一種狗牙根Tifway脫水素蛋白Dehydrin基因的啟動子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種狗牙根Tifway脫水素蛋白Dehydrin 基因的啟動子。
【背景技術(shù)】
[0002] 狗牙根（Cynodondactylon (Linn.)Pers.)是非常重要的暖季型草坪草，為禾本科 多年生草本植物，具有發(fā)達的根莖和匍匐莖，生長速度快、再生能力強、成坪快、耐熱、耐踐 踏、質(zhì)地纖細、色澤好等優(yōu)點，在國內(nèi)外廣泛用于運動場、游憩場、公園及固土護坡草坪等。 因此是暖季型草坪草中坪用價值最高、應(yīng)用最廣的草種之一，享有暖季型草坪草"當(dāng)家草 種"之稱，極具社會、經(jīng)濟和生態(tài)價值。狗牙根的抗旱能力十分強，年蒸散量低于400_，僅 是玉米、小麥等農(nóng)作物年需水量的四分之一左右，有些抗旱的狗牙根品種（如'Tifway'）在 年降雨量250_以下仍能良好生長，因此是建植節(jié)水草坪的優(yōu)良材料。
[0003] 脫水素（dehydrin)屬于LEA- II家族，是植物體內(nèi)的一種具有高度熱穩(wěn)定性、親水 性的LEA蛋白（late embryogensis abundant proteins)，能夠在植物胚胎發(fā)育后期以及逆 境下大量表達，廣泛存在于植物界。它能在植物處于干旱等逆境條件下表達，其在逆境下表 達的強弱與植物抗逆能力有密切聯(lián)系，在抗性植株中的表達量要高于對逆境敏感的植株。 由此顯示，它與植物的抗旱有著密切的關(guān)系。但目前，脫水素蛋白的抗旱機制尚不清楚。
[0004] 啟動子（promoter)是位于結(jié)構(gòu)基因5'-端上游的一段非編碼DNA序列，能夠被 RNA聚合酶識別、結(jié)合，并準(zhǔn)確控制轉(zhuǎn)錄（基因表達）的起始時間和表達強度，是基因轉(zhuǎn)錄調(diào) 控的中心。脫水素基因啟動子已從多種植物中克隆出來，包括：擬南芥、小麥等。但對于草 坪草植物脫水素基因啟動子的克隆、調(diào)控模式尚不清楚。目前，未有任何與狗牙根脫水素基 因啟動子序列相關(guān)的文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于填補狗牙根'Tifway' Dehydrin 基因啟動子的克隆、調(diào)控模式分析的空白，本發(fā)明還提供了一種脫水素基因啟動子的核酸 序列；本發(fā)明公開了狗牙根'Tifway' Dehydrin基因的啟動子序列在煙草葉片中啟動活性 的變化模式，為今后利用基因工程技術(shù)對Dehydrin基因表達的時空特性進行調(diào)控奠定基 礎(chǔ)，為提高狗牙根抗干旱脅迫能力與育種工作提供了理論依據(jù)，具有很大的應(yīng)用價值。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種分離的多核苷酸（啟 動子），所述多核苷酸是：
[0007] (3)核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示的多核苷酸；
[0008] (4)核苷酸序列與SEQ ID No. 4所示的多核苷酸有80%以上同源性（優(yōu)選為85% 以上同源性，更優(yōu)選為90%以上同源性），且具有SEQ ID No.4所示的多核苷酸功能的多核 苷酸。
[0009] 所述（2)中的多核苷酸具體指，SEQ ID No. 4所示的多核苷酸經(jīng)過取代、缺失或者 添加一個或幾個堿基而得到的，且具有SEQ ID No. 4所示的多核苷酸功能的多核苷酸。 [0010] 具體為，所述SEQ ID No. 4所示的多核苷酸經(jīng)過1~100個堿基的缺失、插入和/ 或取代，或者在5'-末端和/或3'-末端添加1~50個以內(nèi)堿基而得到的，且具有SEQ ID No. 4所示的多核苷酸功能的多核苷酸。
[0011] 更具體為，所述SEQ ID No. 4所示的多核苷酸中1~10個堿基被性質(zhì)相似或相近 的堿基所替換而形成的多核苷酸。
