扁蓿豆脫水蛋白基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物基因工程技術領域，尤其設及扁猜豆脫水蛋白基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 脫水蛋白屬于晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白（lateembiTogenesis油undantprotein) LEAII家族。脫水蛋白最初在種子中發(fā)現(xiàn)，隨后的研究表明脫水蛋白廣泛分布于藻類、酵 母、線蟲、藍細菌W及高等植物的各個組織和器官中。干旱、低溫和高鹽等引起脫水的環(huán)境 因素W及脫落酸（ABA)均能誘導其在細胞中的表達。脫水蛋白含有至少一個保守的富含賴 氨酸的基序K-片段巧KKGIMDKIKEKLPG或其衍生物），它們常形成雙親性(親水親脂）的螺 旋結構。有些脫水蛋白通常還包含Y-片段和S-片段，Y-片段通常W1-3個重復形式燈/ VDEYGNP)出現(xiàn)在脫水蛋白的N-端，S片段由一系列絲氨酸（Ser)殘基組成?；赮，S，K片 段出現(xiàn)的類型和數(shù)量可將脫水蛋白分為5個亞家族：化SKn,SKn,Kn,化Kn和KnS。
[0003] 脫水蛋白在細胞內(nèi)的功能與細胞脫水保護有關。通過轉基因技術，將大麥脫水蛋 白基因ZmDHN化轉入煙草，轉基因植株的抗低溫能力提高；擬南芥中超表達小麥DHN-5基因 可W增強其對鹽和滲透脅迫的抗性；小麥脫水蛋白基因WC0R410過表達能夠增強草替的抗 凍性。因此，脫水蛋白可能是包括植物、細菌W及低等動物細胞獲得脫水耐受性的決定性因 素之一，盡管其具體的機制尚不清楚。同時，脫水蛋白基因也在植物干旱、低溫、高鹽等非生 物脅迫抗性改良中具有重要的潛在應用價值。
[0004] 除了植物遺傳轉化試驗W外，大腸桿菌和酵母等異源表達系統(tǒng)也被廣泛用于脫水 蛋白的鑒定。過表達大豆LEA3家族中的一個PM2蛋白和KS型脫水蛋白SLT1629能夠明顯 提高到大腸桿菌可提高大腸桿菌抗鹽能力；將大麥脫水蛋白引入酵母后可W使其獲得對高 鹽脅迫的耐受性。因此，利用酵母、大腸桿菌表達系統(tǒng)可W作為鑒定脫水蛋白的有效體系。
[0005] 扁猜豆ife扣Ca洗rutAenica任J廣泛分布于西伯利亞，蒙古和我國的北方高締 度高寒地區(qū)，多生長于山坡草地處，對逆境具有極強的耐受性，是唯一能夠在高海拔極端高 寒地區(qū)正常越冬的首猜屬多年生豆科牧草。目前只有零星扁猜豆脫水蛋白基因克隆的報 道，但尚無對其抗逆功能鑒定的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種改良植物和微生物抗鹽及耐熱性的扁猜 豆脫水蛋白基因。
[0007] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供該基因在改良植物和微生物抗鹽及耐 熱方面的應用。
[0008] 為解決上述問題，本發(fā)明所述的扁猜豆脫水蛋白基因，其特征在于：該基因為 必'化^滿§碼基因，它具有序列表中SEQIDNO. 1第1位到890位所示的核巧酸序列。
[0009] 所述基因具有序列表中SEQIDNO. 1第1位到890位中因一個或多個堿基的缺失、 插入或替換而形成的具有功能活性的等位基因。
[0010] 所述基因具有序列表中SEQIDNO. 2第I位到221位所示的氨基酸殘基序列的蛋 白質。
[0011] 所述基因具有序列表中SEQIDNO. 2第1位到221位所示的氨基酸殘基序列經(jīng)一 個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加但含1個一系列絲氨酸（Ser)殘基的S-片段和2 個富含賴氨酸殘基的K-片段（EKKGIMDKIKEKLPG或其衍生物）且具有與SEQIDNO. 2氨基 酸殘基序列相同活性的由SEQIDNO. 2衍生的蛋白質；所述由SEQIDNO. 2衍生的蛋白質 的序列與等位基因的序列相對應。
[0012] 如上所述的扁猜豆脫水蛋白基因在改良植物和微生物抗鹽及耐熱方面的應用。
[0013] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有W下優(yōu)點： 1、本發(fā)明通過轉錄組學分析，結合RT-PCR技術，在扁猜豆中分離到一個新的脫水蛋白 基因i/rWWJ。將i/r化Wt?基因編碼區(qū)連接到大腸桿菌表達載體后，將該原核表達載體轉入 大腸桿菌表達菌株，用IPTG誘導實現(xiàn)了化畑N3蛋白在大腸桿菌中的過量表達，結果顯示， 化畑N3蛋白過量表達對高鹽和熱脅迫下的大腸桿菌具有保護效果，因此，通過生物技術方 法可將該基因用于植物和微生物的抗鹽和耐熱性改良。
