ell等人（1985)化化re313:810 ;Rosenberg等人 (1987)Gene, 56:125 ;Gue;rineau等人（1991)Mol.Gen.Genet, 262:141 ;P;rou壯oot(1991) Cell, 64:671;Sanfacon等人GenesDev. , 5:141;Mogen等人（1990)PlantCell, 2:1261 ; Munroe等人（1990)Gene, 91:151;Ballad等人（1989)NucleicAcidsRes. 17:7891Joshi 等人（1987)NucleicAcidRes. ,15:9627)。
[0041] 可用現有的表達載體構建含有所述化MCI基因表達盒的重組載體。所述植物 表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如PAHC25、地in438、 PCAMBIA1302、PCAMBIA2301、PCAMBIA1301、PCAMBIA1300、PBI121、pCAMBIA1391-Xa或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯 區(qū)域，即包含聚腺巧酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺巧 酸信號可引導聚腺巧酸加入到mRNA前體的3'端，如農桿菌冠瘦瘤誘導（Ti)質?；颍ㄈ?姻脂堿合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆膽存蛋白基因）3'端轉錄的非翻譯區(qū)均具有類 似功能。使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄 增強子，運些增強子區(qū)域可W是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼 序列的閱讀框相同，W保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源 是廣泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻譯起始區(qū)域可W來自轉錄起始區(qū)域或結構基 因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工， 如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、蛋光 素酶基因等）、抗生素的標記基因（如賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptll基因，賦 予對除草劑麟絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的h地基因，和賦予對氨甲 噪嶺抗性的化化基因，賦予對草甘憐抗性的EPSPS基因）或是抗化學試劑標記基因等（如 抗除莽劑基因）、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-憐酸異構酶基因。從轉基因植物的安全 性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接W逆境篩選轉化植株。
[0042] 上述生物材料中，所述載體可為質粒、黏粒、隧菌體或病毒載體。所述質?？蔀榻?母表達載體PYES2。
[0043] 上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如大腸桿菌。所述酵母可 為釀酒酵母菌株INVScl。
[0044] 上述生物材料中，所述轉基因植物細胞系不包括繁殖材料。 W45] 在本發(fā)明的一個實施方式中，化MCI的編碼基因通過含有化MCI基因表達盒的重 組載體導入釀酒酵母菌株INVScl中得到重組微生物。所述重組載體為將酵母表達載體PYES2的EcoRI和化0I識別位點間的序列替換為序列表中序列2的第23-1126位核巧酸 所示的DNA分子，得到的重組載體。所述重組載體表達序列1所示的化MCI。所述重組微生 物表達序列1所示的化MCI。
[0046] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了化MCI或所述生物材料在下述Cl)-C5)任 一中的應用：
[0047] C1)調控細胞死亡；
[0048] C2)調控生物氧化脅迫抗性；
[0049] C3)調控橡膠樹死皮發(fā)生；
[0050] C4)選育死皮發(fā)生率降低的橡膠樹品種；
[0051] C5)制備橡膠樹死皮的防治產品。
[0052] 上述應用中，所述死皮可為自然條件下發(fā)生的死皮，也可為誘發(fā)因子誘發(fā)的死皮； 所述細胞死亡可為細胞死亡誘發(fā)因子誘導的細胞死亡。所述細胞死亡誘發(fā)因子和所述死皮 誘發(fā)因子均可為傷害、過氧化氨或乙締利。所述傷害可為機械傷害和/或自然傷害。所述 氧化脅迫可為過氧化氨誘導的氧化脅迫。
