用于處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的方法和裝置的制造方法
【專利說(shuō)明】
【背景技術(shù)】
[0001]本發(fā)明涉及用于處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的方法和用于處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的裝置。本發(fā)明尤其涉及例如用于所謂的芯片實(shí)驗(yàn)室或口袋實(shí)驗(yàn)室(Lab-On-A-Chip)的微流體體系Ο
[0002]在分子診斷中，經(jīng)常需要檢測(cè)樣品中的病原體DNA或RNA。將由病原體，例如病毒或微生物，例如細(xì)菌或真菌獲得的DNA或RNA稱為病原體DNA或RNA。將樣品尤其理解為是指血液樣品，但原則上也可以是指其它液體或液化的患者樣品，例如，尿、糞便、痰、腦脊液、灌洗液(Lavage )、沖洗過(guò)的抹片或液化的組織樣品，特別是當(dāng)它們包含血液或血液痕跡時(shí)。與此相關(guān)的病征例如是敗血癥。在疑似敗血癥的情況中，例如令人感興趣的是，由血液檢測(cè)病原體以及任選測(cè)定對(duì)某些抗生素的耐受性。由于病原體和白血球之間的濃度比，例如10-1000/ml對(duì)106-107/ml，在這種情況中，在樣品中有很強(qiáng)的人DNA背景。商購(gòu)可得的例如由血液中選擇性提純病原體的方法使用例如化學(xué)試劑，以首先實(shí)現(xiàn)選擇性裂解人細(xì)胞。隨后，酶促消化人核酸。然后例如通過(guò)離心分離或潷析上清液分離病原體。這種方法例如公開(kāi)在 DE102005009479A1 中。
[0003]US 2010/0285578 A1公開(kāi)了由生物樣品制備核酸的裝置和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]在此背景下，根據(jù)獨(dú)立權(quán)利要求提供用于處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的改進(jìn)的方法和用于處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的改進(jìn)的裝置。由各自的從屬權(quán)利要求和下文中的描述得到有利的實(shí)施方案。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式可以實(shí)現(xiàn)尤其用于由也包含非病原體核酸的樣品例如由血液細(xì)胞選擇性制備病原體核酸的生物樣品的處理。本發(fā)明的實(shí)施方式在這種情況下包括例如用于熱預(yù)處理樣品的方案和/或借助薄膜、微通道結(jié)構(gòu)等用于處理樣品的方案。因此，將選擇性裂解伴隨細(xì)胞的熱預(yù)處理與酶促消化以及借助過(guò)濾的分離組合的目的尤其在于，由也包含伴隨細(xì)胞的樣品獲得提純的靶細(xì)胞-核酸。由此例如可想到的是由要檢測(cè)病原體的存在的血液樣品分離例如具有人DNA的白細(xì)胞。
[0006]本發(fā)明的實(shí)施方式尤其可有利地用于在分子診斷中使用的體系或?qū)嶒?yàn)室例行程序中，或者可用于分子診斷中的微流體芯片實(shí)驗(yàn)室體系。
[0007]本發(fā)明的實(shí)施方式可以有利地將含于樣品中的靶細(xì)胞-核酸，例如病原體DNA，從伴隨細(xì)胞-核酸，例如人DNA的背景中可靠地分離出來(lái)。由此避免伴隨細(xì)胞核酸干擾隨后的擴(kuò)增-和檢測(cè)步驟，并因此改善了檢測(cè)和/或診斷的敏感性。在熱預(yù)處理樣品時(shí)可通過(guò)尤其是酶促消化可靠地避免例如在溫度過(guò)高和/或預(yù)處理持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)的樣品膠凝。在此，樣品的膠凝也可以考慮與膠凝相關(guān)的臨界溫度和持續(xù)時(shí)間取決于樣品的性質(zhì)例如紅細(xì)胞比容來(lái)避免。