14] (2)取決于反應(yīng)pH的酶活性的比較評(píng)估
[0115] 為了鑒別取決于反應(yīng)pH的酶活性變化，將實(shí)例5中獲得的經(jīng)純化的酶添加到10 重量％果糖、O.OlmM NiS04、磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，并且反應(yīng)3小時(shí)。 具體來說，使用在pH 5到pH 8.0下的磷酸鉀緩沖液（potassium phosphate buffer)，和使 用在pH 8. 0到pH 8. 5下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液（Tris buffer)。如圖8中所示，在不 同反應(yīng)pH下測量酶活性。當(dāng)使用磷酸鉀緩沖液時(shí)和當(dāng)使用三羥甲基氨基甲烷緩沖液時(shí)，酶 活性顯示隨著pH增加而增加的趨勢(shì)。在相同pH下，當(dāng)使用三羥甲基氨基甲烷緩沖液時(shí)，觀 測到酶活性下降。
[0116] (3)取決于金屬鹽種類的酶活性的比較評(píng)估
[0117] 為了鑒別取決于金屬鹽種類的酶活性變化，將實(shí)例5中獲得的經(jīng)純化的酶添加到 10重量％果糖和50mM磷酸鹽緩沖液中，并且反應(yīng)3小時(shí)。在這一反應(yīng)中，使用ImM的13種 不同金屬鹽。
[0118] 因此，在按活性降序列舉金屬鹽（參見圖9)后，金屬鹽顯示按次序NiS04>NiCl 2> CoCl2> MnCl 2= ZnS〇J9不同酶活性。
[0119] (4)通過酶反應(yīng)的邊緣轉(zhuǎn)化率的評(píng)估
[0120] 為了鑒別取決于底物濃度的酶活性變化，將實(shí)例5中獲得的經(jīng)純化的酶添加到10 重量％果糖、0. 3mM NiS04以及50mM磷酸鹽緩沖液中，并且接著在60°C下反應(yīng)3小時(shí)。為 了評(píng)估邊緣轉(zhuǎn)化率，進(jìn)行酶反應(yīng)18小時(shí)。參照?qǐng)D10,可以看出當(dāng)使用改善型酶突變體時(shí)，從 果糖到塔格糖的轉(zhuǎn)化率是30%。
[0121] 實(shí)例 7
[0122] 果糖和塔格糖的色譜分離
[0123] 將實(shí)例5中獲得的經(jīng)純化的酶添加到10重量％果糖、0.0 lmM NiS04以及50mM磷 酸鹽緩沖液中，并且接著在60°C下反應(yīng)3小時(shí)。將所獲得的塔格糖混合溶液添加到0. 1到 0· 5% (wt/v)活性碳粉末（power activated carbon)，接著在 lOrpm 到 lOOrpm 下攬摔 0· 5 小時(shí)到1小時(shí)，通過壓濾機(jī)過濾以去除有色材料，從而獲得果糖和塔格糖的混合溶液。
[0124] 為了通過色譜法從果糖和塔格糖的混合溶液有效分離果糖和塔格糖，使混合溶液 流動(dòng)通過裝有經(jīng)氫基取代的陽離子交換樹脂和經(jīng)羥基取代的陰離子交換樹脂的色譜柱，從 而去除溶液中的離子組分。
[0125] 通過上述脫色和脫鹽過程，獲得去除如有色材料和離子組分的雜質(zhì)的由果糖生產(chǎn) 的塔格糖的混合溶液。將混合溶液濃縮到60% (g/g溶液）并且接著使用裝有經(jīng)鈣基團(tuán) 取代的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂（安伯來特CR1310 Ca)的高級(jí)模擬移動(dòng)床系統(tǒng)（Advanced Simulated Moving-bed System;日本有機(jī)（Organo, Japan))進(jìn)行分級(jí)色譜法，從而測量組 分的純度（purity)、回收產(chǎn)率（recovery yield)以及從果糖轉(zhuǎn)化的塔格糖的混合進(jìn)料與 作為移動(dòng)相的水之間的比率（解吸劑/進(jìn)料的體積比）。
[0129] 實(shí)例 8
[0130] 塔格糖的結(jié)晶
[0131] 對(duì)從實(shí)例7的色譜分離收集的溶液進(jìn)行結(jié)晶。通過在真空下加熱濃縮溶液，使得 塔格糖濃度變?yōu)?0Bx，接著以每小時(shí)0. 7°C到1°C的速率從60°C緩慢冷卻到30°C來進(jìn)行結(jié) 晶。
[0132] 在結(jié)晶后，對(duì)所得晶體進(jìn)行離心脫水以采集晶體。使用流化床干燥器在60°C下干 燥晶體1小時(shí)以測量晶體的純度和回收產(chǎn)率。
[0133] 表 9
[0134] [表 9]
[0135] 結(jié)晶結(jié)果的概述
[0137] 實(shí)例 9
[0138] 使用改善型突變體通過色譜分離技術(shù)從果糖連續(xù)再循環(huán)生產(chǎn)塔格糖的工藝的設(shè) 計(jì)
[0139] 使用實(shí)例5中獲得的經(jīng)純化的酶的塔格糖的連續(xù)再循環(huán)生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)如下。
[0140] 連續(xù)再循環(huán)生產(chǎn)工藝簡單地展示于圖2、圖3、圖4以及圖5中。在純化步驟中，可 以按需要任選地進(jìn)行用于提高產(chǎn)品質(zhì)量的工藝，如脫色和脫鹽。
[0141] 連續(xù)再循環(huán)生產(chǎn)工藝包含使含有果糖作為主要組分的溶液通過己糖醛酸酯 C4-差向異構(gòu)酶（hexuronate C4_epimerase)反應(yīng)器以產(chǎn)生塔格糖；對(duì)由果糖和塔格糖的 混合糖構(gòu)成的差向異構(gòu)產(chǎn)物進(jìn)行色譜分離；取決于經(jīng)純化的差向異構(gòu)化產(chǎn)物中的塔格糖濃 度而任選地進(jìn)行濃縮步驟；濃縮含有塔格糖作為主要組分（90%或大于90% )的色譜分離 溶液；以及進(jìn)行結(jié)晶以產(chǎn)生塔格糖（必要時(shí)）。將含有果糖作為主要組分的剩余色譜液體 再循環(huán)到差向異構(gòu)反應(yīng)器之前的步驟和/或?qū)⑺裉堑慕Y(jié)晶中獲得的非結(jié)晶進(jìn)料再循環(huán) 到差向異構(gòu)之后的步驟。
