一種磁性海藻酸鈉固化漆酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種磁性海藻酸鈉固化漆酶的制備方法，屬于固定化酶制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶是一種含銅多酚氧化酶，廣泛存在于真菌、細(xì)菌和植物中。漆酶具有較廣泛的底物專一性和較強(qiáng)的穩(wěn)定性，能催化許多酚類和芳香胺類物質(zhì)，如苯酚、對氯苯酚、苯胺以及多酚和多胺類物質(zhì)，因而在生物傳感器、生物燃料電池、生物轉(zhuǎn)化及廢水處理等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。但是由于漆酶易溶于水，在水中游離的漆酶不可回收也不能長期保存，且在高溫或其他極端環(huán)境下漆酶的穩(wěn)定性不易保持，因而限制了漆酶的實(shí)際應(yīng)用。
[0003]游離的漆酶因在使用過程中易隨環(huán)境的變化變性失活、易混入產(chǎn)品和不易循環(huán)利用等使其應(yīng)用受到限制，對漆酶進(jìn)行固定化是實(shí)現(xiàn)其重復(fù)利用、改善其穩(wěn)定性的有效方法。固定化漆酶是指將水溶性漆酶以物理或化學(xué)的方法固定在有機(jī)或無機(jī)載體上，形成不溶于水的具有酶活性的衍生物，在催化反應(yīng)中，它以固相狀態(tài)作用于底物，反應(yīng)完成后，容易與水溶性反應(yīng)物分離，可反復(fù)使用。
[0004]固定化技術(shù)在保持游離漆酶的專一、高效的催化活性的同時(shí)，且比水溶性酶穩(wěn)定，可較長期使用，更是提高漆酶重復(fù)利用性、操控性和穩(wěn)定性的有效手段，常用的固定化載體包括活性炭、殼聚糖、多孔硅膠以及微濾膜等多種材料，但現(xiàn)有的固定化材料存在固定化效率低、加工工藝復(fù)雜、分離困難以及操作性不高等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對目前傳統(tǒng)漆酶易溶于水，在水中游離不可回收也不能長期保持，且在高溫或其他極端環(huán)境下穩(wěn)定性不易保持，容易變性失活，因此限制了應(yīng)用，而常用的固定化技術(shù)雖可以保持游離漆酶的催化活性，提高利用率和穩(wěn)定性，但使用的固定化材料存在固定化效率低、加工工藝復(fù)雜、分離困難以及操作性不高等現(xiàn)狀，提供了一種利用產(chǎn)漆菌種發(fā)酵制得漆酶酶液，摻加磁性粒子，輔以海藻酸鈉對其固定，振蕩吸附后干燥，從而得到磁性海藻酸鈉固定化漆酶。該方法工藝簡單，成本低廉，制得的磁性海藻酸鈉固定化漆酶不僅活力在250IU/mL以上，總產(chǎn)量也提高至85?90%，均達(dá)到了較高水平，而且納米級磁性粒子的摻入使其更容易進(jìn)行吸附，易于分離，使得固定化漆酶回收率提高，穩(wěn)定性也得到顯著增強(qiáng)，具有優(yōu)異的性能。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)按接種量為培養(yǎng)基底物質(zhì)量5?7%將白毒鵝膏菌接種到裝有50?10mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，放置在搖床上在25?30°C下以100?200rpm的速率恒溫振蕩培養(yǎng)3?5天，用無菌水淋洗菌絲表面并收集淋洗液，得到菌絲懸浮液，于4?6°C下保存；
(2)向80?10mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別加入I?2%(w/v)茶葉、I?2%(w/v)豆柏和I?2%( w/v)蔗渣組成的混合物以及5?I OmL濃度為0.5mo I /L硫酸銅溶液，混合均勻后再加入20?25mL上述制備的菌絲懸浮液，放入恒溫箱在25?35°C下發(fā)酵7?8天，再將發(fā)酵液移入臥式離心機(jī)，以7000?9000r/min轉(zhuǎn)速離心分離，得上清液即為漆酶酶液，備用；
(3)按摩爾比為3: 2將濃度為0.3mol/L氯化鐵和0.2mol/L氯化亞鐵溶液混合均勻，取100?200mL混合液裝入300mL三口燒瓶中，用質(zhì)量濃度為17%氨水調(diào)節(jié)pH至9?10后，向燒瓶中以10mL/min速率持續(xù)通入氮?dú)獠⒁迫胨″佒?，升溫?5?85°C保溫熟化30?40min，在磁場作用下吸附分離，得納米級磁性粒子；
(4)取I?3g納米級磁性粒子在超聲作用下分散于40?50mL濃度為10%海藻酸鈉溶液中，制得混合液，用注射器向制得的混合液中注入200?300mL蓖麻油并移入高剪切乳化機(jī)，以12000?13000r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行乳化，在乳化過程中再逐滴滴入5?1mL蔗糖脂肪酸酯，滴加完畢后繼續(xù)乳化5?1min;
(5)乳化結(jié)束后將乳化液倒入400?500mL質(zhì)量濃度為5%氯化鈣溶液中，用攪拌棒攪拌均勻后靜置沉淀過夜，再過濾分離得到沉淀物，將得到的沉淀物用含有5%脂肪酸甘油酯水溶液沖洗I?2h，放入烘箱在105?110°C下干燥至恒重；
(6)稱取20?30g上述沖洗干燥后的烘干物放入裝有300?500mL步驟(2)制備的漆酶酶液的漩渦振蕩儀中，以30?50W功率在30?40°C下振蕩吸附12?24h后濾出，真空干燥后即得一種磁性海藻酸鈉固化漆酶。
