一種轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹(Heveabrasiliensis)側(cè)芽發(fā)生的方法，采用擬南芥(Arabidopsisthaliana)WUS(WUSCHEL)基因?qū)ο鹉z樹易碎胚性愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、得到轉(zhuǎn)基因材料，促進(jìn)了橡膠樹側(cè)芽發(fā)生，并形成側(cè)枝，驗證了AtWUS基因的功能，表明WUS基因?qū)ο鹉z樹側(cè)芽發(fā)生、側(cè)枝形成起著重要作用，所取得的側(cè)芽、側(cè)枝有實際應(yīng)用的潛力。本發(fā)明根據(jù)植物干細(xì)胞決定基因WUS對植物分生組織起關(guān)鍵作用、并促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)生和/或器官發(fā)生的性質(zhì)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，構(gòu)建植物表達(dá)載體，把AtWUS基因轉(zhuǎn)入橡膠樹愈傷組織，得到轉(zhuǎn)基因材料，以期促進(jìn)橡膠樹體細(xì)胞胚發(fā)生或器官發(fā)生，促進(jìn)形成再生植株或芽條的能力，從橡膠樹基因工程這一條新途徑服務(wù)于應(yīng)用和生產(chǎn)。
【專利說明】—種轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物體細(xì)胞胚發(fā)生和器官發(fā)生是極其復(fù)雜的過程。近年來的研究表明，眾多基因參與了植物體細(xì)胞胚發(fā)生的調(diào)控，其中WUS(WUSCHEL)基因是一個典型的干細(xì)胞決定基因。1996年Laux等利用EMS誘變技術(shù)鑒定了 WUS，發(fā)現(xiàn)其基因突變體影響著頂端分生組織和花分生組織的發(fā)育，由此推斷WUS在頂端分生組織和花分生組織中起著關(guān)鍵性的作用，并維持著結(jié)構(gòu)和功能的統(tǒng)一。Mayer等研究發(fā)現(xiàn)WUS編碼291個氨基酸，是同源域蛋白(homeodomainprotein)中的一個新亞型。在植物胚胎發(fā)育過程中，WUS基因在16細(xì)胞胚的中央4個細(xì)胞中表達(dá)，魚雷胚時期表達(dá)區(qū)域下移到第3層細(xì)胞，而在胚晚期以及胚后莖尖分生組織中，WUS在第3層細(xì)胞之下表達(dá)。在頂端分生組織中，干細(xì)胞組織中心表達(dá)的WUS決定其上的細(xì)胞成為干細(xì)胞，而由干細(xì)胞所表達(dá)的CLV3蛋白通過細(xì)胞間隙移動到干細(xì)胞組織中心的周邊，通過WUS/CLV3之間的反饋調(diào)節(jié)環(huán)來完成器官的啟動和干細(xì)胞的維持。Zuo等(2002)用T-DNA標(biāo)簽法篩選出pga6突變體，用一種化學(xué)誘導(dǎo)的激活標(biāo)簽系統(tǒng)鑒定了擬南芥PGA6基因的兩個等位基因，當(dāng)它們被誘導(dǎo)過度表達(dá)時，在不添加任何外部激素的情況下，所有被檢測的組織和器官高頻率地形成體細(xì)胞胚。當(dāng)誘導(dǎo)劑取消時，所有這些體細(xì)胞胚可以直接萌發(fā)成可育的成年植株。經(jīng)分析PGA6與WUSCHEL(WUS)相同。研究結(jié)果表明WUS/PGA6在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中也有關(guān)鍵作用，可能是通過促進(jìn)營養(yǎng)性向胚性的轉(zhuǎn)變、和/或保持胚性干細(xì)胞的性質(zhì)而 起作用的。
[0003]Li等(2004)用含有35S-35S-WUS的植物表達(dá)載體pBKB轉(zhuǎn)化煙草使WUS基因增強(qiáng)表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因煙草地上部分出現(xiàn)許多異常的細(xì)胞分裂和異位器官發(fā)生，形成許多突起，掃描電子顯微鏡分析表明突起由許多小而密集的細(xì)胞組成，類似分生組織細(xì)胞；部分突起能夠發(fā)育成分生組織或花芽，表明WUS基因與器官發(fā)生有關(guān)。Arroyo-Herrera等(2008)利用誘導(dǎo)型啟動子將WUS基因轉(zhuǎn)入咖啡中誘導(dǎo)WUS基因的超表達(dá)，結(jié)果體細(xì)胞胚的發(fā)生提高了 4倍。
[0004]天然橡膠是國家重要戰(zhàn)略資源，天然橡膠的主要來源是橡膠樹(Heveabrasiliensis),橡膠樹組織培養(yǎng)體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生是橡膠樹生物技術(shù)研究的重要內(nèi)容。當(dāng)前，從橡膠樹組織培養(yǎng)高頻率地得到再生植株仍然存在著困難。植物體細(xì)胞胚發(fā)生和器官發(fā)生重要基因的分子機(jī)理研究為橡膠樹組織培養(yǎng)植株再生的遺傳性狀改良提供了一條新的途徑。目前生產(chǎn)上橡膠樹種植主要是用芽接樹，用生產(chǎn)上表現(xiàn)性狀良好的母本植株的芽條作為接穗，以實生苗作為砧木進(jìn)行嫁接。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法，以解決橡膠樹組織培養(yǎng)過程中側(cè)芽發(fā)生難的問題，所取得的側(cè)芽、側(cè)枝有實際應(yīng)用于嫁接的潛力。