[0053] 上述應用中，所述細胞可為微生物細胞或植物細胞。所述微生物細胞可為酵母細 胞；所述植物細胞可為橡膠樹樹皮的細胞。
[0054] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了化MCI或B1)所述核酸分子作為祀標在防 治橡膠樹死皮中的應用。
[0055] 本發(fā)明所提供的化MCI或B1)所述核酸分子作為祀標在防治橡膠樹死皮中的應用 為下述任一用途：
[0056] II)抑制化MCI表達的物質在防治橡膠樹死皮中的應用；
[0057] 12)抑制化MCI編碼基因的轉錄的物質在防治橡膠樹死皮中的應用；
[0058] 13)降低化MCI的表達水平的物質在防治橡膠樹死皮中的應用；
[0059] 14)降低化MCI編碼基因的轉錄水平的物質在防治橡膠樹死皮中的應用；
[0060] 15)使化MCI失活的物質在防治橡膠樹死皮中的應用。
[0061] 上述應用中，所述死皮可W為自然條件下發(fā)生的死皮，也可為死皮誘發(fā)因子誘發(fā) 的死皮；所述死皮誘發(fā)因子可為傷害、過氧化氨或乙締利。所述傷害可為機械傷害和/或自 然傷害。
[0062] 上述應用中，所述化MCI編碼基因可為B1)所述核酸分子。
[0063] 具有如下DD-D5)中至少一種功能的物質在制備防治橡膠樹死皮產品中的應用 也屬于本發(fā)明保護的范圍：
[0064]D1)抑制HbMCl的表達； 陽0化]D2)抑制B1)所述核酸分子的表達；
[0066]D3)降低HbMCl的表達；
[0067] D4)降低B1)所述核酸分子的表達；
[0068] D5)使HbMCl失活。
[0069] 上述應用中，所述死皮可W為自然條件下發(fā)生的死皮，也可為死皮誘發(fā)因子誘發(fā) 的死皮；所述死皮誘發(fā)因子可為傷害、過氧化氨或乙締利。所述傷害可為機械傷害和/或自 然傷害。
[0070] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了下述ED-E4)中任一種方法：
[0071] E1)培育氧化脅迫抗性降低的轉基因生物的方法，包括如下步驟：向受體生物中 導入B1)所述核酸分子，得到轉基因生物；所述轉基因生物與所述受體生物相比對氧化脅 迫的抗性降低； 陽072] E2)培育氧化脅迫抗性提高轉基因生物的方法，包括如下步驟：敲除目的生物中 B1)所述核酸分子或抑制所述目的生物中B1)所述核酸分子的表達，得到轉基因生物；所述 轉基因生物與所述目的生物相比對氧化脅迫的抗性提高；
[0073] E3)培育抗死皮發(fā)生轉基因生物的方法，包括如下步驟：敲除目的生物中B1)所述 核酸分子或抑制所述目的生物中B1)所述核酸分子的表達，得到轉基因生物；所述轉基因 生物群體中的死皮發(fā)生率低于所述目的生物群體中的死皮發(fā)生率；
[0074] E4)培育非抗死皮發(fā)生轉基因生物的方法，包括如下步驟：向受體生物中導入B1) 所述核酸分子，得到轉基因生物；所述轉基因生物群體中的死皮發(fā)生率高于所述目的生物 群體中的死皮發(fā)生率。
[00巧]上述方法中，B1)所述核酸分子可先進行如下修飾，再導入所述受體生物中，W達 到更好的表達效果：
[0076] 1)根據實際需要進行修飾和優(yōu)化，W使基因高效表達；例如，可根據受體植物所 偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述化MCI編碼基因的氨基酸序列的同時改變其密碼子W符 合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，W最好地 實現植物中導入基因的高水平表達，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約 60% ；
[0077]。修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，W使翻譯有效起始；例如，利用在植物中 已知的有效的序列進行修飾；
[007引扣與各種植物表達的啟動子連接，W利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括 組成型、誘導型、時序調節(jié)、發(fā)育調節(jié)、化學調節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的 選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于祀物種；例如組織或器官的特異性 表達啟動子，根據需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多 啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于 雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；
[0079] 4)與適合的轉錄終止子連接，也可W提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于 CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可W與本發(fā) 明基因進行連接；
