生產和加工成本生產最終產物。為 了有效生產晶體糖（高純度、高產率），確保進料（Feed)中含有的目標材料（塔格糖）的純 度為90 %或大于90 %、更優(yōu)選95 %是極其重要的。
[0062] 色譜法的操作條件可以根據進料（Feed)含量、分離樹脂的種類、分離液體中目標 材料（塔格糖）的所需產率或純度而產生各種結果。因此，通過將果糖轉化成塔格糖的酶 促轉化過程所獲得的反應溶液的進料含量，即果糖轉化成塔格糖的轉化率（％)，影響色譜 法的產率。當分離液體中塔格糖的純度固定為95%時，這是結晶過程中優(yōu)選的，觀測取決于 進料中果糖和塔格糖的進料（Feed)含量（％)的色譜分離的產率（％)變化。
[0063] 為了使糖色譜分離的效率達到最大，通過改變色譜分離中所用樹脂的尺寸、經修 飾金屬離子殘基的種類（例如K、Na、Ca、Mg等）而獲得部分改善的結果。然而，在本發(fā)明 中，考慮到果糖和塔格糖的一般分離特征，使用具有經修飾Ca殘基的分離樹脂。表1示出 評估條件。
[0067] 在上述條件下，取決于果糖和塔格糖的進料含量（％)的SMB色譜分離測試結果在 下表中示出。當分離液體中塔格糖的純度固定為95%時，這是結晶過程中優(yōu)選的，觀測取決 于果糖和塔格糖的進料含量的塔格糖和果糖的回收產率（％ )。結果在表2中示出。
[0068] 表 2
[0069] [表 2]
[0070] 取決于果糖和塔格糖的進料含量的色譜分離特征的分析結果
[0072] 參照表2和圖11，可以看出與果糖相比，塔格糖的回收產率（％ )對酶轉化率（％ ) 尤其敏感。為了以90 %或大于90 %的回收產率和95 %的純度生產塔格糖，應確定酶效價和 加工條件，以便可以獲得15%的酶轉化率（％)。同樣，為了以85%或大于85%的回收產率 和95%的純度生產塔格糖，應確保10%或大于10%的酶轉化率（％)。因此，可以證實酶轉 化率（％)在根據本發(fā)明的生產工藝的效率方面是極其重要的因素。
[0073] 實例 2
[0074] 己酮糖C4-差向異構酶的制備
[0075] 使用海棲熱袍菌（菌株ATCC 43589/MSB8/DSM 3109/JCM 10099)的基因組 DNA(序列編號第1號）作為模板、耐熱性微生物并且添加正向引物^ -GGGCATATGATGGTC TTGAAAGTGTTCAAAG-3，）和反向引物（5，-AAACTCGAGCCCCTCCAGCAGATCCACGTG-3，）進行 PCR〇
[0076] 另外，通過使用新阿波羅棲熱袍菌（DSM 4359)的基因組DNA(序列編號第2號）作 為模板、耐熱性微生物并且添加正向引物（5' -GGGCATATGATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG-3') 和反向引物（5' -AAACTCGAGTCACCCCTTCAACAGGTCTACGTG-3')進行 PCR。
[0077] PCR的條件在表3和表4中示出。將通過PCR擴增的基因插入pET_21a載體中，接 著轉型到大腸桿菌DH5a菌株中。從經轉型的菌株分離質粒，將其測序以鑒別插入基因的 堿基序列。將質粒轉型到蛋白質表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)中，用于生產己酮糖C4-差 向異構酶。為了生產己酮糖C4-差向異構酶，將大腸桿菌BL21 (DE3)pET21a-TM (包含源于 海棲熱袍菌的酶表達基因）和大腸桿菌BL21 (DE3)pET21a-TN(包含源于新阿波羅棲熱袍 菌的酶表達基因）培養(yǎng)在包含l〇〇mg/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基中約2小時，其中培養(yǎng)溫度 是37°C并且攪拌速度是180rpm。在培養(yǎng)后，測量微生物在600nm下的光密度。如果光密 度值（optical density)落在0. 4到0. 8內，那么添加0. 25mM異丙基β-D-1-硫代P比喃 半乳糖苷（Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，接著在相同條件下培養(yǎng)過夜 (overnight)以誘導蛋白質表達。

[0084] 實例 3
[0085] 己酮糖C4-差向異構酶的純化
