一組具協(xié)同效應(yīng)的抗菌肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物應(yīng)用領(lǐng)域，尤其設(shè)及抗菌膚在抗菌劑、防腐劑、飼料添加劑中的應(yīng) 用W及抗菌膚與抗生素形成組合物后在抗菌藥物、飼料添加劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；图s化的發(fā)展，抗生素作為主要的飼料添加劑與治療藥 物，得到了越來越廣泛的應(yīng)用。然而，濫用抗生素造成產(chǎn)品及環(huán)境中抗生素的殘留和蓄積， 嚴重的影響了我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。國家為此陸續(xù)出臺法規(guī)，限制抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用 范圍與用量。尋找減少或取代抗生素使用的新型綠色飼料添加劑具有很大的實用意義。
[0003] 抗生素的過量應(yīng)用，導(dǎo)致養(yǎng)殖業(yè)中出現(xiàn)的耐藥菌與泛耐藥菌的種類與數(shù)量不斷提 高。臨床分離的耐藥菌如MRSA也與抗生素濫用有關(guān)。我們需要找到一種能有效殺死臨床 常見的耐藥細菌，且不易誘導(dǎo)細菌耐藥的方法。
[0004] 抗菌膚（antimicrobialpeptides)由20-60個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量在 2000-7000左右，是古老而廣泛存在于生物界中的一種活性多膚，是純天然的抗菌活性成 分。1972年，Boman在北美天蠶的血淋己中發(fā)現(xiàn)了具有抗菌作用的多膚，運類抗菌膚被命 名為天蠶素（Cecropins)。后來，人們發(fā)現(xiàn)抗菌膚是生物非特異性免疫的重要組成部分， 細菌、真菌、原蟲、植物、動物、乃至人類都能產(chǎn)生抗菌膚。依據(jù)不同的蛋白質(zhì)序列組成和 結(jié)構(gòu)特點，抗菌膚可分為：α-螺旋型（a-helix)，β-折疊型（β-sheet)，富含脯氨酸類 (pro-rich),環(huán)化類（loop)。已發(fā)現(xiàn)的抗菌膚作用機理包含桶板模型、環(huán)形孔模型，地毯模 型等。抗菌膚的抗菌作用機制與傳統(tǒng)抗生素不同。傳統(tǒng)抗生素針對的是病原體的受體，作 用祀點單一，抗生素祀點的改變會令抗生素失效。病原微生物的基因突變常能改變抗生素 的祀點，產(chǎn)生耐藥菌株?？咕w是一類多祀點的藥物，目前發(fā)現(xiàn)的作用機理有破壞細胞膜、 抑制生物大分子的合成、抑制胞內(nèi)酶活性等，病原微生物難W獲得抗藥性，因為需要改變的 祀點太多了?？咕w多祀點的作用機制，極大減少耐藥菌株產(chǎn)生?？咕w抗菌譜廣，具有抗 多重耐藥菌，真菌的作用，部分抗菌膚還具有抗病毒和腫瘤細胞的功能。 陽0化]雖然人們對抗菌膚進行了廣泛與深入的研究，目前仍沒有任何一類抗菌膚藥物上 市銷售。其原因在于，現(xiàn)在所發(fā)現(xiàn)的抗菌膚雖然廣譜性很好，但活性并不夠強。常見的抗生 素，其活性一般比抗菌膚高一個數(shù)量級。運就大大限制了抗菌膚的實際應(yīng)用，我們需要提高 抗菌膚的活性，拓展其應(yīng)用范圍，促使抗菌膚盡早實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
[0006] 申請人在前期研究中，設(shè)計得到了一組具有高抗菌活性，低毒性的抗菌膚，其中含 脯氨酸較鏈結(jié)構(gòu)與α-螺旋序列，能夠結(jié)合細菌胞內(nèi)大分子，起到快速殺菌的作用。
[0007] 為了進一步擴大抗菌膚的應(yīng)用范圍，本發(fā)明在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)選得 到兩個新抗菌膚。我們的新抗菌膚抗菌作用強，復(fù)合抗生素氨節(jié)西林、卡那霉素、環(huán)丙沙星 可起到協(xié)同增效作用，降低抗生素的使用量。對抗菌膚的殺菌曲線與紙片法實驗證實了上 述多膚的抗菌活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一組兼具高抗菌活性與高協(xié)同效應(yīng)的抗菌膚，作為飼料添加劑、化妝 品防腐成分、抗菌藥物的應(yīng)用W及上述抗菌膚與抗生素形成組合物后在抗菌藥物與飼料添 加劑中應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述的抗菌膚，兼具高協(xié)同效應(yīng)與高效廣譜抑 菌作用；本發(fā)明所述的抗菌膚高效、低毒；與抗生素可形成更加高效的抗菌組合物，令抗生 素用量減少4-128倍。顯著降低抗生素用量，減輕現(xiàn)有抗菌藥物的濫用而導(dǎo)致畜牧業(yè)生產(chǎn) 及臨床上耐藥菌不斷增加的狀況。
[0009] 本發(fā)明所述的抗菌膚，可在抗菌劑、防腐劑、飼料添加劑領(lǐng)域拓寬抗菌膚類物質(zhì)的 用途。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0011] 抗菌膚N33或N35作為抗菌藥物的應(yīng)用；