[0012] 本發(fā)明提供了具有干旱脅迫響應(yīng)功能及保護功能的狗牙根'Tifway'脫水素 Dehydrin基因啟動子，所述啟動子是由如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列組成，該啟動子活 性受干旱脅迫和植物激素 ABA誘導(dǎo)。
[0013] 進一步優(yōu)選的，所述啟動子或由SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或 者添加一個或幾個堿基且仍具有狗牙根'Tifway'脫水素 Dehydrin基因啟動子活性，受干 旱脅迫和植物激素 ABA誘導(dǎo)。
[0014] 在本發(fā)明中，術(shù)語"狗牙根'Tifway' Dehydrin基因啟動子序列"指在狗牙根 'Tifway'基因組上位于Dehydrin基因開放閱讀框（ORF) 5' -上游的具有啟動狗牙根 'Tifway'脫水素 Dehydrin基因表達的活性的核苷酸序列。
[0015] 在本發(fā)明中，"分離的DNA"、"純化的DNA"是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位 于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開， 而且已經(jīng)與在細胞中相伴隨的蛋白質(zhì)分開。
[0016] 本發(fā)明所述的啟動子是從分離的狗牙根'Tifway' DNA中通過基因組步移的方法 克隆到，連接GFP基因后，替換質(zhì)粒pBI121上的CaMV35S::⑶S基因表達框。改造后的含 有Dehydrin基因啟動子的重組質(zhì)粒命名為PBCdDHM-P: :GFP。
[0017] 本發(fā)明第二方面提供所述的多核苷酸的用途，用于作為啟動子元件，所述啟動子 元件用于在植物生物反應(yīng)器中多種蛋白或多肽的表達。
[0018] 具體的，所述植物生物反應(yīng)器可以為植物宿主細胞。
[0019] 更具體的，所述啟動子元件可用于在植物宿主細胞中指導(dǎo)多種不同來源的蛋白或 多肽的誘導(dǎo)表達。
[0020] 更具體的，在正常生長條件下所述多核苷酸（啟動子）不啟動下游基因的表達，但 在逆境和/或激素誘導(dǎo)下所述多核苷酸（啟動子）活性被激發(fā)可啟動下游基因的表達。
[0021] 進一步的，所述的多種不同來源的蛋白或多肽可以是任意分子量的蛋白質(zhì)，如各 種植物來源蛋白、各種動物或細菌來源蛋白，以及抗體等。
[0022] 本發(fā)明第三方面提供了所述多核苷酸用于植物生物反應(yīng)器的表達載體的用途。
[0023] 所述的多核苷酸可作為指導(dǎo)外源蛋白表達的啟動子用于構(gòu)建或改造植物生物反 應(yīng)器表達載體。
[0024] 所述待改造植物生物反應(yīng)器表達載體包括但不限于：pCAMBIA系列載體、pBI121 及PBI系列載體、pPZP系列載體pSN1301 (可轉(zhuǎn)化雙子葉植物植物）、pUN1301 (可轉(zhuǎn)化單子 葉植物）PRTL2、pRTL2-GFP、pRTL2-CFP、pRTL2-RFP、pRTL2-YFP 等。
[0025] 本發(fā)明第四方面提供一種植物生物反應(yīng)器表達載體，所述表達載體含有至少一個 所述的多核苷酸，作為啟動子元件，由所述的啟動子來指導(dǎo)外源蛋白的表達。具體如綠色熒 光蛋白GFP。
[0026] 優(yōu)選的，所述表達載體為將載體pBI121中的CaMV35S啟動子換為所述的多核苷酸 (啟動子）后獲得。
[0027] 更優(yōu)選的，所述表達載體的⑶S基因被替換為GFP基因。
[0028] 本發(fā)明第五方面提供一種宿主細胞，所述細胞含有所述的表達載體或基因組中整 合有外源的所述多核苷酸。
[0029] 本發(fā)明第六方面提供了一種蛋白或多肽的表達方法，包括下列步驟：
[0030] 1)采用前述表達載體構(gòu)建所述多種不同來源的蛋白或多肽的重組表達載體；
[0031] 2)將步驟1獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)染宿主，并在合適表達所述蛋白或多肽的條件 下培養(yǎng)所述宿主。
