瘧疾疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種包含多肽和至少一種瘧疾抗原的顆粒，和包含所述顆粒的組合物 或疫苗，其在醫(yī)學(xué)中、特別是在預(yù)防或治療瘧疾中的用途。
[0002] 背景 瘧疾是世界上最流行的嚴(yán)重傳染病之一，每年有大約2.5億病例并且1百萬人死亡 (WH0, 2009)。死亡主要發(fā)生于5歲以下的兒童和孕婦中。每45秒鐘，就有一個非洲兒童死于 瘧疾。該疾病通過感染的蚊子在人與人之間傳播，因此過去的根除努力涉及大規(guī)模的殺蟲 劑運動。例如，這些在美國東南部是成功的，但在大多數(shù)不發(fā)達的熱帶國家卻是失敗的。目 前的努力包括蚊帳的分發(fā)，特別是用殺蟲劑浸泡的蚊帳，以防止夜間蚊子的叮咬。然而，對 殺蟲劑和用于預(yù)防和治療二者的抗瘧藥的抗性正快速地增加。因此，為保護數(shù)百萬人群避 免疾病，對于皰疾疫苗的需求是急需的（http : //www. global vaccines . org/content/ malaria+vaccine+program/19614)〇
[0003] 由惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)引起的皰疾仍然是一個主要的公共健康 威脅，尤其是在非洲的兒童和孕婦中。有效的瘧疾疫苗是減少這種疾病負(fù)擔(dān)的一種重要工 具并可有助于消除世界某些地區(qū)的瘧疾。目前瘧疾疫苗候選物是針對寄生蟲生命周期的人 類和蚊子階段，但到目前為止，僅研究了相對較少的蛋白質(zhì)用于潛在的疫苗開發(fā)。
[0004] 最先進的疫苗候選物，RTS，S，在II期臨床試驗中，針對瘧疾提供部分保護并且目 前正在在非洲的一個III期試驗中進行評價(The Journal of Clinical Investigation 120(12) 4168-4178， 2010)。
[0005] CSP是子孢子上的主要的表面抗原。CSP包含結(jié)合肝素硫酸蛋白聚糖(RI)的N-末端 區(qū)、含有4氨基酸(NPNA)重復(fù)單位的中心區(qū)和GPI-錨定的含血小板反應(yīng)蛋白樣結(jié)構(gòu)域(RII) 的C-末端區(qū)。RTS，S疫苗中包括的CSP區(qū)包括最后16個NPNA重復(fù)單位和整個側(cè)翼的C-末端。 HBsAg顆粒用作用于RTS，S的基質(zhì)載體，其25%融合于CSP區(qū)段(The Journal of Clinical Investigation 120(12) 4168-4178， 2010)。
[0006] 在RTS,S的一系列II期臨床試驗中，用RTS,S免疫的瘧疾-首次接觸成人的30%-50% 被保護以對抗由感染了同源惡性皰原蟲(P. falciparum)克隆的蚊子的攻擊。在岡比亞和 肯尼亞的II期現(xiàn)場試驗中，RTS，S在約35%的成人中賦予對抗瘧疾感染的短暫保護，雖然來 自肯尼亞的試驗結(jié)果并未達到統(tǒng)計上的意義。在莫桑比克、坦桑尼亞和肯尼亞進行的II期 試驗中，用RTS，S免疫的兒童和嬰兒的約30%-50%被保護而避免了臨床瘧疾，然而，保護一般 是短暫有效的（The Journal of Clinical Investigation 120(12) 4168-4178，2010)。 得自關(guān)鍵的、大規(guī)模的ΠΙ期試驗的結(jié)果（于2012年11月9日，在New England Journal of Medicine (NEJM)中在線公布)顯示，RTS,S瘧疾疫苗候選物可幫助保護非洲嬰兒對抗瘧疾。 當(dāng)與用對照疫苗的免疫比較時，用RTS，S疫苗接種嬰兒(第一次接種疫苗在6-12周齡)有不 到三分之一的臨床和嚴(yán)重瘧疾發(fā)生并對注射具有類似的反應(yīng)。
[0007] 目前還沒有對抗瘧疾的許可疫苗。強烈需要高度有效的瘧疾疫苗。