[0006]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法，該轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法包括:
[0007]步驟一，擬南芥AtWUS基因克隆和植物表達(dá)載體構(gòu)建，克隆擬南芥AtWUS基因，構(gòu)建 pCAMBIA2301-35s-AtWUS 植物表達(dá)載體；
[0008]步驟二，根據(jù)UidA基因瞬時表達(dá)率的多少和細(xì)胞存活率的高低，結(jié)合影響根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素，相關(guān)因素包括預(yù)培養(yǎng)時間、菌液濃度、乙酰丁香酮AS濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間和共培養(yǎng)溫度，設(shè)計實驗，確定橡膠樹連續(xù)繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件；
[0009]步驟三，以橡膠樹品種熱研88-13易碎胚性愈傷組織在含有一定Kan濃度梯度的繼代增殖培養(yǎng)基中的生長速率為指標(biāo)，測定熱研88-13易碎胚性愈傷組織對Kan敏感濃度為100~125mg/L，用于抗性愈傷組織的篩選；
[0010]步驟四，抗性愈傷組織、胚狀體和再生植株的獲得，共培養(yǎng)結(jié)束后，將熱研88-13易碎胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基中進(jìn)行抑菌處理，18天后，轉(zhuǎn)移到卡那霉素為100~125mg/L的篩選培養(yǎng) 基中，經(jīng)過4個月的篩選，長出鮮黃色的抗性愈傷組織，把經(jīng)過GUS染色為陽性的愈傷組織增殖1~2個月后誘導(dǎo)胚狀體和植株再生，結(jié)果從熱研88-13獲得了 5個抗性易碎胚性愈傷組織系，從抗性愈傷組織共誘導(dǎo)出了 843個胚狀體，21株擬轉(zhuǎn)化植株；
[0011]步驟五，組織化學(xué)檢測和分子檢測，切取14株熱研88-13抗性擬轉(zhuǎn)化植株的子葉進(jìn)行GUS染色，結(jié)果有6株呈藍(lán)色陽性，并且陽性植株具有一定表型特征，選取7株熱研88-13抗性植株和3株對照一起進(jìn)行分子檢測(PCR檢測、PCR產(chǎn)物測序分析、Southern雜交)，結(jié)果表明外源基因AtWUS已整合入橡膠樹植株基因組中，得到了轉(zhuǎn)基因植株。
[0012]進(jìn)一步，步驟一具體包括:
[0013]稱取0.5克擬南芥新鮮葉片,提取擬南芥RNA,采用Transtart II First-strandcDNAsynthesissupermix試劑盒合成cDNA，根據(jù)NCBI中登錄號為NM_127349的AtWUS基因ORF設(shè)計一對特異引物，上游引物為WF:5 ‘CGGGATCCCGATGGAGCCGCCACAGC3’，下游引物為WR:5 ‘GCGAGCTCGCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG3’，在上下游引物 5 ‘端各加一個 BamHI 和SacI酶切位點(diǎn)；
[0014]以合成的AtWUScDNA為模版，WF、WR為特異引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增AtWUS基因，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠1.0%電泳和凝膠成像系統(tǒng)的觀察，切下預(yù)期大小的目的片段，稱重，然后用Wizard DNAClean-UpKit回收純化目的片段，用pEASY-TlCloningKit對目的片段進(jìn)行TA克隆，16 °C過夜連接，得到pEASY-T I克隆載體連接反應(yīng)液；
[0015]制備大腸桿菌E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，在冰上按照100μL/管分裝，取出I管大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待溶解后加入5.0μ IpEASY-Tl克隆載體連接反應(yīng)液，以轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞；
[0016]挑選固體培養(yǎng)基上的幾個單菌落分別以WF和WR為引物，挑選的菌體為模板，2 X EasyTaqPCRSuperMix進(jìn)行PCR，對轉(zhuǎn)化重組子進(jìn)行PCR檢測，提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA，用BamHI和SacI雙酶切，以鑒定菌落PCR陽性重組子，將PCR陽性克隆的菌液送往深圳華大基因公司進(jìn)行測序檢測；[0017]中間植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-uidA的構(gòu)建:分別用HindIII2.0 μ L和EcoRI2.0μ L 雙酶切 pCAMBIA2301-MCS 和 pBI121_uidA 兩載體，分別回收 pCAMBIA2301_MCS大片段和pBI121-uidA小片段，將回收的兩片段用T4-DNAligasel.0yL連接，重組子進(jìn)行雙酶切檢測；