[0142]


【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種塔格糖的生產(chǎn)方法，包括： a) 使用己糖醛酸酯C4-差向異構(gòu)酶（hexuronateC4_epimerase)進(jìn)行果糖的差向異構(gòu) 以獲得包括塔格糖的差向異構(gòu)化產(chǎn)物； b) 純化所述差向異構(gòu)化產(chǎn)物；以及 c) 結(jié)晶經(jīng)純化的所述差向異構(gòu)化產(chǎn)物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中所述己糖醛酸酯C4-差向異 構(gòu)酶是來源于海棲熱袍菌（Thermotogamaritima)、新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana)、溫泉棲熱袍菌（Thermotogathermarum)或其突變體的酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中所述己糖醛酸酯C4-差向異構(gòu)酶是 由菌株大腸桿菌（Escherichia,coli)、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterumglutamicum)、米 曲霉（Aspergillusoryzae)或枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)產(chǎn)生。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中所述己糖醛酸酯C4-差向異構(gòu)酶的 產(chǎn)生菌株是大腸桿菌BL21 (DE3)pET21a-TM(保藏編號(hào)：KCCM11542P)、大腸桿菌BL21 (DE3) pET21a-TN(保藏編號(hào)：KCCM11543P)或大腸桿菌BL21(DE3)pET28a-TN(m)(保藏編號(hào)： KCCM11544P)〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中所述差向異構(gòu)步驟包括使所述果糖 和所述己糖醛酸酯C4-差向異構(gòu)酶在范圍介于60°C到90°C的溫度和pH5到8下反應(yīng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中所述差向異構(gòu)步驟是在金屬鹽存在 下進(jìn)行。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中所述金屬鹽包括NiS04、NiC12、CoCl2、MnCl2以及ZnS04*的至少一個(gè)。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中所述差向異構(gòu)化產(chǎn)物包括0. 05重 量％或大于0. 05重量％的量的所述塔格糖。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中所述果糖是通過蔗糖水解或葡萄糖 異構(gòu)化而產(chǎn)生。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中所述純化步驟是通過色譜法、分級(jí) 結(jié)晶以及離子純化中的至少一個(gè)進(jìn)行。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中脫色、脫鹽或脫色和脫鹽是在所 述純化步驟之前或之后進(jìn)行。12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中經(jīng)純化的所述差向異構(gòu)化產(chǎn)物是 在所述結(jié)晶步驟之前濃縮。13. 根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一權(quán)利要求所述的塔格糖的生產(chǎn)方法，其中在步驟b)之 后，使未反應(yīng)的所述果糖再循環(huán)到步驟a)，或在步驟c)之后，使與晶體分離的進(jìn)料再循環(huán) 到步驟b)，或兩個(gè)步驟都進(jìn)行。14. 一種大腸桿菌BL21 (DE3)pET21a-TM(保藏編號(hào)：KCCM11542P)。15. -種大腸桿菌BL21 (DE3)pET21a-TN(保藏編號(hào)：KCCM11543P)。16. -種大腸桿菌BL21 (DE3)pET28a-TN(m)(保藏編號(hào)：KCCM11544P)。17. -種己糖醛酸酯C4-差向異構(gòu)酶突變體，由序列編號(hào)第4號(hào)表示。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種塔格糖的生產(chǎn)方法。KCCM11542P20140523
【IPC分類】C12P19/24, C12P19/02
【公開號(hào)】CN105431541
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480031914
【發(fā)明人】梁成才, 金良姬, 金成俌, 樸承源, 樸逸香, 金敏會(huì), 李英美
【申請(qǐng)人】Cj第一制糖株式會(huì)社
【公開日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2014年6月3日
【公告號(hào)】CA2912540A1, EP3006568A1, US20160138053, WO2014196811A1