[0086] 為了測量微生物中表達的己酮糖C4-差向異構酶的活性，通過以下方法進行蛋白 質純化。將完成蛋白質表達的培養(yǎng)物溶液在8, OOOrpm下離心10分鐘以收集微生物體，將 微生物體再懸浮于包含10mM咪唑（imidazole)和300mM NaCl的50mM NaH2P04(pH 8. 0)緩 沖液中。將懸浮的微生物體通過超聲發(fā)生器（sonicator)破碎并且在13, OOOrpm下離心10 分鐘以采集上清液。使采集的上清液流動通過裝有Ni-NTA樹脂作為填充劑的色譜柱。至 此，使包含20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2P04(pH8. 0)緩沖液以色譜柱中填充劑的10 倍體積的量流動通過，從而去除非特異性附著于填充劑的蛋白質。最后，使包含250mM咪唑 和300mM NaCl的50mM NaH2P04(pH 8. 0)緩沖液流動通過以洗脫并且純化己酮糖C4-差向 異構酶。為了去除經純化的酶中的咪唑，使50mM NaH2P04(pH 8.0)緩沖液流動數次，使得咪 P坐的濃度為O.OlmM或小于O.OlmM。經純化的酶是通過布拉德福分析（Bradford assay)來 定量。
[0087] 實例 4
[0088] 從果糖轉化成塔格糖
[0089] 為了測量實例2和實例3中獲得的酶的活性，將經純化的酶添加到1重量％果糖、 0.0 lmM ZnS04以及50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7. 0)中，接著在60°C的反應溫度下反應3小時。 通過己酮糖C4-差向異構酶轉化的塔格糖的濃度和從果糖轉化成塔格糖的轉化率在表5中 示出。
[0090] 另外，在反應后，通過HPLC定量剩余果糖和作為產物的塔格糖，其中色譜柱是昭 和（Shodex)糖類SP0810,色譜柱溫度是80°C，并且作為移動相的水以0. 5mL/min的速率流 動通過。圖6描繪通過檢測和定量HPLC峰的使用果糖作為底物的酶反應的結果。
[0091] 表 5
[0092] [表 5]
[0093]
[0094] 參照表5和圖6,當通過僅添加酶到磷酸鹽緩沖液而不添加果糖進行轉化（由虛線 表示）時，經鑒別未觀測到果糖和塔格糖的峰。
[0095] 然而，當為了進行差向異構而添加果糖和酶（由實線表示）時，在酶反應開始后30 分鐘之前僅觀測到果糖的峰。隨著時間流逝，在酶反應開始約30分鐘之后觀測到塔格糖的 峰。
[0096] 根據表5和圖6中示出的結果，已證實使用實例2和實例3中制備的酶可以將果 糖轉化成塔格糖。
[0097] 實例 5
[0098] 改善型微生物的構建和選擇
[0099] 使用源于新阿波羅棲熱袍菌的基因作為模板進行隨機突變。具體來說，使用由克 隆科技公司（ClonTech)制造的多樣化隨機誘變試劑盒（Diversify random mutagenesis kit)對新阿波羅棲熱袍菌進行隨機誘變。所得基因通過PCR在以下表6和表7中列出的條 件下擴增。將擴增的基因插入pET-28a載體中以轉型大腸桿菌BL21(DE3)菌株。以與實例 2相同的方式進行剩余步驟。

[0106] 從通過隨機誘變獲得的突變體庫中選出高活性候選突變體并且通過堿基測序鑒 別突變體堿基序列中的突變部分。發(fā)現突變體在氨基酸序列中具有總共5個突變位置 (S125D/V163A/D186N/F263I/D311G)。
[0107] 突變體具有序列編號第3號中呈現的基因組DNA堿基序列并且編碼由突變體產生 的酶的氨基酸序列如序列編號第4號中所闡述。產生己酮糖C4-差向異構酶的突變體是大 腸桿菌BL21 (DE3)pET28a-TN(m)(保藏編號：KCCM11544P)。使用突變體以與實例2和實例 3中相同的方式產生C4-差向異構酶。
[0108] 實例 6
[0109] 使用改善型突變體的果糖轉化成塔格糖的邊緣轉化率的評估
[0110] 使用源于改善型突變體的酶，通過以下方法評估取決于溫度、pH以及金屬鹽的轉 化率。
[0111] (1)取決于反應溫度的酶活性的比較評估
[0112] 為了鑒別取決于反應溫度的酶活性變化，將實例5中獲得的經純化的酶添加到10 重量％果糖、〇. 3mM ZnS04以及50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7. 0)中，并且接著反應3小時。如 圖7中所示，在37°C到96°C的不同反應溫度下測量酶活性。
[0113] 酶活性顯示隨著溫度增加而增加的趨勢。然而，酶活性在90°C或大于90°C的反應 溫度下降低。
[01