[0018]植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-AtWUS的構(gòu)建:用BamHI和SacI分別雙酶切 pCAMBIA2301-uidA 和 pEASY-T 1-AtffUS ；分別回收 pCAMBIA2301_uidA 大片段和pEASY-T 1-AtffUS小片段；將回收的兩片段連接，在PCR管中完成連接反應(yīng)，16 °C水浴，連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 ;對重組子進(jìn)行雙酶切檢測。
[0019]進(jìn)一步，在步驟二中，確定橡膠樹連續(xù)繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件為:預(yù)培養(yǎng)時間為O天，菌液濃度為0D_ = 0.7，AS濃度為200 μ M，侵染時間為7min，共培養(yǎng)溫度為25°C，共培養(yǎng)時間為5天。
[0020]進(jìn)一步，在步驟二中，橡膠樹愈傷組織培養(yǎng)培養(yǎng)基為經(jīng)改良的MS培養(yǎng)基(改良成份為 MgSO4.7H20500mg/L, KH2P04400mg/L, CaCl2250mg/L, MnSO4.H2035mg/L,CuSO4.5Η200.2mg/L)，再添加不同的其他培養(yǎng)基成分，pH值為5.8，在0.2MPa壓力、121°C條件下高溫高壓滅菌20min，易碎胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)、胚狀體誘導(dǎo)均采用暗培養(yǎng)，植株再生在光照條件下進(jìn)行，培養(yǎng)溫度均為25~27°C ；
[0021]進(jìn)一步，在步驟三中，在含有0，25，50，100, 125，150，200mg/L等7個不同Kan濃度的繼代增殖培養(yǎng)基中對愈傷組織進(jìn)行28天的培養(yǎng)，根據(jù)公式(W2-W1)/W1，計算愈傷組織的凈增鮮重，研究結(jié)果表明:100~125mg/L的Kan對經(jīng)過侵染的橡膠樹品種熱研88-13易碎胚性愈傷組織篩選效果較好，所以選用此濃度進(jìn)行篩選。
[0022]進(jìn)一步，在步驟五中，組織化學(xué)檢測、分子檢測(PCR檢測、PCR產(chǎn)物測序分析、Southern雜交)結(jié)果表明外源基因AtWUS已整合入橡膠樹植株基因組中，得到了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因材料子葉基部出現(xiàn)許多芽狀突起，繼而形成側(cè)芽，側(cè)芽長大形成側(cè)枝。
[0023]本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法，采用擬南芥AtWUS基因?qū)ο鹉z樹易碎胚性愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因材料，促進(jìn)了橡膠樹側(cè)芽發(fā)生，并形成側(cè)枝，驗證了 AtWUS基因的功能，表明WUS基因?qū)ο鹉z樹側(cè)芽發(fā)生、側(cè)枝形成起著重要作用，所取得的側(cè)芽、側(cè)枝有實際應(yīng)用的潛力。本發(fā)明根據(jù)植物干細(xì)胞決定基因WUS對植物分生組織起關(guān)鍵作用、并促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)生和/或器官發(fā)生的性質(zhì)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，構(gòu)建植物表達(dá)載體，把AtWUS基因轉(zhuǎn)入橡膠樹外植體，得到轉(zhuǎn)基因材料，以期促進(jìn)橡膠樹體細(xì)胞胚發(fā)生或器官發(fā)生，促進(jìn)形成再生植株或芽條的能力，從橡膠樹基因工程這一條新途徑服務(wù)于應(yīng)用和生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明實施例提供的轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法流程圖?！揪唧w實施方式】
[0025]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。[0026]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0027]如圖1所示，本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法包括以下步驟:
[0028]SlOl:擬南芥AtWUS基因克隆和植物表達(dá)載體構(gòu)建，克隆擬南芥AtWUS基因，構(gòu)建pCAMBIA2301-35s-AtffUS 植物表達(dá)載體；
[0029]S102:根據(jù)UidA基因瞬時表達(dá)率的多少和細(xì)胞存活率的高低，結(jié)合影響根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素，相關(guān)因素包括預(yù)培養(yǎng)時間、菌液濃度、乙酰丁香酮AS濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間和共培養(yǎng)溫度，設(shè)計實驗，確定橡膠樹連續(xù)繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件；