[0080] 5)引入增強子序列，如內含子序列（例如來源于A化1和bronzel)和病毒前導序 列（例如來源于TMV，MCMV和AMV)。
[0081] 上述方法中，所述轉基因植物理解為不僅包含將所述基因轉化受體植物得到的第 一代轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可W在該物種中繁殖該基因，也可用常 規(guī)育種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉基因植 物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。
[0082] 上述方法中，所述化MCI編碼基因可為B1)所述核酸分子。
[0083] 上述方法中，所述目的生物或所述受體生物可為微生物或植物。所述微生物具體 可為酵母，所述植物具體可為橡膠樹。
[0084] 上述方法中，所述死皮可W為自然條件下發(fā)生的死皮，也可為死皮誘發(fā)因子誘發(fā) 的死皮。所述死皮誘發(fā)因子可為傷害、過氧化氨或乙締利。所述傷害可為機械傷害和/或 自然傷害。所述氧化脅迫可為過氧化氨誘導的氧化脅迫。 W85] 實驗證明，本發(fā)明的化MCI及其編碼基因可W降低生物的氧化脅迫抗 性，促進氧化脅迫下細胞的死亡：在未經&〇2處理時，含有化MC1基因的重組酵母 INVScl (pYES2-冊MCI)和不含化MCI基因的重組酵母INVScl (pYES2)在液體和固體誘導培 養(yǎng)基中的生長沒有明顯差異。將等量的重組酵母INVScl(pYES2-冊MCI)和INVScl(pYES2) 接種到2、2. 5和3mM &〇2的固體誘導培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)3天后，發(fā)現不同濃度H2O2脅 迫處理下，重組酵母INVScl(pYES2-冊MCI)的菌斑數要明顯少于INVScl(pYES2)。將等 量的重組酵母INVScl(pYES2-冊MCI)和INVScl(pYES2)接種到2、2. 5和3mM &〇2的液 體誘導培養(yǎng)基中，30°C，200巧m振蕩培養(yǎng)36h，測定菌液ODe。。值，發(fā)現不同濃度Η 2〇2脅迫 處理下INVScl(pYES2-冊MCI)的ODe。。值均顯著小于INVScl(pYES2)。其中，3mM Η 202處 理條件下，INVScl(pYES2-冊MCI)的ODe。。值僅為INVScl(pYES2)0D日。。值的：Μ. 5 %。進一 步研究發(fā)現，高濃度&〇2巧ml)處理lOh后，重組酵母INVScl(pYES2-冊MCI)的細胞死亡 率明顯高于INVScl(pYES2)。W上結果表明，在酵母中表達化MCI基因會抑制重組酵母 INVScl(PYES2-冊MCI)在氧化脅迫下的生長，提高氧化脅迫下的細胞死亡率，降低重組酵母 對氧化脅迫的抗性。
[0086] 化MCI基因在死皮橡膠樹樹皮和膠乳中的表達水平高于健康橡膠樹，且化MCI基 因的表達受死皮誘導因子傷害、&〇2及乙締利誘導，表明化MCI基因的表達與橡膠樹死皮發(fā) 生密切相關。利用酵母表達系統(tǒng)對化MCI基因的功能鑒定表明，化MCI基因正調控&〇2介 導的細胞死亡。W上結果表明，橡膠樹化MCI基因在死皮發(fā)生中起著重要作用，該基因表達 的上調會導致細胞死亡，進而引發(fā)死皮的發(fā)生。運不僅豐富了橡膠樹死皮發(fā)生的分子機制， 也為進一步研究細胞程序性死亡在橡膠樹死皮發(fā)生中的作用奠定了基礎?；疢CI及其編碼 基因也可作為橡膠樹死皮防控的重要祀標，有望通過調控化MCI及其編碼基因的表達來防 治橡膠樹死皮，包括：（1)構建針對化MCI編碼基因的反義表達、RNAi及基因敲除載體，并 將其轉化到橡膠樹中，通過抑制化MCI基因的表達或敲除化MCI基因培育篩選得到死皮發(fā) 生率降低的轉基因橡膠樹；（2)W化MCI或其編碼基因為祀標開發(fā)橡膠樹死皮防治藥物。
【附圖說明】
[0087] 圖1為橡膠樹化MCI蛋白保守結構域預測結果。
[0088] 圖2為橡膠樹化MCI與其他植物metacaspase蛋白的系統(tǒng)進化樹。
[0089] 圖3為橡膠樹化MCI基因在健康和死皮橡膠樹膠乳及樹皮中的表達差異分析。
[0090] 其中"**"表示在0. 01水平上化MCI基因的表達量在健康樹與死皮樹之間具有顯 著差異。 陽0川圖4為傷害處理對膠乳中化MCI基因表達的影響。
[0092]其中和"**"分別表示處理與對照（Oh)在0. 05和0. 01水平上具有顯著差異。 陽09引圖5為&〇2處理后膠乳中化MCI基因的表達變化。其中表示處理與對照（Oh) 在0.05水平上具有顯著差異。
[0094]圖6為乙締利處理后膠乳中化MCI基因的表達變化。 陽0巧]其中和"**"分別表示處理與對照（Oh)在0. 05和0. 01水平上具有顯著差異。
[0096] 圖7為不同誘導時間點重組酵母中