Cd19特異性嵌合抗原受體及其用圖
【專利說明】CD19特異性嵌合抗原受體及其用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明關(guān)于嵌合抗原受體（CAR)。CAR能夠利用配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域性質(zhì)再導(dǎo)免疫細 胞對選定標靶的特異性及反應(yīng)性。特別地，本發(fā)明關(guān)于其中胞外配體結(jié)合為衍生自CD19單 克隆抗體（優(yōu)選4G7)的scFV的嵌合抗原受體。本發(fā)明亦關(guān)于編碼所述CAR的多核苷酸、 載體及在其表面表達該CAR的分離的細胞。本發(fā)明亦關(guān)于改造在其表面表達4G7-CAR的免 疫細胞而賦予經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞延長的"活化"狀態(tài)的方法。本發(fā)明尤其可用于治療B-細胞淋 巴瘤及白血病。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 涉及活體外產(chǎn)生的自體抗原特異性T細胞的轉(zhuǎn)移的過繼性免疫治療（adoptive immunotherapy)為治療病毒感染及癌癥的有前景的方法。用于過繼性免疫治療的T細胞可 通過經(jīng)由基因改造擴增抗原特異性T細胞或再導(dǎo)T細胞生成（Park, Rosenberg等人2011)。 病毒抗原特異性T細胞的轉(zhuǎn)移為用于治療移植相關(guān)病毒感染及與罕見病毒相關(guān)的惡性病 的良好確立的程序。類似地，已證實腫瘤特異性T細胞的分離及轉(zhuǎn)移可成功地治療黑素瘤。
[0004] 已成功地經(jīng)由轉(zhuǎn)基因 T細胞受體或嵌合抗原受體（CAR)的基因轉(zhuǎn)移獲得T細胞中 的新穎特異性（Jena, Dotti等人2010)。CAR為合成受體，其由與單一融合分子中的一或多 個信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)的靶向部分組成。一般而言，CAR的結(jié)合部分由單鏈抗體（scFv) 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，該單鏈抗體（scFv)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含單克隆抗體的經(jīng)彈性 接頭接合的輕且可變片段。亦已成功地使用基于受體或配體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合部分。第一代 CAR的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域衍生自⑶3 ζ的細胞質(zhì)區(qū)域或Fc受體γ鏈。已證實第一代CAR可 成功地再導(dǎo)T細胞細胞毒性，然而，其無法提供活體內(nèi)長時間擴增及抗腫瘤活性。來自包括 CD28、0X-40(CD134)、及4_1BB(CD137)的共刺激分子的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域經(jīng)單獨（第二代） 或組合（第三代）添加以提高CAR改造的T細胞的存活率并增加 CAR改造的T細胞的增殖。 CAR已成功地容許將T細胞再導(dǎo)成針對在來自包括淋巴瘤及實體瘤的多種惡性病的腫瘤細 胞的表面處表達的抗原（Jena, Dotti等人2010)。
[0005] CD19為用于免疫治療的吸引人的標靶，因大部分B-急性淋巴母細胞性白血病 (B-ALL) -致表達⑶19,而于非造血細胞、及骨髓、紅血球、及T細胞、及骨髓干細胞上不 存在表達。對B-細胞惡性病的靶向CD19的臨床試驗以鼓舞人的抗腫瘤反應(yīng)進行。大多 數(shù)融合經(jīng)基因改造以表達嵌合抗原受體（CAR)的T細胞與源自CD19-特異性小鼠單克隆 抗體 FMC63 的 scFv 區(qū)的特異性（Nicholson, Lenton 等人 1997 ;Cooper, Topp 等人 2003 ; Cooper, Jena等人2012)(國際申請：W02013/126712)。然而，仍需要改良CAR的建構(gòu)，其顯 示與T-細胞增殖更好的兼容性，以使表達所述CAR的細胞達成顯著臨床優(yōu)點。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明者已生成包含衍生自⑶19特異性單克隆抗體（4G7)的scFV的⑶19特異 性CAR(4G7-CAR)，并驚人地發(fā)現(xiàn)將所得4G7-CAR引入至原代T細胞中可不依賴于抗原結(jié)合 地賦予經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的延長的"活化"狀態(tài)。于活體外非特異性活化（例如，利用經(jīng)抗CD3/ ⑶28涂覆的珠粒及重組IL2)之后，所述細胞相較于經(jīng)包含F(xiàn)MC63 scFV的類似CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的 細胞展現(xiàn)出增加的細胞尺寸（芽細胞（blast)形成）以及活化標記物（CD25)在延長時間 期內(nèi)的表達。該長時間活化容許延長的增殖且提供活體外擴增4G7-CAR細胞的不依賴于抗 原的機制。
[0008] 本發(fā)明因此提供嵌合抗原受體，其包含至少一種胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu) 域及至少一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其中所述胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含衍生自特異性單克隆抗 體4G7的scFV。特定言之，本發(fā)明的CAR -旦轉(zhuǎn)導(dǎo)至免疫細胞中造成該細胞的不依賴于抗 原的活化及增殖。本發(fā)明亦關(guān)于編碼包含衍生自CD19特異性單克隆抗體4G7的scFV的 CAR的核酸、載體及改造免疫細胞的方法，該方法包括將4G7 CAR引入細胞中。本發(fā)明亦 關(guān)于在其表面表達4G7的經(jīng)基因改造的免疫細胞，特別是不依賴于抗原機制增殖的免疫細 胞。本發(fā)明的經(jīng)基因改造的免疫細胞尤其適用于諸如B-細胞淋巴瘤或白血病治療的治療 性應(yīng)用。