[0030]S103:以橡膠樹品種熱研88-13易碎胚性愈傷組織在含有一定Kan濃度梯度的繼代增殖培養(yǎng)基中的生長速率為指標(biāo)，測定熱研88-13易碎胚性愈傷組織對Kan敏感濃度為100~125mg/L，用于抗性愈傷組織的篩選；
[0031]S104:抗性愈傷組織、胚狀體和再生植株的獲得，共培養(yǎng)結(jié)束后，將熱研88-13易碎胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基中進(jìn)行抑菌處理，18天后，轉(zhuǎn)移到卡那霉素為100~125mg/L的篩選培養(yǎng)基中，經(jīng)過4個月的篩選，長出鮮黃色的抗性愈傷組織，把經(jīng)過GUS染色為陽性(藍(lán)色)的愈傷組織增殖I~2個月后誘導(dǎo)胚狀體和植株再生，結(jié)果從熱研88-13獲得了 5個抗性易碎胚性愈傷組織系，從抗性愈傷組織共誘導(dǎo)出了 843個胚狀體，21株擬轉(zhuǎn)化植株；
[0032]S105:組織化學(xué) 檢測和分子檢測，切取14株熱研88_13抗性擬轉(zhuǎn)化植株的子葉進(jìn)行GUS染色，結(jié)果有6株呈藍(lán)色陽性，并且陽性植株具有一定表型特征，選取7株熱研88-13抗性植株和3株對照一起進(jìn)行分子檢測(PCR檢測、PCR產(chǎn)物測序分析、Southern雜交)，分子檢測結(jié)果表明外源基因AtWUS已整合入橡膠樹植株基因組中，得到了轉(zhuǎn)基因植株。
[0033]在步驟S102中，確定橡膠樹連續(xù)繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件為:預(yù)培養(yǎng)時間為O天，菌液濃度為0D_ = 0.7，AS濃度為200 μ Μ，侵染時間為7min，共培養(yǎng)溫度為25°C，共培養(yǎng)時間為5天。
[0034]在步驟S105中，組織化學(xué)檢測、分子檢測(PCR檢測、PCR產(chǎn)物測序分析、Southern雜交)結(jié)果表明得到了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因材料子葉基部出現(xiàn)許多芽狀突起，繼而形成側(cè)芽，側(cè)芽長大形成側(cè)枝。
[0035]本發(fā)明的具體步驟為:
[0036]步驟一，擬南芥AtWUS基因克隆和植物表達(dá)載體構(gòu)建，克隆擬南芥AtWUS基因，構(gòu)建 pCAMBIA2301-35s-AtWUS 植物表達(dá)載體；
[0037]稱取0.5克擬南芥新鮮葉片,提取擬南芥RNA,采用Transtart II First-strandcDNAsynthesissupermix試劑盒合成cDNA，根據(jù)NCBI中登錄號為NM_127349的AtWUS基因ORF設(shè)計一對特異引物，上游引物為WF:5 ‘CGGGATCCCGATGGAGCCGCCACAGC3’，下游引物為WR:5 ‘GCGAGCTCGCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG3’，在上下游引物 5 ‘端各加一個 BamHI 和SacI酶切位點(diǎn)；
[0038]以合成的AtWUScDNA為模版，WF、WR為特異引物，用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增AtWUS基因，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠(1.0% )電泳和凝膠成像系統(tǒng)的觀察，切下預(yù)期大小的目的片段，稱重，然后用WizardDNAClean-UpKit回收純化目的片段，用pEASY-T ICI on i ngK i t對目的片段進(jìn)行TA克隆，16 °C過夜連接，得到pEASY-T I克隆載體連接反應(yīng)液；
[0039]制備大腸桿菌伍.001丨)廁109感受態(tài)細(xì)胞，在冰上按照10(^17管分裝，取出1管大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待溶解后加入5.0μ IpEASY-Tl克隆載體連接反應(yīng)液，以轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞；
[0040]挑選固體培養(yǎng)基上的幾個單菌落分別以WF和WR為引物，挑選的菌體為模板，2 X EasyTaqPCRSuperMix進(jìn)行PCR，對轉(zhuǎn)化重組子進(jìn)行PCR檢測，提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA，用BamHI和SacI雙酶切，以鑒定菌落PCR陽性重組子，將PCR陽性克隆的菌液送往深圳華大基因公司進(jìn)行測序檢測；
[0041]中間植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-uidA的構(gòu)建:分別用HindIII (2.0yL)和 EcoRI (2.0 μ L)雙酶切 pCAMBIA2301-MCS 和 pBI121-uidA 兩載體，分別回收pCAMBIA2301-MCS大片段和pBI121_uidA小片段，將回收的兩片段用T4-DNAligase (l.0yL)連接，重組子進(jìn)行雙酶切檢測；