[0007]所述的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基是由I?1.2L馬鈴薯浸出液、15?25g葡萄糖、2?3g蛋白胨、3?5g磷酸二氫鉀和2?4g硫酸鎂混合而成。
[0008]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:使用時(shí)，取本發(fā)明制得的磁性海藻酸鈉固定化漆酶加入廢水池中，其中加入量為每I?3L廢水中加入5?1g固定化漆酶，加入完畢后對池底進(jìn)行曝氣，使固定化酶與廢水充分混合均勻，處理3?5h后，檢測廢水，測得廢水中的COD從原來的3000?5000mg/L降低到了300?500mg/L，去除率達(dá)到了90 %以上，處理結(jié)束后用磁性裝置回收固定化酶即可。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明操作簡便，大大降低了生產(chǎn)成本；
(2)本發(fā)明制得的磁性海藻酸鈉固定化漆酶活力在250IU/mL以上，總產(chǎn)量提高至85%以上，均達(dá)到了較高水平，具有廣泛的工業(yè)使用價(jià)值和顯著的經(jīng)濟(jì)效益；
(3)本發(fā)明利用納米級磁性粒子對固定化漆酶進(jìn)行吸附，易于分離，使其活性回收率尚，提尚了漆酶的穩(wěn)定性；
(4)本發(fā)明制得的磁性海藻酸鈉固定化漆酶活性高，可以廣泛應(yīng)用于紡織印染、造紙、草坪修復(fù)、能源再生、飼料、食品、廢水處理等方面。
【具體實(shí)施方式】
[0010]首先按接種量為培養(yǎng)基底物質(zhì)量5?7%將白毒鵝膏菌接種到裝有50?10mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，放置在搖床上在25?30°C下以100?200rpm的速率恒溫振蕩培養(yǎng)3?5天，用無菌水淋洗菌絲表面并收集淋洗液，得到菌絲懸浮液，于4?6°C下保存;然后向80?10mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別加入I?2%(w/v)茶葉、I?2%(w/v)豆柏和I?2%(w/V)鹿渣組成的混合物以及5?1mL濃度為0.5moI/L硫酸銅溶液，混合均勾后再加入20?25mL上述制備的菌絲懸浮液，放入恒溫箱在25?35°C下發(fā)酵7?8天，再將發(fā)酵液移入臥式離心機(jī)，以7000?9000r/min轉(zhuǎn)速離心分離，得上清液即為漆酶酶液，備用；隨后按摩爾比為3:2將濃度為0.3mol/L氯化鐵和0.2mol/L氯化亞鐵溶液混合均勻，取100?200mL混合液裝入300mL三口燒瓶中，用質(zhì)量濃度為17%氨水調(diào)節(jié)pH至9?10后，向燒瓶中以1mL/min速率持續(xù)通入氮?dú)獠⒁迫胨″佒?，升溫?5?85°C保溫熟化30?40min，在磁場作用下吸附分離，得納米級磁性粒子;接下來取I?3g納米級磁性粒子在超聲作用下分散于40?50mL濃度為10%海藻酸鈉溶液中，制得混合液，用注射器向制得的混合液中注入200?300mL蓖麻油并移入高剪切乳化機(jī)，以12000?13000r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行乳化，在乳化過程中再逐滴滴入5?1mL蔗糖脂肪酸酯，滴加完畢后繼續(xù)乳化5?1min;乳化結(jié)束后將乳化液倒入400?500mL質(zhì)量濃度為5%氯化鈣溶液中，用攪拌棒攪拌均勻后靜置沉淀過夜，再過濾分離得到沉淀物，將得到的沉淀物用含有5%脂肪酸甘油酯水溶液沖洗I?2h，放入烘箱在105?110°C下干燥至恒重；最后稱取20?30g上述沖洗干燥后的烘干物放入裝有300?500mL上述制備的漆酶酶液的漩渦振蕩儀中，以30?50W功率在30?40°C下振蕩吸附12?24h后濾出，真空干燥后即得一種磁性海藻酸鈉固化漆酶。其中所述的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基是由I?1.2L馬鈴薯浸出液、15?25g葡萄糖、2?3g蛋白胨、3?5g磷酸二氫鉀和2?4g硫酸鎂混合而成。
[0011]實(shí)例I
首先按接種量為培養(yǎng)基底物質(zhì)量5%將白毒鵝膏菌接種到裝有50mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，放置在搖床上在25°C下以10rpm的速率恒溫振蕩培養(yǎng)3天，用無菌水淋洗菌絲表面并收集淋洗液，得到菌絲懸浮液，于4°C下保存;然后向80?10mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中分別加入l%(w/v)茶葉、l%(w/v)豆柏和l%(w/v)鹿渣組成的混合物以及5mL濃度為
0.5mol/L硫酸銅溶液，混合均勻后再加入20mL上述制備的菌絲懸浮液，放入恒溫箱在25°C下發(fā)酵7天，再將發(fā)酵液移入臥式離心機(jī)，以7000r/min轉(zhuǎn)速離心分離，得上清液即為漆酶酶液，備用；隨后按摩爾比為3:2將濃度為0.311101/1氯化鐵和0.21]101/1氯化亞鐵溶液混合均勻，取100mL混合液裝入300mL三口燒瓶中，用質(zhì)量濃度為17%氨水調(diào)節(jié)pH至9后，向燒瓶中以10mL/min速率持續(xù)通入氮?dú)獠⒁迫胨″佒校郎刂?5°C保溫熟化30min，在磁場作用下吸附分離，得納米級磁性粒子;接下來取Ig納米級磁性粒子在超聲作用下分散于40mL濃度為10%海藻酸鈉溶液中，制得混合液，用注射器向制得的混合液中注入200mL蓖麻油并移入高剪切乳化機(jī)，