N末端截短的糖基轉(zhuǎn)移酶的制作方法
【專利說明】N末端截短的糖基轉(zhuǎn)移酶
[0001] 本公開涉及具有N末端截短缺失的糖基轉(zhuǎn)移酶變體。與此前的發(fā)現(xiàn)相反，某些包 含保守氨基酸基序（"QVWxKDS"，SEQ ID N0:2)的截短部分被發(fā)現(xiàn)與糖基轉(zhuǎn)移酶酶活性并 存，特別是在人唾液酸轉(zhuǎn)移酶（hST6Gal-I)中。因此，公開了哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶變體、編 碼其的核酸、重組產(chǎn)生所述哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶變體的方法和手段及其用途，特別是用于 唾液酸化作為糖蛋白（如免疫球蛋白）的一部分的聚糖部分的末端受體基團(tuán)。
[0002] 背景 轉(zhuǎn)移酶(EC2)催化官能團(tuán)從一個(gè)物質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物質(zhì)。糖基轉(zhuǎn)移酶，一個(gè)酶超家族， 其涉及合成糖蛋白、糖脂及葡糖氨基葡聚糖的碳水化合物部分。特定的糖基轉(zhuǎn)移酶通過將 經(jīng)活化的糖供體的單糖部分依次轉(zhuǎn)移到受體分子而合成低聚糖。因此，"糖基轉(zhuǎn)移酶"催化 糖部分從其核苷酸供體轉(zhuǎn)移到多肽、脂質(zhì)、糖蛋白或糖脂的受體部分。這個(gè)過程也被稱為 "糖基化"。作為例如糖蛋白的結(jié)構(gòu)部分的碳水化合物部分也被稱為"聚糖"。聚糖是所有已 知的翻譯后蛋白質(zhì)修飾中最普遍的。聚糖涉及廣泛而多樣的生物識(shí)別過程，如粘附、免疫應(yīng) 答、神經(jīng)細(xì)胞迀移和軸突延伸。作為糖蛋白的結(jié)構(gòu)部分，聚糖還在蛋白質(zhì)折疊以及維持蛋白 質(zhì)穩(wěn)定性與生物活性中起作用。
[0003] 在糖基轉(zhuǎn)移酶催化中，單糖單元葡萄糖（Glc)、半乳糖（Gal)、N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc)、葡糖醛酸（GlcUA)、半乳糖醛酸（GalUA)和木糖作 為尿苷二磷酸（UDP) - a -D衍生物被活化；阿拉伯糖作為UDP- β -L衍生物被活化；甘露糖 (Man)和巖藻糖分別作為⑶Ρ- a -D和⑶Ρ- β -L衍生物被活化；而唾液酸（=Neu5Ac ;= SA) 作為β -D-Neu5Ac的CMP衍生物被活化。
[0004] 許多不同的糖基轉(zhuǎn)移酶參與了聚糖的合成。糖蛋白的碳水化合物部分的結(jié)構(gòu)多樣 性尤其大并且由復(fù)雜的生物合成途徑所確定。在真核生物中，糖蛋白聚糖部分的生物合成 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（"ER"）腔內(nèi)和高爾基體內(nèi)進(jìn)行。糖蛋白的單個(gè)(支鏈或直鏈的）碳水化合物鏈通 常為N-或0-連接的聚糖。在翻譯后加工的過程中，碳水化合物通常經(jīng)由天冬酰胺("N-連 接的糖基化")或經(jīng)由絲氨酸或蘇氨酸("〇-連接的糖基化")被連接至多肽。聚糖的合成，無 論N-或0-連接的（="N-/0-連接的")，均受到若干不同的膜錨定型糖基轉(zhuǎn)移酶的活性的 影響。糖蛋白可包含一個(gè)或多個(gè)聚糖連接的氨基酸（="糖基化位點(diǎn)")。具體的聚糖結(jié)構(gòu)可 以是直鏈或支鏈的。支化是碳水化合物值得注意的特征，這與DNA、RNA和多肽典型的直鏈 性質(zhì)相反。組合其基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)單元的大的不均一性，單糖、聚糖結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)高多樣性。此外，在 具體的糖蛋白種類的成員中，連接到特定糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)可能變化，因而導(dǎo)致各自 糖蛋白種類的微不均一性，即在種內(nèi)共享多肽部分的相同氨基酸序列。