[0042]植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-AtWUS的構(gòu)建:用BamHI和SacI分別雙酶切 pCAMBIA2301-uidA 和 pEASY-T 1-AtffUS ；分別回收 pCAMBIA2301_uidA 大片段和pEASY-T 1-AtffUS小片段；將回收的兩片段連接，在PCR管中完成連接反應(yīng)，16 °C水浴，連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 ;對重組子進(jìn)行雙酶切檢測；
[0043]步驟二，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的橡膠樹易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素的研究; [0044]用橡膠樹品種熱研88-13易碎胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體材料，侵染所用的根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105，植物表達(dá)載體為pCAMBIA2301-AtWUS，載體上包含了由CaMV355啟動子驅(qū)動的β -葡糖醛酸酶基因UidA(用于組織化學(xué)染色鑒定)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptll (用于卡那霉素抗性篩選)；
[0045]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化橡膠樹易碎胚性愈傷組織各培養(yǎng)基成分及根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基見表1 ;
[0046]表1:橡膠樹組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化中使用的培養(yǎng)基及成分
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法，其特征在于，該轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法包括: 步驟一，擬南芥AtWUS基因克隆和植物表達(dá)載體構(gòu)建，克隆擬南芥AtWUS基因，構(gòu)建pCAMBIA2301-35s-AtffUS 植物表達(dá)載體； 步驟二,根據(jù)β -葡糖醒酸酶(β-glucuronidase,⑶S)基因(uidA)瞬時表達(dá)率的多少和細(xì)胞存活率的高低，結(jié)合影響根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素，相關(guān)因素包括預(yù)培養(yǎng)時間、菌液濃度、乙酰丁香酮AS濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間和共培養(yǎng)溫度，設(shè)計實驗，確定橡膠樹連續(xù)繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件； 步驟三，以橡膠樹品種熱研88-13易碎胚性愈傷組織在含有Kan濃度梯度的繼代增殖培養(yǎng)基中的生長速率為指標(biāo)，測定熱研88-13易碎胚性愈傷組織對Kan敏感濃度為100~125mg/L，用于抗性愈傷組織的篩選； 步驟四，抗性愈傷組織、胚狀體和再生植株的獲得，共培養(yǎng)結(jié)束后，將熱研88-13易碎胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基中進(jìn)行抑菌處理，18天后，轉(zhuǎn)移到卡那霉素為100~125mg/L的篩選培養(yǎng)基中，經(jīng)過4個月的篩選，長出鮮黃色的抗性愈傷組織，把經(jīng)過GUS染色為陽性的愈傷組織增殖I~2個月后誘導(dǎo)胚狀體和植株再生，結(jié)果從熱研88-13獲得了 5個抗性易碎胚性愈傷組織系，從抗性愈傷組織共誘導(dǎo)出了 843個胚狀體，21株擬轉(zhuǎn)化植株； 步驟五，組織化學(xué)檢測和分子檢測，切取14株熱研88-13抗性擬轉(zhuǎn)化植株的子葉進(jìn)行GUS染色，結(jié)果有6株呈藍(lán)色陽性，并且陽性植株具有一定表型特征，選取7株熱研88-13抗性植株和3株對照一起進(jìn)行分子檢測。
2.如權(quán)利要求1所述 的轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法，其特征在于，步驟一具體包括: 稱取0.5克擬南芥新鮮葉片,提取擬南芥RNA,采用Transtart II First-strandcDNAsynthesissupermix試劑盒合成cDNA，根據(jù)NCBI中登錄號為NM_127349的AtWUS基因ORF設(shè)計一對特異引物，上游引物為WF: 5 ‘CGGGATCCCGATGGAGCCGCCACAGC3’，下游引物為WR:5 ‘GCGAGCTCGCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG3’，在上下游引物 5 ‘端各加一個 BamHI 和 SacI 酶切位點(diǎn)； 