通過(guò)例如酶促消化可以避免樣品堵塞過(guò)濾器。由此甚至可以處理大的樣品量。在此情況下，過(guò)濾能夠由相對(duì)大的血液體積，例如1-10毫升，積聚僅少量的病原體，例如10-1000個(gè)。由此，可以提高靶細(xì)胞-核酸的有效濃度并使隨后的擴(kuò)增和檢測(cè)變得容易。本發(fā)明的實(shí)施方式特別好地適用于自動(dòng)化，特別是在微流體體系中。在這種情況下可容易地施行并且減少污染的風(fēng)險(xiǎn)。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，可以由樣品可靠地分離和濃縮靶細(xì)胞-核酸。由此可改進(jìn)隨后的擴(kuò)增-和/或檢測(cè)步驟的效率。相對(duì)于選擇性化學(xué)裂解伴隨細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明的分離伴隨細(xì)胞提供了可使所需試劑和加工步驟的數(shù)量最小化的優(yōu)點(diǎn)。由此也可縮短樣品處理所需時(shí)間。此外，在提純靶細(xì)胞-核酸方面的優(yōu)點(diǎn)在于，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式可以以簡(jiǎn)單的方式整合在微流體體系，例如用于分子診斷的口袋實(shí)驗(yàn)室(L0C)中。也可提高可實(shí)現(xiàn)的靶細(xì)胞-核酸與伴隨細(xì)胞-核酸的分離效果并可使所需過(guò)濾器或膜的數(shù)量最小。過(guò)濾尤其可以基于典型的細(xì)胞大小的不同，因此是普遍適用的。因此，不需要如同例如在基于抗體的方法的情況中那樣針對(duì)特定的靶細(xì)胞進(jìn)行調(diào)整。
[0009]處理包含靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的生物材料樣品以提取靶細(xì)胞的核酸的方法具有下列步驟:
通過(guò)從樣品中分離靶細(xì)胞或伴隨細(xì)胞來(lái)積聚樣品的靶細(xì)胞；
通過(guò)化學(xué)和/或物理裂解來(lái)分解靶細(xì)胞，以制備含有靶細(xì)胞-核酸的靶細(xì)胞裂解液；和由靶細(xì)胞-裂解液提純核酸，以提取靶細(xì)胞的核酸。
[0010]所述靶細(xì)胞可包括具有DNA和/或RNA作為核酸的病原體細(xì)胞或病原體，例如病毒或微生物，例如細(xì)菌或真菌。為簡(jiǎn)便起見(jiàn)，在下文中經(jīng)常稱為核酸，在此用其指稱DNA和/或RNA。所述伴隨細(xì)胞可包括人細(xì)胞，例如血液細(xì)胞等。樣品尤其可以理解為是指血液樣品，或者也可理解為是指另外的液體的或液化的患者樣品，例如尿、糞便、痰、腦脊液、灌洗液、沖洗過(guò)的抹片或液化的組織樣品，尤其是在其包含血液或痕量血液時(shí)。在提純步驟中可提純含于靶細(xì)胞-裂解液中的核酸并供入隨后的分析中，通過(guò)其可驗(yàn)證特定病原體或基因，例如抗性基因的存在。所述隨后的分析例如可通過(guò)測(cè)序、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，實(shí)時(shí)PCR和/或在微陣列上檢測(cè)或雜交進(jìn)行。
[0011]由樣品提純靶細(xì)胞-核酸可在分解或裂解靶細(xì)胞之后通過(guò)隨后將靶細(xì)胞-核酸吸附在固相例如二氧化硅(Silika)過(guò)濾器或微?；蛩^的微珠上來(lái)進(jìn)行。除了用于裂解的化學(xué)和酶促方法外，還存在機(jī)械方法，例如借助超聲波或微球或微珠。提純的目的是給隨后的擴(kuò)增和/或檢測(cè)提供濃縮形式的靶細(xì)胞-核酸。在分離靶細(xì)胞-核酸與細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)時(shí)也可以有利地使用本發(fā)明的實(shí)施方式。但是，尤其是人血樣品會(huì)額外包含大量的帶有人DNA的伴隨細(xì)胞。