[0005] 唾液酸轉(zhuǎn)移酶（="ST"）是一種糖基轉(zhuǎn)移酶，其催化唾液酸（=5-N_乙酰神經(jīng)氨酸 =Neu5Ac = NANA)殘基從供體化合物轉(zhuǎn)移到（i)糖脂或神經(jīng)節(jié)苷脂的末端單糖受體基團(tuán)， 或（ii)糖蛋白的N-/0-連接的聚糖的末端單糖受體基團(tuán)。對(duì)于包括人ST種類的哺乳動(dòng) 物唾液酸轉(zhuǎn)移酶而言，存在共同的供體化合物，即胞苷-5' - 一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸（= CMP-Neu5Ac = CMP-ΝΑΝΑ)。唾液酸殘基的轉(zhuǎn)移也被稱為"唾液酸化（sialylating)"和"唾 液酸化作用（sialylation)"。
[0006] 在唾液酸化的糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)中，（一個(gè)或多個(gè)）唾液酸（sialyl)部分通常位 于該低聚糖的末端位置。由于該末端，即暴露的位置，唾液酸可以參與許多不同的生物識(shí)別 現(xiàn)象并作用于各種各樣的生物相互作用中。在糖蛋白中，可存在多于一個(gè)唾液酸化位點(diǎn)，即 能夠充當(dāng)唾液酸轉(zhuǎn)移酶底物并作為適用于唾液酸殘基轉(zhuǎn)移的受體基團(tuán)的位點(diǎn)。原則上，此 類多于一個(gè)位點(diǎn)可以是錨定在糖蛋白的不同糖基化位點(diǎn)上的多個(gè)直鏈聚糖部分的末端。另 外，支鏈聚糖可具有多個(gè)可發(fā)生唾液酸化作用的位點(diǎn)。
[0007] 根據(jù)現(xiàn)有知識(shí)，末端唾液酸殘基可見于（i) α 2 - 3 (α 2, 3)連接至半乳糖基-R， (ii) α2 -6 (α2,6)連接至半乳糖基_R，（iii) α2 -6 (α2,6)連接至Ν-乙?；肴?糖胺_R，（iv) α2 -6 (α2,6)連接至Ν-乙?；咸前?R，以及（ν) α2 -8/9 (α2,8/9) 連接至唾液酸基-R，其中-R代表該受體底物部分的其余部分。因此，通常根據(jù)其各自的 單糖受體底物以及根據(jù)其催化的糖苷鍵的3、6或8/9位置，對(duì)在唾液酸綴合物（="唾液酸 化作用"）的生物合成中有活性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行命名和分類。因此，在本領(lǐng)域已知的文 獻(xiàn)，例如，Patel RY 等人，Glycobiology 16 (2006) 108-116 中，根據(jù)形成糖苷鍵時(shí) Neu5Ac 殘基轉(zhuǎn)移到的受體糖殘基的羥基位置，提及了真核生物唾液酸轉(zhuǎn)移酶如（i) ST3Gal、（ii) ST6Gal、（iii) ST6GalNAc或（v) ST8Sia。還可以更通用的方式提及唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如， ST3、ST6、ST8 ;因此，"ST6"具體涵蓋催化α 2, 6唾液酸化作用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
[0008] 二糖部分β -D-半乳糖基-1，4-Ν-乙?；?β -D-葡糖胺（=Gal β 1，4GlcNAc)是 糖蛋白的N-連接的聚糖天線（antennae)的常見末端殘基，但也可以存在于0-連接的聚糖 中以及糖脂中。酶β -半乳糖苷-α 2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（="ST6Gal"）能夠催化聚糖的或 聚糖支鏈（="天線")的末端Gal β 1，4GlcNAc的α 2, 6-唾液酸化作用。對(duì)于其一般方面而 言，在文件 DallOlio F. Glycoconjugate Journal 17 (2000) 669-676 中提及。在人和其 它哺乳動(dòng)物中，存在若干種類的ST6Gal。本公開具體涉及人β -半乳糖苷-α -2, 6-唾液酸 轉(zhuǎn)移酶I (= hST6Gal-I ;EC 2. 4. 99. 1，根據(jù)IUBMB酶命名法)，但不限于此。
[0009] 唾液酸轉(zhuǎn)移酶的ST6組包括2個(gè)亞組：ST6Gal和ST6GalNAc。ST6Gal酶的活 性催化Neu5Ac殘基至游離半乳糖殘基的C6羥基的轉(zhuǎn)移，該游離半乳糖殘基是聚糖或 聚糖天線中的末端Gal β 1，4GlcNAc的一部分，從而在該聚糖中形成被α 2 - 6連接至 Gal β 1，4GlcNAc部分的半乳糖殘基的末端唾液酸殘基。所得的聚糖中新形成的末端部分是 Neu5Ac a 2, 6Galβ 1, 4GlcNAc〇
