一種糞便核酸甲基化純化方法
【專利摘要】一種糞便核酸甲基化純化方法，包括以下步驟：提供待100ul糞便溶液至離心管中；向該離心管中1mL裂解液，該裂解液由0.3N氫氧化鈉、0.4M氯化鉀、0.025％N月桂酰肌氨酸鈉、2mM EDTA、0.4M Tris HCL和1.5％曲通X?100組成；向離心管中加入100ul ph值為5.5的轉(zhuǎn)化液，將離心管擱置于75℃的恒溫中90Min；冷卻至室溫加入10ul磁珠溶液，混勻，放置15Min；將離心管放置于磁力架上5Min，去掉清液；重復(fù)上述第二步驟至第六步驟動作，直至磁珠分離后，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中。
【專利說明】
一種糞便核酸甲基化純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種糞便核酸甲基化純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過程。可形成各種甲基化合物，或是對某些蛋白質(zhì)或核酸等進(jìn)行化學(xué)修飾形成甲基化產(chǎn)物。在生物系統(tǒng)內(nèi)，甲基化是經(jīng)酶催化的，這種甲基化涉及重金屬修飾、基因表達(dá)的調(diào)控、蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)以及核糖核酸(RNA)加工。
[0003]DNA甲基化:脊椎動物的DNA甲基化一般發(fā)生在CpG位點(diǎn)(胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(diǎn)，S卩DNA序列中胞嘧啶后緊連鳥嘌呤的位點(diǎn))。經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。人類基因中約80 % -90 %的CpG位點(diǎn)已被甲基化，但是在某些特定區(qū)域，如富含胞嘧啶和鳥嘌呤的CpG島則未被甲基化。這與包含所有廣泛表達(dá)基因在內(nèi)的56%的哺乳動物基因中的啟動子有關(guān)。1%_2%的人類基因組是CpG群，并且CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比。
[0004]用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化;反之，說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化。
[0005]現(xiàn)階段，核酸自動化提取過程包含:樣本裂解、磁珠吸附、洗滌純化、核酸洗脫，其過程復(fù)雜，步驟較多，造成處理基因的DNA損耗較多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種糞便核酸甲基化純化方法，其目的為減小提取步驟、提尚純化效率。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種糞便核酸甲基化純化方法，包括以下步驟:
[0008]步驟一:提供待10ul糞便溶液至離心管中；
[0009]步驟二:向該離心管中ImL裂解液，該裂解液由0.3N氫氧化鈉、0.4M氯化鉀、
0.025%N月桂酰肌氨酸鈉、2mM EDTA、0.4M Tris HCL和1.5% 曲通X-100組成；
[0010]步驟三:向離心管中加入10ulPh值為5.5的轉(zhuǎn)化液，該轉(zhuǎn)化液含有亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫銨中任一種；
[0011]步驟四:將離心管擱置于75°C的恒溫中90Min;
[0012]步驟五:冷卻至室溫加入1ul磁珠溶液，混勻，放置15Min;
[0013]步驟六:將離心管放置于磁力架上5Min，去掉清液；
[0014]步驟七:重復(fù)上述第二步驟至第六步驟動作，直至磁珠分離后，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明糞便核酸甲基化純化方法的有益效果在于:裂解樣本(糞便)與亞硫酸鹽處理同時(shí)進(jìn)行，在裂解液中直接轉(zhuǎn)變核酸樣本中未被甲基化的C堿基為U堿基，然后加入與甲基化序列互補(bǔ)并固定于磁珠的核酸片段，特異純化甲基化核酸，減小提取步驟、提高純化效率。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0017]一種糞便核酸甲基化純化方法，包括以下步驟:
[0018]步驟一:提供待10ul糞便溶液至離心管中；
[0019]步驟二:向該離心管中ImL裂解液，該裂解液由0.3N氫氧化鈉、0.4M氯化鉀、
0.025%N月桂酰肌氨酸鈉、2mM EDTA、0.4M Tris HCL和1.5% 曲通X-100組成；
[0020]步驟三:向離心管中加入10ulph值為5.5的轉(zhuǎn)化液，該轉(zhuǎn)化液含有亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫銨中任一種；
[0021]步驟四:將離心管擱置于75°C的恒溫中90Min;
[0022]步驟五:冷卻至室溫加入1ul磁珠溶液，混勻，放置15Min;
[0023]步驟六:將離心管放置于磁力架上5Min，去掉清液；
[0024]步驟七:重復(fù)上述第二步驟至第六步驟動作，直至磁珠分離后，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中。
[0025]裂解樣本(糞便)與亞硫酸鹽處理同時(shí)進(jìn)行，在裂解液中直接轉(zhuǎn)變核酸樣本中未被甲基化的C堿基為U堿基，然后加入與甲基化序列互補(bǔ)并固定于磁珠的核酸片段，特異純化甲基化核酸，減小提取步驟、提高純化效率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種糞便核酸甲基化純化方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:提供待10ul糞便溶液至離心管中； 步驟二:向該離心管中ImL裂解液，該裂解液由0.3N氫氧化鈉、0.4M氯化鉀、0.025 % N月桂酰肌氨酸鈉、2mM EDTA、0.4M Tris HCL和1.5%曲通X-100組成； 步驟三:向離心管中加入10ul ph值為5.5的轉(zhuǎn)化液，該轉(zhuǎn)化液含有亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鎂、亞硫酸氫銨中任一種； 步驟四:將離心管擱置于750C的恒溫中90Min; 步驟五:冷卻至室溫加入1ul磁珠溶液，混勻，放置15Min; 步驟六:將離心管放置于磁力架上5Min，去掉清液； 步驟七:重復(fù)上述第二步驟至第六步驟動作，直至磁珠分離后，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中。
【文檔編號】C12N15/10GK106047858SQ201610382843
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】陳華, 譚淼
【申請人】蘇州海苗生物科技有限公司