[0012] 抗菌膚N33或N35作為飼料添加劑的應(yīng)用；
[0013] 抗菌膚N33或N35,聯(lián)合抗生素作為抗菌藥物的應(yīng)用；
[0014] 抗菌膚N33或N35,聯(lián)合抗生素作為飼料添加劑的應(yīng)用；
[0015] 抗菌膚N33或N35,聯(lián)合抗生素作為抗MRSA抗菌藥物的應(yīng)用。
[0016] 進一步地，抗菌膚N33與抗生素聯(lián)合的比例為1:8-8:1，抗菌膚N35與抗生素聯(lián)合 的比例為1:8-8:1時，能得到較好的協(xié)同效應(yīng)。大大增加抗生素的抗菌活力，使抗生素的用 量降低4-128倍。
[0017] 進一步地，所述抗生素包括氨節(jié)西林、卡那霉素、頭抱曲松鋼、環(huán)丙沙星、下胺卡那 霉素。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)選得到的兩個抗菌膚序列抗菌膚N33與抗 菌膚N35,單獨使用對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均有效，能夠?qū)ΤＲ姷闹虏⌒源竽c桿菌，如 078, 0157,雞沙口氏菌，有強殺菌效果；對MRSA也有明確的效果。
【附圖說明】
[0020] 圖1為抗菌膚N33的質(zhì)譜圖；
[0021] 圖2為抗菌膚N35的質(zhì)譜圖；
[0022] 圖3為抗菌膚、抗生素及抗菌膚-抗生素組合物對大腸桿菌的殺菌曲線；
[0023] 圖4為抗菌膚、抗生素及抗菌膚-抗生素組合物對金黃色葡萄球菌的殺菌曲線。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而 非W任何形式對本發(fā)明進行限制。 陽02引實施例1 : 陽0%] 本實施例中共有2個抗菌膚，如下所示：
[0027] (1)N33 即沈QIDN33 :
[0028] Lys了巧LysLeu陸eLysLysValValLysPro化 1TyrlieProArgProArg ValHisArgLeuLeuArgLys; 陽02W 即KWKLFKKVVKPVYIPRPRVHRLL服；
[0030] 分子量：3186. 3。
[0031] 似N35 即沈QIDN35 : 陽0；32] Arg lie了巧Val lie ??ρ Arg Lys Val Val Lys Gly lie Gly Val Gly Lys T虹lie His Arg Leu Val Thr Gly；
[0033] 即RIWVIWRKVVKGIGVGKTIHRLVTG;
[0034] 分子量：2872. 6。 陽03引 實施例2 :
[0036] 將實施例1所述的2條抗菌膚用多膚合成儀進行固相有機合成，合成方向從C端 到N端逐一進行，采用Fmoc保護合成法，具體步驟如下：
[0037] 稱取Fmoc樹脂0.Immol，裝柱，再按照抗菌膚的氨基酸序列，從C端至N端，將氨 基酸置于多膚合成儀中。于室溫20°C，首先用20%六氨化晚/二甲基甲酯胺（DM巧溶液將 Fmoc脫保護，再用DMF溶液進行清洗。將Fmoc的游離氨基酸溶解，活化并上柱循環(huán)偶合反 應(yīng)，DMF溶液清洗。重復(fù)活化、縮合，脫保護、洗涂運一系列過程直至多膚合成結(jié)束。 陽03引取下反應(yīng)后的樹脂，加裂解液（88%Ξ氣乙酸，5%苯酪，5%水，2%異丙基硅烷）， 室溫反應(yīng)化，過濾，收集濾液，加入乙酸沉淀，4000轉(zhuǎn)/10分鐘離屯、收集沉淀，干燥。
[0039] 抗菌膚的純化： W40] 將干燥后的抗菌膚，加入0. 1%S氣乙酸溶解，反向柱分離（洗脫液為20% -80% 乙臘的0. 1 氣乙酸，梯度洗脫），收集洗脫峰。經(jīng)鑒定，合成多膚純度達90%。
[0041] 質(zhì)譜鑒定：將上述得到的多膚經(jīng)過電噴霧質(zhì)譜法分析，質(zhì)譜圖（圖1、圖2)中顯示 的分子量與實施例1中的理論分子量一致。 W42] 實施例3 :
[0043] 抗菌膚的殺菌活性檢測：
[0044] W下實施例中所用的菌種大腸桿菌CMCC44102,金黃色葡萄球菌CMCC26003來源 于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中屯、；銅綠假單胞菌ATCC27853來源于廣州市微生物菌 種保藏管理中屯、；大腸桿菌078,大腸桿菌0157雞沙口氏菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)ATCC43300來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、。采用化SI介紹的微量肉湯 法，W抗生素氨節(jié)西林，阿米卡星，氯霉素，卡那霉素為對照。W固相合成法合成了 2條多 膚，測定了多膚的殺菌活性。
[0045] 取甘油菌種，在LB平板上劃線，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種于LB液體培養(yǎng) 基內(nèi)，37°C，120巧m搖菌過夜。將菌液稀釋至C化=l*l〇Vml，備用。將多膚或抗生素在 96孔細胞培養(yǎng)板上倍比稀釋，每孔50ul，每孔加入50ul菌液。此時多膚或抗生素梯度為： 256ug/ml，128ug/m