[0010] 人β -半乳糖苷-α -2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I (hST6Gal_I)的野生型多肽，于提交本 文件時(shí)作為"UniProtKB/Swiss-Prot: P15907. 1 "在可公共訪問的NCBI數(shù)據(jù)庫（http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/115445)中被公開。包括編碼序列在內(nèi)的另外的信息 作為在數(shù)據(jù)庫條目"Gene ID:6480"下編譯的超鏈接（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ gene/6480)提供。
[0011] 哺乳動(dòng)物的唾液酸轉(zhuǎn)移酶與其它哺乳動(dòng)物的高爾基體內(nèi)固有的糖基轉(zhuǎn)移酶(所謂 "II型結(jié)構(gòu)"）共享（i)短的細(xì)胞質(zhì)N-末端尾區(qū)、（ii)跨膜片斷隨后為（iii)長度可變的莖 區(qū)以及（iv)面向高爾基體腔內(nèi)的C末端催化域（Donadio S.等人，于Biochimie 85 (2003) 311-321)。哺乳動(dòng)物的唾液酸轉(zhuǎn)移酶看似在其催化域展示顯著的序列同源性。然而，即便 在一般而言大量的真核生物糖基轉(zhuǎn)移酶（即包括唾液酸轉(zhuǎn)移酶和其它糖基轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)的一 組酶）中，也在氨基酸序列水平上觀察到了保守基序，即SEQ ID N0:2的QVWxKDS共有基 序。如SEQ ID N0:1 (野生型序列）所示的人ST6Gal-I ("hST6Gal-I"）也包含此基序，顯 著地在hST6Gal-I野生型多肽的氨基酸序列的94-100位置，所述hST6Gal-I野生型多肽例 如于提交本文件時(shí)作為"1]11丨?1〇丨1?/5￥丨88^^〇丨:？15907.1"在可公共訪問的從^1數(shù)據(jù)庫 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/115445)中被公開。
[0012] 根據(jù)Donadio S.等人的出版物（同上)，QVWxKDS共有基序的氨基酸序列對(duì)于 hST6Gal-I的催化域獲得生物活性構(gòu)象而言是必不可少的。Donadio S.等人在CH0細(xì)胞中 表達(dá)了 hST6Gal-I的若干種N末端截短的變體并且發(fā)現(xiàn)包含前35、48、60和89個(gè)氨基酸的 N末端缺失產(chǎn)生盡管如此但仍在將唾液酸轉(zhuǎn)移到外源性受體中有活性的突變酶。但是發(fā)現(xiàn) 具有前100個(gè)氨基酸的N末端缺失的hST6Gal-I突變體在此方面是沒有活性的。值得注意 的是，hST6Gal_I的這種" Δ 1〇〇"缺失突變體缺少高度保守的QVWxKDS基序。因此，該基序 的存在被Donadio S.等人（同上）總結(jié)為對(duì)促進(jìn)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的活性至關(guān)重要。
[0013] 令人驚奇地并與Donadio S.等人（同上)的發(fā)現(xiàn)和教導(dǎo)相抵觸，本公開的作者發(fā)現(xiàn) 在糖基轉(zhuǎn)移酶多肽的氨基酸序列中缺失包含整個(gè)保守QVWxKDS基序的序列部分實(shí)際上可 以與糖基轉(zhuǎn)移酶活性，特別是唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性并存。
