來源于橡膠樹具有抗氧化功能的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于橡膠樹具有抗氧化功能的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的具有抗氧化功能的蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗氧化活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。實驗證明，本發(fā)明所提供的具有抗氧化功能的蛋白的編碼基因HbAOP在橡膠樹葉片中表達(dá)量最高，該基因的表達(dá)受過氧化氫、干旱、低溫、氯化鈉的調(diào)控。將HbAOP基因在大腸桿菌中原核表達(dá)能提高大腸桿菌的抗氧化活性，證明HbAOP具有抗氧化作用。可將HbAOP轉(zhuǎn)入植物或微生物中，提高其對活性氧的清除能力，從而提高抗氧化脅迫的能力。
【專利說明】來源于橡膠樹具有抗氧化功能的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種來源于橡膠樹具有抗氧化功能的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]正常生理情況下,植物體內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species, R0S)的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。干旱、低溫、高溫、鹽脅迫和重金屬等逆境條件會破壞植物細(xì)胞內(nèi)ROS的代謝平衡，造成大量ROS在體內(nèi)積累。過量積累的ROS不僅可直接攻擊膜系統(tǒng)中不飽和脂肪酸，導(dǎo)致膜脂過氧化及其產(chǎn)物丙二醛(MDA)的產(chǎn)生，進(jìn)而破壞了膜結(jié)構(gòu)使膜的流動性下降，還可以造成喊基突變、DNA鏈 的斷裂和蛋白質(zhì)的損傷。最終引起一系列生理生化功能的改變。如ROS中的氧自由基(OFR)可以通過與膜上的酶和受體共價結(jié)合以及與膜脂質(zhì)或蛋白上的游離氨基發(fā)生交聯(lián)，從而改變了膜成分的活性和結(jié)構(gòu)，也可使膜微粘度和膜脆性增加，造成細(xì)胞活性物質(zhì)外溢，進(jìn)一步擴(kuò)大了自由基的損傷作用?？傊?dāng)植物體內(nèi)大量積累ROS時，會嚴(yán)重影響植物的正常生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致植物死亡。
[0003]植物體在長期進(jìn)化過程中形成了酶促和非酶促兩大類抗氧化系統(tǒng)，它們在植物體內(nèi)能有效清除R0S，減輕或避免ROS對植物造成傷害，從而使植物表現(xiàn)出對氧化脅迫的抗性。酶促抗氧化系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, S0D)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)等。非酶促抗氧化系統(tǒng)主要有抗壞血酸、甘露醇、類黃酮和α-生育酚等。雖然，當(dāng)植物體受到氧化脅迫時會啟動自身的抗氧化系統(tǒng)，但是隨著污染及紫外輻射的日益嚴(yán)重化，增強(qiáng)植物的抗氧化能力顯得尤為重要，這勢必會對提高作物及植物來源的工業(yè)原料的產(chǎn)量具有很大的作用。
[0004]天然橡膠(順式-1，4-聚異戊二烯，橡膠烴)是四大重要工業(yè)原料之一，是事關(guān)國計民生和國防安全的重要戰(zhàn)略物資。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國對天然橡膠的供需矛盾日益突出。已有研究表明橡膠樹的排膠時間和死皮是天然橡膠產(chǎn)量的限制因子。ROS能破壞橡膠樹膠乳中黃色體膜，致使膠乳原位凝固，從而引起乳管堵塞，停止排膠，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致橡膠樹死皮發(fā)生。因此，提高橡膠樹抗氧化能力及對氧化脅迫的適應(yīng)能力有助于提高橡膠樹膠乳產(chǎn)量。目前在橡膠樹中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超氧化物歧化酶(SOD)等基因，若能在橡膠樹中繼續(xù)發(fā)現(xiàn)新的具有較強(qiáng)抗氧化能力的基因，對于獲得抗氧化能力增強(qiáng)的橡膠樹新品種，進(jìn)而提高橡膠產(chǎn)量將具有重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種來源于橡膠樹具有抗氧化功能的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明所提供的具有抗氧化功能的蛋白，名稱為HbAOP，來源于大戟科橡膠樹屬巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)品種熱研7-33-97,是如下(a)或(b):
[0007](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；[0008](b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗氧化活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
[0009]為了便于HbAOP蛋白的純化，可在由序列表中序列I的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。
[0010]表:標(biāo)簽的序列
[0011]
【權(quán)利要求】
1.蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗氧化活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子是編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因；所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子: 1)編碼序列為序列表中序列2的第37-1710位所示的DNA分子； 2)序列為序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 4)與I)-3)中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達(dá)載體或重組克隆載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體中啟動所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為T7啟動子 。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求2或3所述的核酸分子，或權(quán)利要求4或5或6所述的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌在如下al) _a4)任一中的應(yīng)用: al)調(diào)控生物的抗氧化能力； a2)選育抗氧化能力提高的生物品種； a3)調(diào)控生物的抗逆性； a4)選育抗逆性提聞的生物品種； 所述抗逆性為如下中的任一種:抗旱性、抗低溫、抗鹽性。
8.一種培育抗氧化能力提高的轉(zhuǎn)基因生物的方法，包括將編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因?qū)肽康纳镏械玫睫D(zhuǎn)基因生物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因生物與所述目的生物相比，抗氧化能力提聞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用或權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述抗氧化體現(xiàn)為對過氧化氫的抗性。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述生物為微生物； 所述微生物具體為大腸桿菌。
【文檔編號】A01H5/00GK103739687SQ201310716561
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】鄧治, 聶智毅, 李德軍 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所