一種與植物抗逆性相關(guān)的GmSIZ1a/b蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與植物抗逆性相關(guān)的GmSIZla/b蛋白及 其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆是世界上最重要的商業(yè)作物之一，然而它卻嚴(yán)重的感染各種病原體。大豆疫 霉菌（Phytophthora sojae)屬卵菌綱類導(dǎo)致大豆根腐病的植物病原體，成為最具破壞性的 大豆病害之一，每年導(dǎo)致10-20億美元的損失。大豆植株至少通過(guò)兩種不同的機(jī)制抵御大 豆疫霉菌：?jiǎn)位?（Rps gene)介導(dǎo)的效應(yīng)引發(fā)的免疫反應(yīng)（ETI)和多基因調(diào)控的部分抗性 (partial resistance),這可能與本底防御（basal defense)和弱的ETI相關(guān)聯(lián)。目前，約 有二十個(gè)Rps基因已被定位到四個(gè)染色體上。這些Rps基因中只有Rpslk，RpsYD29，RpslO 和RpsJS被精細(xì)定位。然而Rps基因調(diào)控大豆抵御大豆疫霉菌的分子機(jī)制仍不清楚。由于 Rps基因介導(dǎo)的抗大豆疫霉菌具有特異性，單一 Rps基因介導(dǎo)的抗性只能維持大約8-15年。 因此，迫切需要選育出能夠維持長(zhǎng)久抗性的大豆品種。提高大豆對(duì)疫霉菌部分抗性是一個(gè) 有效途徑，因?yàn)椴糠挚剐阅芫S持長(zhǎng)久和廣譜抗性。
[0003] SUMO (small ubiquitin-related modifier)化是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，通過(guò) El (SUM0激活酶）、E2 (SUM0結(jié)合酶）、E3 (SUM0連接酶）把SUMO連接到底物的賴氨酸SUMO 化位點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)SUMO化修飾與植物和病原菌的互作密切相關(guān)，但尚不清楚其是否調(diào) 控植物抗疫霉病反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種GmSIZla蛋白質(zhì)。
[0005] 上述所述的蛋白質(zhì)是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0006] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007] b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與植物抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種GmSIZlb蛋白質(zhì)。
[0009] 上述所述蛋白質(zhì)是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0010] a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0011] b)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與植物抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0012] 與上述所述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 上述所述的生物材料為下述BI)至B3)中的任一種：
[0014] BI)編碼上述所述蛋白的核酸分子；
[0015] B2)含有BI)所述核酸分子的重組載體；
[0016] B3)含有BI)所述核酸分子的重組菌、含有B2)所述重組載體的重組菌。
[0017] 上述生物材料中，BI)所述的編碼GmSIZla蛋白的核酸分子如序列表中序列1的 第1-2643位核苷酸分子所示；
[0018] BI)所述的編碼GmSIZlb蛋白的核酸分子如序列表中序列3的第1-2640位核苷酸 分子所不。
[0019] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述所述蛋白質(zhì)、或所述相關(guān)生物材料在提高植物抗 逆性中的應(yīng)用。
[0020] 上述應(yīng)用中，所述抗逆性為對(duì)大豆疫霉菌的抗性。
[0021] 本發(fā)明最后一個(gè)目的是提供一種提高植物抗逆性的方法。
[0022] 上述所述的提高植物抗逆性的方法，包括如下步驟：抑制GmSIZla蛋白或GmSIZlb 蛋白的編碼基因在出發(fā)植物中表達(dá)，進(jìn)而使植物的抗逆性提高。
[0023] 上述方法中，所述抑制GmSIZla蛋白或GmSIZlb蛋白的編碼基因在出發(fā)植物中表 達(dá)的方法為：向出發(fā)植物中導(dǎo)入抑制GmSIZla蛋白或GmSIZlb蛋白的編碼基因表達(dá)的干擾 片段。
[0024] 上述方法中，所述干擾片段的序列如序列1第1894-2249位核苷酸分子所示。
[0025] 上述方法中，所述干擾片段是通過(guò)干擾載體導(dǎo)入的。
[0026] 上述方法中，所述干擾載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：用限制性內(nèi)切酶SacI和 PmeI將pFGClOOS酶切，取小片段，記作中間片段；將所述中間片段連接到用限制性內(nèi)切酶 SacI和PmeI酶切后的pCambia3300載體中，獲得pCambia3300_RNAi載體；再將序列1第 1894-2249位核苷酸分子所示的干擾片段通過(guò)限制性內(nèi)切酶Ascl/Swal和BamHI/Spel，正 向和反向連入pCambia3300-RNAi載體中，最終獲得pCambia3300-GmSIZlRNAi重組載體，即 為干擾載體。
[0027] 上述方法中，所述抗逆性為對(duì)大豆疫霉菌的抗性。
[0028] 上述方法中，所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為 大豆。
[0029] 序列1中第1894-2249位核苷酸分子所示的干擾片段也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0030] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種干擾載體。