[0014] 概述 在第一個(gè)方面，報(bào)道了哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶變體，其中該變體的多肽包含野生型哺乳 動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶的N末端截短的氨基酸序列，該截短部分包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列 基序，并且其中該變體展現(xiàn)出糖基轉(zhuǎn)移酶活性。在第二個(gè)方面，報(bào)道了編碼如本文中所公開 的哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶變體的多肽的核苷酸序列。在第三個(gè)方面，報(bào)道了包含靶基因的表 達(dá)載體，所述靶基因與在用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主生物中促進(jìn)該靶基因表達(dá)的序列可操 作地連接，其中該靶基因包含如本文中所公開的核苷酸序列。在第四個(gè)方面，報(bào)道了經(jīng)轉(zhuǎn)化 的宿主生物，其中該宿主生物用如本文中所公開的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。在第五個(gè)方面，報(bào)道了重 組產(chǎn)生哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶變體的方法，該方法包括在經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主生物中表達(dá)編碼如本 文中所公開的哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶變體的核苷酸序列的步驟，其中形成多肽，從而產(chǎn)生該 哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶變體。在第六個(gè)方面，報(bào)道了通過如本文中所公開的方法而獲得的糖 基轉(zhuǎn)移酶。在第七個(gè)方面，報(bào)道了如本文中所公開的哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶變體在將5-N-乙 酰神經(jīng)氨酸殘基從供體化合物胞苷-5' - 一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸或從其功能等同物轉(zhuǎn)移 至受體的用途，該受體為單克隆抗體的聚糖部分中的末端β -D-半乳糖基-1，4-N-乙酰 基-β -D-匍糖胺。
【附圖說明】
[0015] 圖1 :野生型hST6Gal_I多肽及其Ν末端部分(于Δ27、Δ48、Δ62、Δ89和Δ108 變體中截短）的氨基酸序列的圖示。截短部分中缺失的位置用"X"表示。
[0016] 圖2 :在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)并從其分泌的hST6Gal_I變體的電泳和染色后的 SDS凝膠。泳道1和9含有大小標(biāo)準(zhǔn)品，在左側(cè)表明了根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)品的以kDa表示的分子量。 泳道 2: Δ62;泳道 3: Δ48;泳道 4: Δ27("克隆 103"）；泳道 5: Δ27("克隆 154"）； 泳道 6 : Δ 62 ("克隆 356"）；泳道 7 : Δ 48 ("克隆 9"）；泳道 8 : Δ 89 ("克隆 187")。
[0017] 圖3 :在ΗΕΚ細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)并從其分泌的Δ 108 hST6Gal_I變體的電泳和染色 后的SDS凝膠。泳道1含有大小標(biāo)準(zhǔn)品，在左側(cè)表明了根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)品的以kDa表示的分子 量。泳道2 : Δ 108 hST6Gal-I截短變體(在凝膠上，上樣5 μ8)。
[0018] 詳述 除非上下文另行明確指出，否則術(shù)語"一個(gè)/種"和"所述"通常包括多個(gè)指代物。如 本文中所用，"多個(gè)"被理解為多于一個(gè)。例如，"多個(gè)"是指至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更 多個(gè)。除非特別說明或在上下文中顯而易見，如本文中所用，術(shù)語"或"被理解為包括性的。
[0019] 除非特別說明或在上下文中顯而易見，如本文中所用，術(shù)語"