以合成的AtWUScDNA為模版，WF、WR為特異引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增AtWUS基因，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠1.0%電泳和凝膠成像系統(tǒng)的觀察，切下預(yù)期大小的目的片段，稱重，然后用Wizard DNAClean-UpKit回收純化目的片段，用pEASY-TlCloningKit對目的片段進(jìn)行TA克隆，16°C過夜連接，得到pEASY-Tl克隆載體連接反應(yīng)液； 制備大腸桿菌E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，在冰上按照100 μ L/管分裝，取出I管大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待溶解后加入5.0μ IpEASY-Tl克隆載體連接反應(yīng)液，以轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞； 挑選固體培養(yǎng)基上的幾個單菌落分別以WF和WR為引物，挑選的菌體為模板，2 X EasyTaqPCRSuperMix進(jìn)行PCR，對轉(zhuǎn)化重組子進(jìn)行PCR檢測，提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA，用BamHI和SacI雙酶切，以鑒定菌落PCR陽性重組子，將PCR陽性克隆的菌液送往深圳華大基因公司進(jìn)行測序檢測； 中間植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-uidA的構(gòu)建:分別用HindIII2.0μ L和EcoRI2.0μ L雙酶切pCAMBIA2301-MCS和pBI121_uidA兩載體，分別回收pCAMBIA2301-MCS大片段和pBI121-uidA小片段，將回收的兩片段用T4-DNAligasel.0yL連接，重組子進(jìn)行雙酶切檢測； 植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-AtWUS的構(gòu)建:用BamHI和SacI分別雙酶切pCAMBIA2301-uidA 和 pEASY-T1-AtWUS ；分別回收 pCAMBIA2301_uidA 大片段和pEASY-T1-AtffUS小片段；將回收的兩片段連接，在PCR管中完成連接反應(yīng)，16°C水浴，連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 ;對重組子進(jìn)行雙酶切檢測。
3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法，其特征在于，在步驟二中，確定橡膠樹連續(xù)繼代易碎胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)化條件為:預(yù)培養(yǎng)時間為O天，菌液濃度為OD_ = 0.7，AS濃度為200 μ Μ，侵染時間為7min，共培養(yǎng)溫度為25°C，共培養(yǎng)時間為5天。
4.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法，其特征在于，在步驟二中，橡膠樹愈傷組織培養(yǎng)培養(yǎng)基為經(jīng)改良的MS培養(yǎng)基，改良成份為MgSO4.7H20500mg/L, KH2P04400mg/L, CaCl2250mg/L, MnSO4.H2035mg/L, CuSO4.5H200.2mg/L，再添加不同的其他培養(yǎng)基成分，pH值為5.8，在0.2MPa壓力、121°C條件下高溫高壓滅菌20min，易碎胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)、胚狀體誘導(dǎo)均采用暗培養(yǎng)，植株再生在光照條件下進(jìn)行，培養(yǎng)溫度均為25~27V。
5.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法，其特征在于，在步驟三中，組織化學(xué)檢測、分子檢測結(jié)果表明外源基因AtWUS已整合入橡膠樹植株基因組中，得到了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因材料子葉基部出現(xiàn)許多芽狀突起，繼而形成側(cè)芽，側(cè)芽長大形成側(cè)枝。
6.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)AtWUS基因促進(jìn)橡膠樹側(cè)芽發(fā)生的方法，其特征在于，在步驟三中，在含有0，25，50, 100, 125，150, 200mg/L7個不同Kan濃度的繼代增殖培養(yǎng)基中對愈傷組織進(jìn)行28天的培養(yǎng)，根據(jù)公式(W2-W1)/W1，計算愈傷組織的凈增鮮重，結(jié)果表明:100~125mg/L的Kan對經(jīng)過侵染的橡膠樹品種熱研88-13易碎胚性愈傷組織篩選效果較好，所以選用此濃度進(jìn)行篩選。
【文檔編號】C12N15/82GK104031936SQ201410267627
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】李哲, 畢政鴻, 戴雪梅, 黃華孫, 林位夫, 周建南 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所