[0031] 上述所述的干擾載體的構(gòu)建方法：用限制性內(nèi)切酶SacI和PmeI將pFGC1008酶 切，取小片段，記作中間片段；將所述中間片段連接到用限制性內(nèi)切酶SacI和PmeI酶切 后的pCambia3300載體中，獲得pCambia3300-RNAi載體；再將序列1第1894-2249位核 苷酸分子所示的干擾片段通過(guò)限制性內(nèi)切酶Ascl/Swal和BamHI/Spel，正向和反向連入 pCambia3300-RNAi載體中，最終獲得pCambia3300-GmSIZlRNAi重組載體，即為干擾載體。
[0032] 本發(fā)明提供了一種與植物抗逆性相關(guān)的蛋白GmSIZla/b及其編碼基因與應(yīng)用。結(jié) 果表明：蛋白GmSIZla/b可以調(diào)節(jié)大?與大?疫霉囷相互作用，并提供一種策略來(lái)提1?大 豆抗大豆疫霉菌的抗性。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為大豆GmSIZla/b和擬南芥AtSIZl蛋白的結(jié)構(gòu)域示意圖。
[0034] 圖2為GmSIZla和GmSIZlb互補(bǔ)擬南芥siz 1-2突變體的矮化表型圖。
[0035] 圖3為GmSIZla/b互補(bǔ)sizl-2中熱脅迫誘導(dǎo)的SUMO化修飾水平得到恢復(fù)。
[0036] 圖4為GmSIZlRNAi轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的抗性檢測(cè)和GmSIZla/b表達(dá)量檢 測(cè)的對(duì)比圖。
[0037] 圖5為GmSIZlRNAi轉(zhuǎn)基因植株中熱脅迫誘導(dǎo)的SUMO化修飾水平降低表型。
[0038] 圖6為GmSIZlRNAi轉(zhuǎn)基因植株的抗Phytophthora sojae的表型。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0040] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041] 本研究所用的植物材料為大豆（Glycine max L. Merr. Cv)，品種為中豆32,在文獻(xiàn) "郭兵福，蔣凌雪，李脈泉，顧海藍(lán)，金龍國(guó)，邱麗娟。不同大豆品種對(duì)觸殺型除草劑的耐受 性，中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2012, 34 (5) : 551-555"中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科 學(xué)研究所獲得。大豆種子在去離子水的濾紙上萌發(fā)1天后，然后轉(zhuǎn)移到土壤中，在100 μ mol m 2 s 1的光下（16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗）、溫度為25°C和相對(duì)濕度為70%的條件下生長(zhǎng)。
[0042] 擬南芥 sizl-2 突變體和 AtSIZl 啟動(dòng)子在文獻(xiàn)"Jin JB，Jin YH，Lee J，Miura K，Yoo CY，Kim WY，Van Oosten M，Hyun Y，Somers DE，Lee I，Yun DJ，Bressan RA, Hasegawa PM. The SUMO E31igase，AtSIZl，regulates flowering by controlling a salicylic acid-mediated floral promotion pathway and through affects on FLC chromatin structure. 2008, Plant J 53:530-540"中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得。
[0043] PsJS2 菌種為大 ? 疫霉菌（Phytophthora so jae)在文獻(xiàn)中 "Zhang J, Sun S, Wang G,Duan C, Wang X, Wu X,Zhu Z.Characterization of Phytophthora resistance in soybean cultivars/lines bred in Henan province. Euphytica, 2014, 196:375-384"中公 開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。
[0044] 實(shí)施例1、GmSIZla/b基因的獲得
[0045] 1、引物：Fl (正向引物）：5' -CGGGATCCATGGATTTGGTACCGAGCG-3' ;R1 (反向引物）： 5' _CGGGATCCTCTCTGAATCTGAATCAATAGAA_3'。
[0046] 2、提取大豆葉片的RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
[0047] 3、以上述cDNA為模板，采用步驟1設(shè)計(jì)的引物對(duì)，PCR擴(kuò)增GmSIZla/b基因。
[0048] 4、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明：GmSIZla蛋白如序列表的序列2所示，其 編碼基因序列如序列表的序列1所不；GmSIZlb蛋白如序列表的序列4所不，其編碼基因序 列如序列表的序列3所示。
[0049] 實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0050] 1、載體的構(gòu)建
[0051] 用限制性內(nèi)切酶HindIII和NcoI酶分別將實(shí)施例1中獲得的GmSIZla/b全長(zhǎng)cDNA 和pCambial302載體進(jìn)行雙酶切，連接，獲得重組載體。再將AtSIZl啟動(dòng)子區(qū)域分別連入 重組載體，獲得 pCambial302-ProAtSIZl:GmSIZla:GFP 載體和 pCambial302-ProAtSIZl:Gm SIZlb = GFP載體，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
[0052