分離靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞的一種可能性可能在于，首先選擇性分離或裂解含于樣品中的伴隨細(xì)胞，例如血細(xì)胞并與靶細(xì)胞分離。然后，可將靶細(xì)胞裂解并可提純靶細(xì)胞-核酸。本發(fā)明的實(shí)施方式也可以將靶細(xì)胞-核酸與樣品中存在的伴隨細(xì)胞-核酸背景分離。否則，伴隨細(xì)胞-核酸將干擾隨后的靶細(xì)胞-核酸的擴(kuò)增和分析，并且可能會(huì)使檢測(cè)靶細(xì)胞的存在變得困難至不可能。因此，可防止伴隨細(xì)胞-核酸在隨后的擴(kuò)增和分析中導(dǎo)致形成不希望的副產(chǎn)物并降低靈敏度。
[0012]在相應(yīng)的方法中，積聚步驟可具有將樣品調(diào)溫至裂解溫度以分解和預(yù)先破壞伴隨細(xì)胞的子步驟和借助過(guò)濾從樣品中分離靶細(xì)胞的子步驟。
[0013]根據(jù)一種實(shí)施方式，該積聚步驟可具有將樣品溫度調(diào)節(jié)到用于分解和預(yù)先破壞伴隨細(xì)胞的裂解溫度的子步驟，通過(guò)化學(xué)或酶促裂解來(lái)裂解在調(diào)溫子步驟中被預(yù)先破壞的伴隨細(xì)胞并通過(guò)酶消化由伴隨細(xì)胞釋放的核酸的子步驟和借助過(guò)濾由樣品中分離靶細(xì)胞的子步驟。在此，可適當(dāng)選擇裂解溫度，使含于樣品中的伴隨細(xì)胞被破壞或預(yù)先破壞，由此完整保留含于樣品中的靶細(xì)胞。在分離子步驟中可借助積聚過(guò)濾器截留靶細(xì)胞。這樣的實(shí)施方式提供了能實(shí)現(xiàn)特別有效而可靠地積聚靶細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。在此，由于不同的細(xì)胞壁狀況可有針對(duì)性地使用熱處理。由于裂解可防止過(guò)濾時(shí)的堵塞。
[0014]在此，化學(xué)或酶促裂解和酶促消化子步驟可在調(diào)溫子步驟之前、之中或之后進(jìn)行。由此，可在裂解子步驟中降低樣品的粘度。在這種情況中，尤其可在裂解和消化子步驟使用耐溫的酶，例如核酸酶、蛋白酶或溶菌酶。這樣的實(shí)施方式提供了這樣的優(yōu)點(diǎn)，即由此在熱預(yù)處理期間已經(jīng)可以可靠地避免樣品膠凝。
[0015]或者，在積聚步驟中可以借助至少一次過(guò)濾分離樣品中的伴隨細(xì)胞。在這種情況下，可借助分離裝置截留伴隨細(xì)胞，該分離裝置可具有過(guò)濾器、薄膜、微結(jié)構(gòu)等。在此，所述分離基于靶細(xì)胞和伴隨細(xì)胞大小不同進(jìn)行，即只要伴隨細(xì)胞比靶細(xì)胞大，其就會(huì)被截留。這樣的實(shí)施方式提供了這樣的優(yōu)點(diǎn)，即在該方法的早期可從樣品中除去伴隨細(xì)胞。
[0016]在此，可在積聚步驟中沖洗該樣品通過(guò)多個(gè)串聯(lián)的分離裝置以分離伴隨細(xì)胞。這樣的實(shí)施方式提供了這樣的優(yōu)點(diǎn)，即還可通過(guò)多次過(guò)濾提高分離效率。由此可進(jìn)一步減少存在于濾液中的伴隨細(xì)胞的數(shù)量并因此進(jìn)一步減少不希望的核酸的量。
[0017]在積聚步驟中，也可通過(guò)沖洗樣品多次通過(guò)一個(gè)分離裝置來(lái)分離靶細(xì)胞。由此，靶細(xì)胞由于其尺寸被截留在過(guò)濾器上。靶細(xì)胞尤其可借此與在裂解子步驟中被裂解或預(yù)先破壞的伴隨細(xì)胞分離。在此，可在沖洗伴隨細(xì)胞的過(guò)程之間清潔分離裝置。該清潔可通過(guò)將水或緩沖液以過(guò)濾方向的反方向沖洗通過(guò)分離裝置來(lái)進(jìn)行。這樣的實(shí)施方式提供了這樣的優(yōu)點(diǎn)，即簡(jiǎn)化構(gòu)造并且僅需要一個(gè)分離裝置。通過(guò)清潔和洗滌分離裝置，由此可從該分離裝置中除去伴隨細(xì)胞，可降低該分離裝置的流動(dòng)阻力，因此隨后的過(guò)濾可更容易、更快速地進(jìn)行，即在更低的壓力下以更快的流速進(jìn)行。此