[0032] 優(yōu)選的，所述宿主可以為宿主細胞，在本發(fā)明一實施例中，所述宿主為煙草葉片。
[0033] 優(yōu)選的，所述在合適表達所述蛋白或多肽的條件下具體為采用ABA或PEG誘導(dǎo)。
[0034] 優(yōu)選的，所述步驟2)后，可從培養(yǎng)物中分離出所述蛋白或多肽，或者通過檢測儀 器檢測所述多種不同來源的蛋白或多肽。在本發(fā)明一實施例中，所述蛋白或多肽為GFP。
[0035] 通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)即可構(gòu)建所述多種不同來源的蛋白質(zhì)或多肽的重組表 達載體，例如將目的基因片段插入所述植物生物反應(yīng)器細胞表達載體的多克隆位點，并置 于本發(fā)明所述啟動子的控制之下。所述目的基因片段應(yīng)當(dāng)至少包含多種不同來源的蛋白質(zhì) 或多肽的基因的完整編碼區(qū)。
[0036] 獲得的轉(zhuǎn)有重組表達載體的宿主細胞可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達外源蛋白質(zhì)或 多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自已知的各種合適的培養(yǎng)基或培養(yǎng) 液，在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)并表達外源蛋白質(zhì)或多肽。如果需要，可利用其 物理的、化學(xué)的和其它特性或添加純化標(biāo)簽通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉淀劑處理 (鹽析方法）、離心、滲透破壁、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、吸附層析、離子交 換層析、高效液相層析（HPLC〕和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
[0037] 狗牙根'Tifway'是夠牙根中最為耐旱的品種之一。根據(jù)狗牙根'Tifway'脫水素 蛋白Dehydrin基因的cDNA序列，通過基因組步移的方法，我們克隆到與狗牙根'Tifway' 耐旱密切相關(guān)的脫水素（dehydrin)基因在基因組上的全長，包括啟動子。將dehydrin基 因的啟動子與GFP連接，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉片，檢測啟動子對干旱和ABA的響應(yīng)。 通過檢測GFP的表達結(jié)果證明，該啟動子具有啟動子的活性，并受ABA和干旱脅迫誘導(dǎo)活性 增強，由此顯示了該脫水素基因在狗牙根中響應(yīng)干旱逆境的作用。此外，本發(fā)明啟動子與其 他啟動子進行比較，適用于植物中啟動報告基因如綠色熒光蛋白GFP基因的表達，并具有 受誘導(dǎo)可調(diào)控的活性特征。
【附圖說明】
[0038] 圖1為通過基因組步移，獲得狗牙根'Tifway'基因組上報括Dehydrin基因啟動 子的Dehydrin基因全長；
[0039] 圖2為Dehydrin基因啟動子序列的生物信息學(xué)分析推測的順式調(diào)控元件序列 (用方框標(biāo)出，并注明元件名稱）；
[0040] 圖3為Dehydrin基因啟動子所在的植物反應(yīng)器表達載體PBCdDHM-P: :GFP的結(jié) 構(gòu)圖；
[0041] 圖4為對照載體PB35S: : GFP的結(jié)構(gòu)圖；
[0042] 圖5為三種植物反應(yīng)器表達載體（pBI121、PBCdDHN4-P: :GFP、PB35S: :GFP)侵染煙 草葉片后在不同誘導(dǎo)下GFP蛋白表達的變化情況，PBCdDHM-P: : GFP和PB35S: : GFP給出了 紫外熒光（左）和可見光與紫外熒光重合（右）兩種圖片；PBI121給出了可見光與紫外熒 光重合的圖片。
【具體實施方式】
[0043] 以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)