[0008] 病毒樣顆粒(VLP)是多蛋白的結(jié)構(gòu)，其模仿真正的天然病毒的組織和構(gòu)象，但缺乏 病毒基因組，可能產(chǎn)生更安全和更廉價的疫苗候選物。少數(shù)幾個預(yù)防性的基于VLP的疫苗目 前已經(jīng)在全球范圍內(nèi)商業(yè)化:GlaxoSmithKline的Engerix ? (乙型肝炎病毒)和Cervarix ? (人乳頭瘤病毒），和Merck and Co·, Inc的Recombivax HB? (乙型肝炎病毒）和 Gardasil ? (人乳頭瘤病毒)是一些例子。其它基于VLP的疫苗候選物正在臨床試驗中或正 進行臨床前評估，例如，流感病毒、細小病毒、諾沃克病毒和各種嵌合VLP。許多其它疫苗候 選物仍局限于小規(guī)模的基礎(chǔ)研究，盡管它們在臨床前試驗中獲得成功。大規(guī)模VLP生產(chǎn)的意 義在過程控制、監(jiān)測和優(yōu)化的文中討論。主要的上游和下游技術(shù)挑戰(zhàn)是確定的并從而進行 討論。伴隨得自臨床試驗的最近結(jié)果和在用于治療或者預(yù)防性接種疫苗的基于嵌合VLP的 技術(shù)的最近發(fā)展，簡要地呈現(xiàn)了成功的基于VLP的疫苗轟動（Expert Rev. Vaccines 9 (10)， 1149-1176， 2010)。
[0009] 在非洲、歐洲和亞洲，基孔肯雅病毒(CHIKV)已經(jīng)感染數(shù)百萬人，因為這種甲病毒 在2004年從肯尼亞再次出現(xiàn)。疾病的嚴(yán)重性和這種流行性病毒的傳播在缺乏疫苗或抗病毒 療法的情況下，提出了一個嚴(yán)重的公共健康威脅。據(jù)報道，用于流行性基孔肯雅病毒的VLP 疫苗保護非-人靈長類動物對抗感染(Nat Med. 2010 March; 16(3): 334-338)。美國專利 公布號2012/0003266公開一種包含一種或多種基孔肯雅病毒結(jié)構(gòu)多肽的病毒樣顆粒 (VLP)，其可被用來配制誘導(dǎo)對感染或其至少一種癥狀的免疫力的基孔肯雅病毒的疫苗或 抗原組合物。W02012/106356公開修飾的甲病毒屬或黃病毒屬病毒樣顆粒(VLP)和提高用于 預(yù)防或治療甲病毒屬和黃病毒屬-介導(dǎo)的疾病的修飾VLP的生產(chǎn)的方法(這些引用的參考文 獻通過引用結(jié)合到本文中）。
[0010] 發(fā)明概述 在第一方面，本發(fā)明提供一種能夠自組裝的顆粒，其包含多肽和至少一種瘧疾抗原，其 中所述多肽包含至少一個第一附著位點和所述至少一種瘧疾抗原包含至少一個第二附著 位點，且其中所述多肽和所述瘧疾抗原通過所述至少一個第一和所述至少一個第二附著位 點被連接。
[0011] 在第二方面，本發(fā)明提供為表達在本發(fā)明的第一方面提供的顆粒而設(shè)計的核酸分 子。
[0012] 在第三方面，本發(fā)明提供包含在本發(fā)明的第一方面中提供的顆粒和/或在本發(fā)明 的第二方面中提供的核酸分子的組合物或疫苗。
[0013] 在第四方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)抗體的方法，其包括使在本發(fā)明的第一方面中 提供的顆粒和/或在本發(fā)明的第二方面中提供的核酸分子與哺乳動物接觸。
[0014]在第五方面，本發(fā)明提供一種免疫調(diào)節(jié)的方法，治療瘧疾的方法，在哺乳動物中誘 導(dǎo)和/或提高對抗瘧疾抗原的免疫反應(yīng)的方法，其包括給予哺乳動物在本發(fā)明的第三方面 中提供的組合物。
[0015]在第六方面，本發(fā)明提供一種對抗引起瘧疾的病原體的被動免疫的方法，其包括 給予給予哺乳動物在本發(fā)明的第四方面中提供的抗體。
[0016]在第七方面，本發(fā)明提供一種在巨噬細胞上呈遞抗原的方法，其包括使在本發(fā)明 的第一方面中提供的顆粒和/或在本發(fā)明的第二方面中提供的核酸分子與哺乳動物接觸。 [0017]在第八方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)在本發(fā)明的第一方面提供的顆粒的方法，其包 括制備為表達所述顆粒而設(shè)計的載體;培養(yǎng)用所述載體轉(zhuǎn)染的細胞以表達所述顆粒;和回 收所述顆粒。
[0018] 發(fā)明簡述 圖 1 顯示pVLP74_15 (VLP_CHI 532 NPNAx6)載體。
[0019] 圖2顯示pVLP78_15 (VLP_CHI 532 NPNAx25)載體。
[0020] 圖3顯示pVLP74_25 (VLP_VEEV 519 NPNAx6)載體。
[0021 ]圖4顯示用瘧疾VLP免疫2周后的各個猴的血清誘導(dǎo)高滴度的抗CSP抗體。
[0022]圖5顯示在圖4中所示數(shù)據(jù)的均值和SD。
