截短型丙型肝炎病毒hcv ns3抗原及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種丙型肝炎病毒抗原及其制備與應(yīng)用，尤其設(shè)及一種截短型丙型肝 炎病毒HCVNS3抗原及其制備與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎病毒化巧atitisCvirus,HCV)感染最顯著的臨床特征就是引起慢性感 染，約有70%的丙肝有可能發(fā)展成慢性肝炎，20%發(fā)展成肝硬化，12%發(fā)展成肝癌，危害十 分地嚴(yán)重。全球HCV的感染率為2. 8%，約有1.85億人攜帶HCV。我國(guó)屬于HCV低流行區(qū)， 預(yù)計(jì)我國(guó)HCV感染者1000萬(wàn)，而且每年的新發(fā)病例數(shù)不斷上升。
[0003] 自1989年HCV基因獲得克隆W來(lái)，人們一直在致力于HCV相關(guān)疫苗的研究工作。 HCV基因組長(zhǎng)約9. 6化，編碼一個(gè)長(zhǎng)約3000個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白前體，在宿主信號(hào)膚 酶和病毒自身編碼蛋白酶的作用下生成4種結(jié)構(gòu)蛋白（C、E1、E2、P7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。但因病毒RNA在血液含量較低且非常不穩(wěn)定，HCV基 因組變異率較高，病毒準(zhǔn)種多，缺乏理想的體外感染細(xì)胞模型，而導(dǎo)致預(yù)防性疫苗缺乏保護(hù) 性抗體。由于目前沒(méi)有有效治療丙型肝炎的藥物，因此早期發(fā)現(xiàn)HCV感染，準(zhǔn)確判斷病毒亞 型及患者感染狀況，是有效防控丙肝的重要手段。目前，我國(guó)控制該疾病蔓延的手段主要采 用血液篩查，運(yùn)也使得研究開(kāi)發(fā)快速靈敏的丙型肝炎病毒檢測(cè)試劑盒具有十分重要的臨床 意義。
[0004] 已報(bào)到的有關(guān)肥V檢測(cè)的ELISA試劑盒主要包含C區(qū)、NS3區(qū)、NS4區(qū)的抗原，有的 也包含NS5區(qū)的抗原。但對(duì)NS5區(qū)抗原作用的評(píng)價(jià)，卻褒貶不一。
[0005] Core、C33(NS3)抗原在抗原反應(yīng)性上有很好的互補(bǔ)性。其聯(lián)合檢出率平均值可在 99%左右，是研究HCV診斷試劑的重點(diǎn)區(qū)段。NS3基因位于HCV全基因序列的3420-53^nt 位點(diǎn)，編碼含有631aa(l〇26-1656aa)的NS3蛋白p72,其氨基酸序列相對(duì)保守，與黃病毒 及攝病毒相應(yīng)區(qū)段有較高的同源性。NS3蛋白具有多種蛋白酶活性，在病毒多蛋白前體的 加工及各蛋白的轉(zhuǎn)化成熟過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，非結(jié)構(gòu)區(qū)各蛋白的產(chǎn)生均有賴于該蛋白 對(duì)病毒多蛋白前體的酶解和修飾。免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，NS3蛋白的抗原性和免疫原性相對(duì)較 強(qiáng)，是檢測(cè)HCV感染的主要抗原之一，在誘導(dǎo)機(jī)體的抗病毒免疫方面也有一定的意義。感 染者對(duì)NS3的抗體反應(yīng)不僅出現(xiàn)早，且滴度高、特異性強(qiáng)，抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間一般為8周左右， 幾乎與抗HCV同步。目前，單片段HCV-NS3抗體的檢出率為76. 47%-89. 47%。在經(jīng)對(duì)丙 型肝炎病毒的免疫學(xué)信息研究發(fā)現(xiàn)，HCV在患者血液中的抗體主要是對(duì)W下抗原表位的免 疫應(yīng)答產(chǎn)生，Core(2-120aa)，NS3 (1026-1457aa)，NS4 (1694-1735aa)，NS4 (1859-1931aa)， NS5A(2212-2313aa)。但在應(yīng)用中，存在診斷試劑加入的NS3全長(zhǎng)基因表達(dá)的蛋白過(guò)大，與 其它優(yōu)勢(shì)抗原表位串聯(lián)表達(dá)后，會(huì)因空間結(jié)構(gòu)的遮擋而使部分抗原失去活性的缺陷?；?此，尋找和確立與丙型肝炎病毒RNA陽(yáng)性患者的檢出符合率高、靈敏度高的截短型丙型肝 炎病毒HCVNS3抗原，對(duì)開(kāi)發(fā)更加有效的早期診斷丙型肝炎病毒HCV的多克隆抗體或單克 隆抗體和丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種截短型丙型肝炎病毒HCV NS3 抗原及其制備與應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人查找閱讀國(guó)內(nèi)外HCV NS3文獻(xiàn)，并根據(jù)HCV sequences dat油ase (ht1:p:/Aepatitis. ibcp. fr.)，篩選出6條分屬于HCV 6種基因型的NS3抗原序 列，通過(guò)序列對(duì)比、分析，篩選得到NS31252-1526aa截短型HCV NS3氨基酸序列，查找NCBI 得到對(duì)應(yīng)核巧酸序列，并進(jìn)一步選擇大腸桿菌的偏好性密碼子設(shè)計(jì)并合成截短型NS3抗原 基因核巧酸序列。
