T細(xì)胞表位鑒定及其重組表位疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及一種金黃色葡萄球菌TRAP蛋白的 CD4+T細(xì)胞表位鑒定及其重組表位疫苗，能夠引起小鼠的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫 應(yīng)答，并對(duì)金黃色葡萄球菌感染具有良好的免疫預(yù)防作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococ州Saureus,S.aureus)是一種常見的革蘭氏陽性 條件致病菌，可引起人的毒素性疾病、化脈性疾病、肺炎、偽膜性腸炎、屯、包炎等，嚴(yán)重者可 致敗血癥、脈毒癥等全身性感染。S.aureus也可引起動(dòng)物感染，尤其是奶牛乳房炎的重要病 原菌。目前，全世界每年有幾百萬S.aureus感染的報(bào)道，對(duì)于S.aureus感染的治療主要依 賴抗生素。雖然過去抗生素在治療和控制S.aureus感染方面發(fā)揮了重要作用，但由于抗生 素的普遍和大量使用導(dǎo)致了耐藥菌株出現(xiàn)，目前臨床上耐藥S.aureus引發(fā)的感染已成為 難W解決的棘手問題。因此，尋找一種抗S.aureus感染的新方法至關(guān)重要，而使用免疫制 劑-疫苗是防治S.aureus感染一種理想途徑。目前為止，所研究的S.aureus疫苗保護(hù)效 果均不夠理想，其主要原因之一是在過去的疫苗研究中只考慮了體液免疫應(yīng)答作用而忽視 了WCD4叮細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，特別是化1和化17細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。
[0003]TRAP(targetofRNAIIIactivatingprotein)是一種葡萄球菌中高度保守的蛋 白，由167個(gè)氨基酸組成，在DNA抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用。免疫研究表明，TRAP蛋白免 疫小鼠和牛均獲得良好的保護(hù)效果，由此說明TRAP是一個(gè)良好的S.aureus疫苗的候選抗 原。但TRAP蛋白的CD4+T細(xì)胞表位在誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答中的作用及其制備的表位疫苗 誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用未不清楚。因此，我們對(duì)S.aureusTRAP蛋白CD4+T細(xì)胞表位進(jìn)行了 鑒定，并將其與TRAP蛋白的B細(xì)胞表位制備成重組表位疫苗，我們的研究表明CD4+T細(xì)胞 表位和B細(xì)胞表位能夠在小鼠體內(nèi)引起特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，有助于抵抗 S.aureus的感染，有利于進(jìn)一步開發(fā)S.aureus疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一目的是提供一種金黃色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T細(xì)胞表位。 陽0化]本發(fā)明的第二目的是提供另一種金黃色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4叮細(xì)胞表位。
[0006] 本發(fā)明的第Ξ目的是提供上述兩種金黃色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T細(xì)胞表位 與TRAP蛋白的B細(xì)胞表位串聯(lián)而成的重組表位疫苗PT。
[0007] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一、一種金黃色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4叮細(xì)胞表位，其氨基酸序列如SEQN0:1所 /J、- 〇
[0009] 上述的金黃色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4叮細(xì)胞表位在制備治療金黃色葡萄球菌 感染的疫苗中的應(yīng)用。
[0010] 二、一種金黃色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4叮細(xì)胞表位，其氨基酸序列如SEQNO: 2所 /J、- 〇
[0011] 上述的金黃色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4叮細(xì)胞表位在制備治療金黃色葡萄球菌 感染的疫苗中的應(yīng)用。
[0012] 首先利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)S.aureusTRAP的CD4叮細(xì)胞表位，通過分析表位 預(yù)測(cè)結(jié)果和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)確定符合條件的5條候選表位多膚序列，并送公司合成表位多 膚。