[0009] 附圖簡述
[0010] 圖1 :與未經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)K0 T細胞（NTD)相比，用4G7-CAR慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的TCRa非 活化T細胞（K0)的增殖。在利用可溶性抗-CD28再活化的步驟（IL2+CD28)或沒有再活化 (IL2)之后的30天期間跟蹤增殖。
[0011] 圖2 :在經(jīng)4G7-CAR慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的非活化TCR a T細胞的表面上的CD25活化 標記物表達分析，基于4G7-CAR表達（CAR+、CAR-)門控且與TCRa陽性未經(jīng)電穿孔（NEP) 或經(jīng)TCR a破壞但未經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)（NTD)的細胞相比。在利用可溶性抗-CD28再活化的步驟 (IL2+⑶28)或沒有再活化（IL2)之后，分析⑶25表達。
[0012] 圖3 :在用編碼4G7-CAR或FMC63-CAR中任一者的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞的表 面處的CAR表達分析。該分析在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第3、第8及第15天通過流式細胞儀進行。NT指沒 有經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞。
[0013] 圖4 :在用編碼4G7-CAR或FMC63-CAR中任一者的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞的表 面處的CD25表達分析。該分析在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第3、第8及第15天通過流式細胞儀進行。NT指 沒有經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞。
[0014] 圖5 :用編碼4G7-CAR或FMC63-CAR中任一者的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞的尺寸 分析。該分析在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第3、第8及第15天通過流式細胞儀進行。NT指沒有經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細 胞。
[0015] 圖6 :相較于FMC63慢病毒載體，用4G7-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞的增殖。在利用可溶性 抗-CD28再活化的步驟（CD28)或沒有再活化（-)之后的20天期間跟蹤增殖。NTD指沒有 經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞。
[0016] 發(fā)明詳述
[0017] 除非本文中明確地定義，否則使用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有與為熟習(xí)基因治 療、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、及分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)者通常所理解相同的含義。
[0018] 類似或等同于本文所述的所有方法及材料可并與述于本文中的適宜方法及材料 用于本發(fā)明的實施或測試中。本文中述及的所有公開案、專利申請、專利、及其他參考文獻 以其全文引用的方式并入。萬一沖突，將以本說明書（包括定義）為準。此外，除非另作指 明，否則材料、方法、及實例僅說明性而非意圖具限制性。
[0019] 除非另作指明，否則本發(fā)明的實施將利用于本技術(shù)中的習(xí)知的細胞生物學(xué)、細 胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、及免疫學(xué)技術(shù)。所述技術(shù)完整 說明于文獻中。參見：例如，Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M. AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA) ；Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版（Sambrook 等人，2001，紐約冷泉港（Cold Spring Harbor): 冷泉港實驗室出版社）；01ig〇nucleotide Synthesis (M.J. Gait 編輯，1984) ;Mullis 等人 美國專利第 4, 683, 195 號；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries 及 S. J. Higgins 編輯 1984) ;Transcription And Translation (B. D. Hames 及 S. J. Higgins 編輯 1984); Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney、Alan R. Liss,Inc. ,1987) ；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986) ；B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984) ;the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson 及 M.Simon 主編輯， Academic Press, Inc.