[0008] 本發(fā)明所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原，其特征在于：所述抗原是HCV基因 組中NS3全長(zhǎng)基因編碼的第1252~1526aa片段非結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列，其氨基酸序列如 SEQIDNO. 1所示，對(duì)應(yīng)核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示；與SEQIDNO. 2所示的核巧酸序 列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與SEQIDNO. 2的核巧酸序列不同的 序列；對(duì)所述SEQIDNO. 2所示核巧酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的 核巧酸序列。
[0009] 上述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原，優(yōu)選是HCV基因組中NS3全長(zhǎng)基因編碼 的第1252~1526aa片段非結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，對(duì)應(yīng) 核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0010] 本發(fā)明公開(kāi)了一種用于表達(dá)權(quán)利要求1所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原的 大腸桿菌優(yōu)化密碼子，其特征在于：所述密碼子核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示，其編碼的 氨基酸對(duì)應(yīng)SEQIDNO. 2所示的核巧酸序列編碼的氨基酸。
[0011] 本發(fā)明所述截短型丙型肝炎病毒HCV NS3重組抗原蛋白制備方法，步驟是：
[0012] (1)構(gòu)建用于表達(dá)權(quán)利要求1所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原的大腸桿菌 優(yōu)化密碼子，其核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示； 陽(yáng)01引 似將所述密碼子基因片段經(jīng)BamHI和化〇1雙酶化酶切產(chǎn)物純化回收后，與經(jīng)同 樣限制性內(nèi)切酶酶切后的表達(dá)載體祀T28a連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒（構(gòu)建的表達(dá)載體需用PCR法鑒定，W證明截短型NS3抗原基因片段已獲正確插入）；
[0014] (3)通過(guò)化C12法將制得的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)D冊(cè)α，涂布于含 50 μ g/mlKan+的LB瓊脂培養(yǎng)基上，篩選得到陽(yáng)性質(zhì)粒； 陽(yáng)〇1引 （4)將步驟做中得到的陽(yáng)性質(zhì)粒，通過(guò)化C1進(jìn)轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli化21觸如 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan+的LB瓊脂培養(yǎng)基上，常規(guī)培養(yǎng)；挑取單菌落接種至Kan+的LB液 體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜；次日，轉(zhuǎn)接于新鮮的含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0成。。> 0. 6 時(shí)加入IPTG至終濃度為0. 2-0. 8mM，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)12-1化，獲得含HCVNS3重組抗原蛋白 的全菌液（取全菌液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，證明截短型NS3重組抗原已得到高效表達(dá)），經(jīng)過(guò) 親和儀柱層析純化和離子交換柱純化，即得到高純度的截短型HCVNS3重組抗原。
