一種提高植物耐鹽耐旱性的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種提高植物耐鹽耐旱性的蛋白及其編碼基 因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 非生物逆境，如高溫、干旱、高鹽、堿性±壤、重金屬W及過氧化逆境等，都嚴(yán)重威 脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，是造成世界范圍內(nèi)農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因。植物的生長、發(fā)育W及農(nóng)作物的 產(chǎn)量、品質(zhì)和后期生長等均受到非生物逆境脅迫的影響，而且全球范圍內(nèi)的主要作物60% 的減產(chǎn)量是由非生物逆境的脅迫所導(dǎo)致。為了確保農(nóng)作物持續(xù)穩(wěn)定的高產(chǎn)，人類亟需培育 出對干旱、高鹽、過氧化等非生物逆境脅迫具有更高耐受能力的作物新品種。但通過傳統(tǒng)的 育種方法在改善農(nóng)作物的性狀和抗逆性的進展緩慢，而利用生物基因工程技術(shù)則具有良好 的預(yù)見性、更高的效率，是培育具有耐逆性農(nóng)作物新品種最有效的途徑。利用現(xiàn)代分子生物 學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的耐逆境基因，是培育抗逆性農(nóng)作物新品種的關(guān)鍵所在。
[0003] 干旱和高鹽脅迫是限制谷類作物產(chǎn)量增加最主要的兩個因素。為了適應(yīng)運些不利 環(huán)境帶來的生存壓力，植物進化出了多種多樣的復(fù)雜的生物機制，調(diào)節(jié)許多逆境相關(guān)基因 的表達，試圖減少運些逆境對其造成的損傷。運些基因參與到不同的生物途徑和過程中，包 括逆境感知和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致分子、生化、細胞、生理和形態(tài)的適應(yīng)，最終使整個植物發(fā) 生響應(yīng)。到目前為止，已經(jīng)有大量的逆境相關(guān)基因被克隆和鑒定，例如水稻Pro合成酶基因 (0sP5CS;)、水稻Pro轉(zhuǎn)運酶基因（OsProT)、水稻轉(zhuǎn)錄因子基因（0SDREB2A)和水稻胚胎晚 期豐富蛋白基因（0SLEA3)。運些基因一旦被激活，則會影響MDA和Pro在細胞中的積累，從 而使植物免受由于高鹽、干旱和過氧化物等逆境脅迫所產(chǎn)生的傷害。MDA是反應(yīng)脂質(zhì)過氧 化損傷程度最重要的指標(biāo)。自由Pro的積累則是植物在遭受非生物逆境時最重要的反應(yīng)機 審IJ，其作用在于通過改變細胞內(nèi)的滲透勢來維持植物的亞細胞結(jié)構(gòu)，從而使植物免受逆境 的傷害。
[0004] 研究顯示，大量的PMP3家族基因參與植物對逆境的反應(yīng)過程。PMP3是一類廣泛 存在于在包括酵母、小型動物、水草和高等植物在內(nèi)的多種生物體內(nèi)的疏水性小蛋白，且W 多基因家族的形式存在。大量實驗結(jié)果表明，植物PMP3基因?qū)Πǜ啕}、干旱或者寒冷 等在內(nèi)的多種逆境有所反應(yīng)，從而參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)過程。運些基因編碼的蛋 白質(zhì)包括來自大麥的LeESUiXophopyrumelongatum)、來自水稻的 0sRCI2-5、0sLti6a/ b和RIGIB(Oryzasativa)、來自羊草的AcPMP3_l(Aneurolepidiumchinense)、來自水稻 的AtRCI2A/B/D/F(A;r油idopsisthaliana)、來自星星草的PutPMP3-l/-2(Puccinellia tenuiflora)和來自玉米的ZmPMP3-2/3/4狂eamays)。有證據(jù)顯示，PMP3基因的功能和反 應(yīng)根據(jù)其參與的不同的逆境反應(yīng)途徑而各有不同。例如蛋白質(zhì)AtRCI2A可能參與水稻在非 生物逆境下不依賴CBF/DREB1信號途徑的反應(yīng)過程，但是水稻中的0sLti6a蛋白則在低溫 逆境條件下受DR邸轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。報道顯示，植物PMP3基因也能被一些信號分子所誘 導(dǎo)表達，運些信號包括：ΑΒΑ和&〇2,因此我們推測PMP3基因可能在植物ΑΒΑ依賴型逆境反 應(yīng)過程中也發(fā)揮著重要的作用。
[0005] 在酵母中，Pmp化蛋白能夠阻止外界環(huán)境中的化+離子進入到細胞中，從而起到保 護細胞膜的電位的作用。將植物的PMP3蛋白在酵母中異源表達后，能夠彌補pmp3突變體 所缺失的功能，說明植物中的PMP3蛋白可能也具有類似的作用。敲除水稻的AtRCI2A基 因后，突變體植株對鹽和化+離子的敏感性增強而在水稻中過量表達AtRCI2A基因則具有 相反的作用。而且，在羊草中，ACPMP3-1基因被定位在具有調(diào)節(jié)化+和K+離子濃度的根冠 中。雖然人們普遍認(rèn)為PMP3基因間接參與調(diào)控了細胞對離子的吸收，但是其確切的作用機 制仍然有待闡明。由于PMP3蛋白的分子質(zhì)量普遍較小，它們是不可能形成離子通道的，因 此人們對PMP3蛋白在逆境反應(yīng)過程中的具體作用仍知之甚少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高植物耐鹽耐旱性的蛋白及其編碼 基因與應(yīng)用。
[0007] 所述提高植物耐鹽耐旱性的蛋白的序列如SEQIDNO. 1所示，命名為MePMP3-2蛋 白，來源于木署。
[0008] 編碼上述蛋白的基因的序列如SEQIDNO. 2所示，命名為MePMP3-2基因。
[0009] 所述植物重組表達載體含有上述的MePMP3-2基因。