[0014] 2、通過對本發(fā)明中的扁猜豆脫水蛋白基因進行RT-PCR擴增后，進行瓊脂糖凝膠 電泳巧日圖1，圖5~8所示)，可W檢測到約9(K)bp的擴增產(chǎn)物。
[0015] 3、通過將本發(fā)明中的扁猜豆脫水蛋白i/r化W?基因的編碼區(qū)連接到大腸桿菌表達 載體，經(jīng)過酶切鑒定后（如圖9所示），轉化大腸桿菌表達載體，含有如上述構建的i/r化W? 基因的原核表達載體的大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導，對培養(yǎng)物菌體總蛋白進行SDS-PAGE電泳， 結果顯示誘導后的大腸桿菌培養(yǎng)物中具有一條與預期分子量相近的蛋白條帶巧日圖10所 示)，因此扁猜豆脫水蛋白化畑N3能夠在大腸桿菌中過量表達。
[0016] 4、通過對過量表達本發(fā)明中的扁猜豆脫水蛋白化畑N3的大腸桿菌經(jīng)熱脅迫處理 和在含高鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，觀察如上所述大腸桿菌的生長存活情況，結果顯示化畑N3蛋 白過量表達能夠提高大腸桿菌宿主對高鹽脅迫和熱脅迫處理的耐受性（如圖11~12所示）， 因此化DHN3蛋白在高鹽脅迫和熱脅迫處理下對細胞具有保護效果。
[0017]5、本發(fā)明的基因結構特征： 本發(fā)明根據(jù)對扁猜豆轉錄組測序結果，設計PCR引物，其中引物P1+P2用于擴增含有 5'-和3'-非翻譯區(qū)和編碼區(qū)的i/r化W?基因序列（圖1~2)。引物P3+P4擴增i/r化W?基因 編碼區(qū)核巧酸序列，用于原核表達鑒定克隆基因的功能活性。
[001引用引物P1+P2,扁猜豆CDNA為模板進行擴增，得到約9(K)bp的條帶（圖1)。測序后 獲得89化P巧日圖2)如序列表SEQIDNO. 1所示的含有5'-和3'-非翻譯區(qū)和編碼區(qū)的 i/r化W?基因序列，其中173-839位為翻譯區(qū)。由SEQIDNO. 1序列推導出的氨基酸序列如圖 2(S片段用下劃線標出，2個保守的K片段用陰影標出)和序列表SEQIDNO. 2所示。該氨基 酸序列顯示，蛋白質產(chǎn)物由221個氨基酸殘基組成，預測分子量（Mw)為24.84kD，理論等 電點（pi)為5. 56,為酸性蛋白。總平均疏水性指數(shù)Grandaverageofhy化opathicity (GRAVY)為-I. 444,具有較高的親水性。在Pfam數(shù)據(jù)庫化ttp://pfam.janelia.org)數(shù) 據(jù)庫對化DHN3編碼的氨基酸序列的結構域進行捜索表明，化DHN3蛋白屬于LEAII蛋白家 族，存在一個S-片段(實線框標出)和2個富含賴氨酸殘基的K-片段(虛線框標出）（圖3)， 為SK2型脫水蛋白。在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST對化DHN3編碼蛋白質的氨基酸序列和其 它物種蛋白質氨基酸序列比較（圖3)發(fā)現(xiàn)與裝襲首猜（Medicagotruncatula)和白S葉(Trifoliumrepens)氨基酸序列一致性（identity)最高，達81%W上。對NCBI下載的6 個物種的SKn型脫水蛋白氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹（圖4)發(fā)現(xiàn)，化DHN3與豆科植物魏豆 SK2蛋白的萊緣關系最近。
【附圖說明】
[0019] 下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0020] 圖1為本發(fā)明扁猜豆脫水蛋白基因i/r化W撕RT-PCR克隆產(chǎn)物電泳圖譜。
[0021] 圖2為本發(fā)明i/r化W?基因CDNA序列及其所編碼蛋白質的氨基酸序列。
[0022] 圖3為本發(fā)明扁猜豆脫水蛋白化畑N3和其它物種脫水蛋白氨基酸序 列的比對分析。其中TrDHNS(ADD09573. 1)來自白S葉燈rifoliumr巧ens); Mt畑N3〇(P_003603987. 1)來自裝襲首猜（Medicagotruncatula) ;Ps畑N3(CAA78515. 1)來 自魏豆（Pisumsativum) ;CaDHN3(XP_004500781. 1)來自鷹嘴豆（Cicerarietinum)。1個 實線框示保守的S-片段，2個虛線框為保守的富含賴氨酸殘基的K-片段。
[0023] 圖4為本發(fā)明扁猜豆脫水蛋白化DHN3和其它物種SKn型脫水蛋白構建的系 統(tǒng)進化樹。其中 0sDHN3(ABS44866. 1)來自梗稻（OryzasativaJaponicaGroup)