浴2-8min ； 步驟十、將離心管置于磁力架上，靜置l_2min ； 步驟十一、小心將上清吸出，備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的提取方法，其中步驟一中， 若所取植物葉片為新鮮植物葉，則取量不超過lOOmg， 若所取植物葉片為干燥組織，則取量不超過50mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的提取方法，其中，步驟一中，在研缽內(nèi)加入液氮后再進(jìn)行研磨。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的提取方法，其中，步驟七與步驟八之間還包括一步驟，吸去上清，加入體積比為70%的乙醇，將離心管從磁力架上取下，充分渦旋混勻后靜置l_3min，再將離心管置于磁力架上。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的試劑盒及其提取方法，基于磁珠法從植物葉片中提取基因組DNA的試劑盒，其包括預(yù)處理溶液，快速裂解液，DNA結(jié)合液、磁珠懸浮液和洗脫液，通過預(yù)處理溶液可以有效的破解細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，通過預(yù)處理溶液可以有效的去除多糖、多酚、單寧等雜質(zhì)對于基因組DNA提取的干擾?？焖倭呀庖阂喳}酸胍和Tween 20為主要成分，常溫條件下能夠在2min內(nèi)充分裂解植物細(xì)胞，并且后續(xù)的離心步驟只要2min即可，大大節(jié)約了操作時間。鹽酸胍為強(qiáng)變性劑，其裂解細(xì)胞的效果好，而且，本發(fā)明中不需要加入有機(jī)溶劑氯仿等，不會對操作人員產(chǎn)生危害，安全可靠。
文檔編號C12N15/10GK102618532SQ20121013132
公開日2012年8月1日 申請日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者李宗飛 申請人:姬云, 易春, 李凱, 李宗飛