[0010] 優(yōu)選地，所述植物重組表達載體是將所述的MePMP3-2基因插入空載體中而構(gòu)建 的植物重組表達載體，所述空載體選自抑B、PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、PBI121、pBinl9、 PCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或地Y505。
[0011] 優(yōu)選地，所述植物重組表達載體是將所述的MePMP3-2基因插入到空載體P皿的多 克隆位點而構(gòu)建的植物重組表達載體，植物重組表達載體的序列如SEQIDNO. 3所示，命名 為P皿：：MePMP3-2植物表達載體。
[0012] 上述蛋白MePMP3-2、上述MePMP3-2基因和上述植物重組表達載體可用于培育耐 旱和耐鹽植物。所述植物為為雙子葉植物或單子葉植物。所述單子葉植物為水稻。
[0013] 下面對本發(fā)明作進一步說明：
[0014] MePMP3-2的氨基酸序列（SEQIDNO. 1)，包括77個氨基酸，該蛋白質(zhì)的分子 量為8. 65KD，等電點為4. 94。生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MePMP3-2含有保守結(jié)構(gòu)域 PS01309 ([LIVF] -X- [STAC] - [LIVF] (3) -P- [PF] - [LIVA] - [GAV] - [IV]-X(4) - [GK閑），分別是 SEQIDNO. 1中的第11-27位W及第33-50位的氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域。該蛋白質(zhì)是國際上 未曾報道的新蛋白質(zhì)。
[0015] SEQIDNO. 2所述序列為編碼MePMP3-2的全長cDNA序列，該序列共由743個堿基 組成，其中，5'端未翻譯區(qū)包括180個堿基，3'端未翻譯區(qū)包括200個堿基（其中包括第271 位-第399位堿基組成的內(nèi)含子，不參與該蛋白質(zhì)的編碼），編碼區(qū)由231個堿基（第181 位-第270位和第400-第543位）組成，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的MePMP3-2 蛋白，編碼區(qū)中，A占15. 15% (35個），C占25. 54%巧9個），G占21. 21% (49個），T占 38. 09 % (88個），A巧占53. 25 % (123個），C+G占46. 75 % (108個）。數(shù)據(jù)庫捜索氨基酸 與核巧酸序列發(fā)現(xiàn)，PMP3基因家族是目前已知基因中與MePMP3-2同源性最高的基因，雖然 核巧酸序列的同源性較低，但是氨基酸的同源性達到53. 8%，初步推測基因MePMP3-2屬于 PMP3基因家族。目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)任何與該基因的相關(guān)的研究報道。
[0016] 可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有MePMP3-2基因的重組表達載體。所述植物 表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如P皿、PCAMBIA3301、 PCAMBIA1300、PBI121、地inl9、PCAMBIA2301、PCAMBIA1301-UMN、地Y505 或其它衍生植物 表達載體。
[0017] 使用MePMP3-2基因構(gòu)建重組表達載體時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核巧酸前加上任何一 種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花挪菜花葉病毒（CAMV)35S啟動子、泛 素OJbiquitin)基因啟動子（P化i)、Actin啟動子等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動 子結(jié)合使用。
[0018] 此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子 或轉(zhuǎn)錄增強子，運些增強子區(qū)域可W是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需 與編碼序列的閱讀框相同，W保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子 的來源是廣泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻譯起始區(qū)域可W來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或 結(jié)構(gòu)基因。
[0019] 為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入在植物中表達可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、 蛋光素酶基因等）、具有抗性的抗生素標(biāo)記物（慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等）或是 抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因（如抗除莽劑基因）等。
[0020] 上述植物重組表達載體是將上述的MePMP3-2基因插入P皿的多克隆位點，得到的 植物重組表達載體。
[0021] 將上述的MePMP3-2基因?qū)肽康闹参?，得到耐旱和耐鹽轉(zhuǎn)基因植物，所述耐旱和 耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的耐旱和耐鹽性高于目的植物。
[0022] 所述耐旱和耐鹽轉(zhuǎn)基因植物為耐高鹽、耐甘露醇、耐PEG和/或耐干旱轉(zhuǎn)基因植 物。
[0023] 上述的MePMP3-2基因是通過上述的植物重組表達載體導(dǎo)入目的植物中