[0013] 本發(fā)明所述的抗原表位沈QNO: 1 (20NPT冊(cè)LFQFSASDTSVI陽E39)和沈QNO: 2 (94RNF GGFKSY化LRPAKGTTY113)產(chǎn)生了較強(qiáng)的TRAP抗原特異性的CD4叮細(xì)胞增值，同時(shí)分泌了高水 平的細(xì)胞因子IFN- 丫和IL-17,IL-4的分泌水平一般，暗示篩選的兩個(gè)TRAP優(yōu)勢(shì)表位屬于 化1和化17型，且SEQNO: 2特異性CD4叮細(xì)胞分泌的IL-17高于TRAP全蛋白，暗示其可能 是特異性化17型細(xì)胞表位。
[0014] Ξ、一種重組表位疫苗PT，由上述的兩種TRAP蛋白的CD4叮細(xì)胞表位和TRAP蛋白 的B細(xì)胞表位串聯(lián)而成，每個(gè)表位的C末端用GPGPG間隔序列隔開。
[0015] 上述的重組表位疫苗PT產(chǎn)生了特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，且對(duì)于 S.aureus感染的保護(hù)效果好于TRAP全蛋白，可用于S.aureus的抗感染免疫，用于制備治療 金黃色葡萄球菌感染的疫苗。
[0016] 采用上述技術(shù)方案的積極效果：本發(fā)明的S.aureusTRAP蛋白的CD4+T細(xì)胞抗原 表位可產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，而CD4+T細(xì)胞應(yīng)答在S.aureus感染的機(jī)體免疫炎性損 傷和抗感染免疫保護(hù)中發(fā)揮重要作用，因此可用于制備治療金黃色葡萄球菌感染的疫苗； 本發(fā)明構(gòu)建的含有S.aureusTRAP蛋白的CD4叮細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的重組表位疫苗PT 能夠在小鼠體內(nèi)引起特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，對(duì)S.aureus感染的小鼠具有 良好的保護(hù)效果，有利于S.aureus疫苗的進(jìn)一步開發(fā)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為TRAP氨基酸序列的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。 陽0化]圖2為TRAP抗原表位多膚體外刺激小鼠特異性CD4叮細(xì)胞的增值結(jié)果。A:BALB/C，B:巧7BL/6。
[0019] 圖3為TRAP抗原表位多膚體外刺激小鼠特異性CD4叮細(xì)胞的細(xì)胞因子 IFN-丫，比-4,比-17 的檢測(cè)結(jié)果。A:BALB/c，B:C57化/6。
[0020] 圖4為TRAP抗原表位SEQNO: 1和SEQNO: 2體內(nèi)刺激小鼠特異性CD4叮細(xì)胞的 增值結(jié)果。A:BALB/c，B:C57化/6。
[0021] 圖5為TRAP抗原表位SEQNO: 1和SEQNO: 2體內(nèi)刺激小鼠特異性CD4叮細(xì)胞的 細(xì)胞因子IFN-丫，比-4,比-17的檢測(cè)結(jié)果。A:BALB/c，B:C57化/6。
[0022] 圖6為表位重組蛋白PT的構(gòu)建和表達(dá)。A:表位重組蛋白PT的構(gòu)建示意圖和氨基 酸序列；B:重組蛋白純化后的SDS-PAGE分析。Μ:蛋白質(zhì)分子量Marker;1:表位重組蛋白 PT的純化結(jié)果；2 :重組蛋白TRAP的純化結(jié)果；3 :PET32a蛋白的純化結(jié)果。
[0023] 圖7為重組表位疫苗PT免疫小鼠的特異性淋己細(xì)胞的增值結(jié)果。A:BALB/c， B:C57化/6。
[0024]圖8為重組表位疫苗ΡΤ免疫小鼠的特異性淋己細(xì)胞的細(xì)胞因子 IFN-丫，比-4,比-17 的檢測(cè)結(jié)果。A:BALB/c，B:C57化/6。 陽0巧]圖9為重組表位疫苗PT免疫小鼠血清的IgG水平。A:BALB/c;B:C57化/6。 陽0%] 圖10為重組表位疫苗PT的免疫保護(hù)效果。A:BALB/c;B:C57化/6。
【具體實(shí)施方式】
[0027] W下通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，運(yùn)些實(shí)施例僅用于例證的 目的，絕不限制本發(fā)明的范圍。
[0028] 本發(fā)明中生物材料的來源：
[0029] 1、TRAP蛋白的B細(xì)胞表位：公開在ANovelPeptideScreenedbyPhageDisplay CanMimicTRAPAntigenEpitopeagainstStaphylococcusaureusInfections,Guang Yang,YapingGao,JieDong,ChuanLiu,YanningXue,MingFan,BeifenShenand NingshengShao,TheJournalofBiologicalChemistry,Vol280,No29,IssueofJuly 22,pp27431-27435,2005。
[0030] 2、候選表位多膚為委托上海楚膚生物科技有限公司合成。 陽0川實(shí)施例1S.aureusTRAP的CD4叮細(xì)胞表位的預(yù)測(cè) 陽0巧 CD4叮細(xì)胞表位只能與Μ肥II類分子結(jié)合，并共同被T細(xì)胞抗原受體特異性識(shí)別， 從而誘導(dǎo)相應(yīng)效應(yīng)Τ細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。根據(jù)CD4+T細(xì)胞表位與血1CII類分子的結(jié)合能力， 基于矩陣的Τ細(xì)胞表位預(yù)測(cè)算法（