[0023] 圖6顯示CHIKV VLP和VEEV VLP的聯(lián)合免疫對誘導(dǎo)抗CSP抗體的影響。在圖中，Adj 表示佐劑。
[0024]圖7顯示給予不與瘧疾抗原融合的VLP對誘導(dǎo)抗CSP抗體的影響。在圖中，4w、6w、 10w和14w分別表不免疫后4周、免疫后6周、免疫后10周和免疫后14周。
[0025]圖8顯示給予與瘧疾抗原融合的VLP對誘導(dǎo)抗CSP抗體的影響。在圖中，4w、6w、10w 和14w分別表不免疫后4周、免疫后6周、免疫后10周和免疫后14周。
[0026]圖9顯示給予與瘧疾抗原融合的VLP與佐劑一起對誘導(dǎo)抗CSP抗體的影響。在圖中， 4w、6w、l〇W和14w分別表示免疫后4周、免疫后6周、免疫后10周和免疫后14周。
[0027] 圖10顯示實驗的程序。
[0028] 圖11顯示18S瘧疾DNA通過PCR的檢測。
[0029] 發(fā)明詳述 (1)包含多肽和至少一種瘧疾抗原的顆粒 在第一方面，本發(fā)明提供一種能夠自組裝的顆粒，其包含多肽和至少一種瘧疾抗原，其 中所述多肽包含至少一個第一附著位點和所述至少一種抗原包含至少一個第二附著位點， 且其中所述多肽和所述瘧疾抗原通過所述至少一個第一和所述至少一個第二附著位點被 連接。
[0030] 如本文所用的，〃能夠自組裝的顆粒〃指由至少一種自發(fā)組裝的組分形成的顆粒。 所述組分可以是多肽或非-肽化合物。在一個實施方案中，〃能夠自組裝的顆?！梢允前?或由至少一種多肽組成的顆粒。所述至少一種多肽由一種或多種肽組成。在一個實施方案 中，所述顆粒具有至少l〇nm，例如，至少20nm，優(yōu)選地至少50nm的直徑。在一個實施方案中， 所述顆粒的分子量是 100 kDa-100，OOOkDa，優(yōu)選400kDa-30，OOOkDa。
[0031] 本發(fā)明所用的多肽可以自發(fā)組裝。所述多肽可以是病毒結(jié)構(gòu)多肽。因此，由本發(fā)明 提供的顆粒可以是病毒樣顆粒。
[0032]病毒結(jié)構(gòu)多肽可以是天然存在的病毒多肽或其修飾的多肽。在一個實施方案中， 修飾的多肽具有與包含衣殼和包膜蛋白的天然存在的病毒結(jié)構(gòu)多肽至少70%、75%、80%、 85%、90%、95%或98%的氨基酸序列同一性。在一個實施方案中，修飾的多肽是其中最多10%的 氨基酸被缺失、取代和/或添加到包含衣殼和包膜蛋白的天然存在的病毒結(jié)構(gòu)多肽的突變 體。
[0033]在一個實施方案中，本發(fā)明所用的病毒結(jié)構(gòu)多肽由衣殼和/或包膜蛋白或其片段 組成或包含衣殼和/或包膜蛋白或其片段。例如，本發(fā)明所用的病毒結(jié)構(gòu)多肽由衣殼和E2和 E1組成或包含衣殼和E2和E1。
[0034]抗原可以插入E2中。在一個實施方案中，本發(fā)明的第一方面提供的顆?？赏ㄟ^組 裝240個衣殼、240個El蛋白和240個E2蛋白（其中瘧疾抗原被插入每個E2蛋白中）而形成。 [0035]本發(fā)明所用的病毒結(jié)構(gòu)多肽可源自甲病毒屬或黃病毒屬。因此，由本發(fā)明提供的 顆?？梢允窃醋约撞《緦倩螯S病毒屬的病毒樣顆粒。
[0036]甲病毒屬和黃病毒屬的實例包括，但不限于，奧拉病毒、巴班肯病毒、Barmah森林 病毒(BFV)、貝巴魯病毒、犰狳病毒、基孔肯雅病毒(CHIKV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、埃拉特 病毒、沼澤地病毒、摩根堡病毒、蓋塔病毒、尚地J病毒、Kyzylagach病毒、馬亞羅病毒、Me Tr i病毒、米德爾堡病毒、莫斯達斯佩德拉斯病毒、穆坎布病毒、恩杜穆病毒、0 ' nyong-nyong 病毒、皮舒納病毒、里奧內(nèi)格羅病毒、羅斯河病毒(RRV)、鮭魚胰腺病病毒、塞姆利基森林病 毒、辛德畢斯病毒、南方象海豹病毒、托納特病毒、特羅卡拉病毒、烏納病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦 炎病毒(VEEV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、沃達羅河病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎 病毒和黃熱病病毒。
[0037] 瘧疾是人或其它動物(如小鼠）罹患的疾病。瘧疾的實例包括，但不限于，由瘧原蟲 (P.)種類包含惡