[0016] 一種多克隆抗體或單克隆抗體，其特征在于：所述抗體是能與截短型丙型肝炎病 毒HCVNS3抗原特異性結(jié)合的多克隆抗體或單克隆抗體。
[0017] 將制得的截短型HCV NS3重組抗原蛋白免疫小鼠（注射小鼠），經(jīng)常規(guī)單克隆抗體 制備方法，純化分離，即可制備出所述重組抗原特異性結(jié)合的多克隆抗體或單克隆抗體。
[0018] 或者用制得的截短型HCVNS3重組抗原包被酶聯(lián)板，采用間接酶聯(lián)免疫法建立抗 HCVNS3抗體技術(shù)，檢測(cè)其臨床意義。
[0019] 本發(fā)明所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原在制備丙型肝炎病毒HCV抗原或抗 體檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明所述多克隆抗體或單克隆抗體在制備檢測(cè)丙型肝炎病毒HCV抗原試劑盒 中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原和其多克隆抗體或單克隆抗體，可 W用于開(kāi)發(fā)丙型肝炎病毒HCV抗原或抗體檢測(cè)試劑盒或作為其他HCV檢測(cè)產(chǎn)品的重要原 料，對(duì)更加有效的開(kāi)發(fā)早期診斷丙型肝炎病毒HCV的多克隆抗體或單克隆抗體和丙型肝炎 病毒抗體檢測(cè)試劑盒提供了支持。
[0022] 申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)分析NS3全長(zhǎng)基因片段，將NS3基因分成2段分別表達(dá)，1026-1251aa， 1252-1526aa，通過(guò)基因重組的方法，分別制備出2段重組抗原。經(jīng)活性檢測(cè)，1252-1526aa 片段重組蛋白具有高靈敏度、高特異性特點(diǎn)。用其檢測(cè)HCV抗體，與隨機(jī)丙型肝炎病毒RNA 陽(yáng)性患者的檢出符合率高達(dá)97%。預(yù)示該抗原可W應(yīng)用于多克隆抗體、單克隆抗體、丙型肝 炎病毒檢測(cè)試劑盒，尤其是丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒的制備，具有良好的臨床應(yīng)用前 景。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)比，本發(fā)明技術(shù)具有W下特點(diǎn)：
[0024] 1、截短型HCVNS3重組抗原的篩選是通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)的
[0025] 本發(fā)明利用生物信息學(xué)技術(shù)，根據(jù)HCV6種基因型氨基酸序列同源性，對(duì)大量HCV NS3序列進(jìn)行篩選，最終得到1條序列保守的截短型HCVNS3重組片段。 陽(yáng)0%] 2、截短型HCVNS3重組抗原具有極高的陽(yáng)性血清覆蓋率
[0027] 本發(fā)明將截短型HCVNS3重組序列，通過(guò)大腸桿菌偏好性密碼子優(yōu)化后表達(dá)，最大 限度減小了NS3蛋白分子量，保持了截短型HCVNS3重組抗原的生物活性，進(jìn)而可W結(jié)合不 同HCV基因型HCV感染者血清中的HCVNS3抗體。在臨床上適用于檢測(cè)不同HCV基因型 HCV感染者篩查工作，不易造成漏檢。
[0028] 3、截短型HCVNS3重組抗原應(yīng)用于丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒的研制
[0029] 目前，我國(guó)主要采取血液篩查來(lái)達(dá)到控制HCV蔓延的目的?，F(xiàn)用的丙型肝炎病毒 抗體檢測(cè)試劑盒主要包被抗原包括C區(qū)、NS3區(qū)、NS4區(qū)的抗原，有的也包含NS5區(qū)。但其 存在漏檢現(xiàn)象，分析其中單個(gè)NS3抗原其檢出率為76. 47% -89. 47%。相信通過(guò)加入本發(fā) 明截短型HCVNS3重組融合抗原，可W有效減少丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒漏檢現(xiàn)象，在 臨床上具有很大的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1 :純化后截短型肥VNS3重組抗原SDS-PAGE。
[0031] 其中：左泳道為樣品，右泳道為Mark。
【具體實(shí)施方式】
[0032] W下實(shí)施例用于進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明范圍。若未特別指明，實(shí) 施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0033] 實(shí)施例1 :截短型