，紐約），具體言之，第154及155卷（Wu等人編輯）及第185卷，"Gene Expression Technology'，（D. Goeddel 編輯）；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller 與 Μ. P. Calos 編輯，1987,冷泉港實驗室）；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer 及 Walker 編輯，Academic Press，倫敦，1987); Handbook Of Experimental Immunology，第 I-IV 卷（D.M. Weir 及 C.C. Blackwell 編輯， 1986);及Manipulating the Mouse Embryo (冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港，1986)。
[0020] ⑶19特異性嵌合抗原受體
[0021] 本發(fā)明關(guān)于嵌合抗原受體（CAR)，其包含胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
[0022] 如本文所用，術(shù)語"胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域"定義為能夠與配體結(jié)合的寡肽或多肽。 優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)域?qū)⒛軌蚺c細胞表面分子相互作用。例如，胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可經(jīng)選擇以 識別充作與特定疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的標靶細胞上的細胞表面標記物的配體。
[0023] 于優(yōu)選實施方式中，該胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括包含標靶抗原特異性單克隆抗體 的經(jīng)彈性接頭接合的輕（\)及重（VH)可變片段的單鏈抗體片段（scFv)。于優(yōu)選實施方式 中，該scFV衍生自CD19單克隆抗體4G7 (Peipp，Saul等人2004)，優(yōu)選地，本發(fā)明的該scFV 包含CD19單克隆抗體4G7免疫球蛋白γ 1重鏈的一部分（GenBank :CAD88275. 1 ;SEQ ID N0:1)及CD19單克隆抗體4G7免疫球蛋白κ輕鏈的一部分（GenBank :CAD88204. 1 ;SEQ ID NO: 2)，其優(yōu)選經(jīng)彈性接頭連接在一起。于優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的該scFV包含經(jīng)彈性接 頭連接在一起的⑶19單克隆抗體4G7免疫球蛋白γ 1重鏈的可變片段（SEQ ID N0:3)及 CD19單克隆抗體4G7免疫球蛋白κ輕鏈的可變片段（SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5)。于 特定實施方式中，該彈性接頭具有氨基酸序列（SEQ ID N0:6)。
[0024] 換言之，該CAR包含包含衍生自⑶19特異性單克隆抗體4G7的單鏈FV片段的胞 外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。于特定實施方式中，該scFV包含選自由：SEQ ID NO: 1至5組成的組的 氨基酸序列的一部分。于優(yōu)選的實施方式中，該scFV包含與選自由SEQ ID N0:7及SEQ ID NO: 8組成的組的氨基酸序列具有至少70 %，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %、95 %、97 %或 99 %序列同一*性。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的CAR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是在胞外配體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域與標靶結(jié)合導(dǎo)致免疫細胞的活化及免疫反應(yīng)后的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的原因。換言之，信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是其中表達CAR的免疫細胞的至少一種正常效應(yīng)子功能的活化的原因。例 如，T細胞的效應(yīng)子功能可以是溶細胞活性或輔助活性（包括細胞因子的分泌）。因此，術(shù) 語"信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域"指蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子信號功能信號及將細胞導(dǎo)向執(zhí)行特化功能的 一部分。
[0026] 用于CAR中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選實例可為T細胞受體及于抗原受體接合后協(xié) 調(diào)作用以起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共受體的細胞質(zhì)序列、及具有相同功能能力的所述序列的任何衍 生物或變體及任何合成序列。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含兩種不同類別的細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列， 那些起始不依賴于抗原的一級活化的序列、及