橡膠樹死皮相關(guān)蛋白HbMC1及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域中橡膠樹死皮相關(guān)蛋白化MCI及其編碼基因W及二者 在調(diào)控細胞死亡、氧化脅迫抗性及橡膠樹死皮發(fā)生中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 己西橡膠樹化eveabrasiliensisMuell.Arg.)因具有橡膠含量高、質(zhì)量好、經(jīng) 濟壽命長、易采收等獨特優(yōu)點而成為天然橡膠的主要來源。我國是世界第一大天然橡膠消 費國，年消費量高達370萬噸。由于我國屬于非傳統(tǒng)植膠區(qū)，植膠區(qū)域有限，我國年產(chǎn)膠量 不到80萬噸，自給率不足22%。在植膠±地面積有限的情況下，要保障天然橡膠供給能 力，就必須大幅提高單位面積的橡膠產(chǎn)量。在影響單產(chǎn)的因素中，死皮是主要限制性因子 之一。目前，世界各植膠國膠園死皮率在20%~50%之間，年產(chǎn)量損失高達15%~20% (Venkatachalam等，2010)。鑒于死皮對天然橡膠產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重影響，提高單產(chǎn)必須解決死皮 問題，而闡明死皮發(fā)生機制是解決死皮問題的前提，開展橡膠樹死皮發(fā)生機制及防控研究 具有重要的理論和應(yīng)用價值。
[0003] 己西橡膠樹的樹皮是由維管形成層向外分化形成的，具有初皮射線、初皮薄壁細 胞、篩管、伴胞、初皮纖維等基本組織的結(jié)構(gòu)。作為最主要的產(chǎn)膠植物，橡膠樹的樹皮具有一 種特化的產(chǎn)膠組織一乳管。在天然橡膠生產(chǎn)中，人們通過切割橡膠樹樹皮中的乳管，收集由 割線排出的膠乳，作為提煉天然橡膠的原料。橡膠樹死皮（TappingPanel化yness，TPD) 的癥狀為割線排膠減少或完全停排。割膠對橡膠樹來說是一種不可避免的機械傷害。橡膠 樹死皮的成因十分復(fù)雜，它既可W自發(fā)產(chǎn)生，也可W通過各種內(nèi)外因素誘導(dǎo)產(chǎn)生，割膠強度 過大、長期和過度使用乙締利刺激排膠會導(dǎo)致橡膠樹死皮的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)死皮橡膠樹中 活性氧水平升高。研究者曾從病理、生理、遺傳、±壤和生化等方面進行了探索與研究，但其 發(fā)生機制仍不清楚。目前，死皮被認為是一種由過度割膠和強乙締刺激引起的、復(fù)雜的生理 綜合癥（范思偉和楊少瓊，1995)。近年來，隨著分子生物學(xué)和相關(guān)基因工程技術(shù)在橡膠樹 生理生化研究中的應(yīng)用，對橡膠樹死皮發(fā)生機制的研究取得了初步進展，推測活性氧代謝、 泛素-蛋白酶體途徑、細胞程序化死亡（ProgramedCellDeath,PCD)、萊莉酸生物合成及 橡膠生物合成途徑等基因表達改變與橡膠樹死皮發(fā)生有關(guān)?；痚n等（2003)在橡膠樹樹皮 中鑒定并克隆死皮相關(guān)基因化Mybl，該基因可能是細胞程序化死亡的負調(diào)控因子，并提出 "橡膠樹死皮是一種細胞程序化死亡現(xiàn)象"的觀點?；痭g等（2011)進一步研究表明：與健 康橡膠樹相比，死皮橡膠樹乳管細胞具有細胞程序化死亡的典型特征，在煙草中超量表達 HbMybl可抑制逆境誘導(dǎo)的細胞死亡。Venkatachalam等（2007)、Li等（2010 ;2012)和覃碧 等（2012)利用抑制性差減雜交及基因忍片技術(shù)對死皮和健康橡膠樹膠乳或樹皮間基因表 達差異進行分析，發(fā)現(xiàn)大量與細胞程序化死亡途徑相關(guān)的基因在二者之間差異表達，證明 細胞程序化死亡在橡膠樹死皮發(fā)生過程中扮演重要角色。研究細胞程序化死亡途徑中重要 基因在橡膠樹死皮發(fā)生中的作用將有助于死皮發(fā)生的分子機制的解析，并能為橡膠樹死皮 防控提供重要的祀標(biāo)基因。 W〇4] 在動物細胞程序化死亡過程中，半脫天冬蛋白酶（cysteine-dependent aspartate-specificproteases,caspase)起著關(guān)鍵作用（XamandZhang, 2012)。研究 顯示，有些植物能夠產(chǎn)生類似caspase活性的物質(zhì)，并且運種酶活性調(diào)控著細胞程序化死 亡過程。盡管如此，在植物中并沒有找到與caspase同源的蛋白質(zhì)，但是發(fā)現(xiàn)有一類含 有caspase結(jié)構(gòu)域kaspasedomain)的類半脫天冬蛋白kaspase-Ukeprotein),稱為 metacaspase(MC)。Metacaspases存在于藍藻、真菌、酵母和高等植物中（Jiang等，2010)。 根據(jù)caspase-like功能區(qū)的序列相似性和序列結(jié)構(gòu)，metacaspases可W分成2種類型，即 I型和II型扣ren等，2000)。除均含有與caspase大亞基相似的約150個氨基酸的保守 區(qū)域及在C末端存在的與caspase小亞基相似的第二保守區(qū)域外，來自植物和真菌的I型 metacaspase蛋白N端的prodomain含有1個特定的氨基酸模體（motif,通常是富含脯氨酸 的重復(fù)模體（proline-richr巧eatmotif)或者鋒指模體（zincfingermotif)。運一鋒指 結(jié)構(gòu)與植物超敏反應(yīng)相關(guān)的蛋白LSD-1相似。植物中II型metacaspase沒有prodomain， 但是在p20和plO兩個亞單位之間插入了一個長約200個氨基酸殘基的片段（馬聰和孔維 文，2012)。 陽0化]盡管metacaspase沒有表現(xiàn)出類caspase活性，但它們?nèi)匀辉谥参锛毎绦蚧?亡過程中發(fā)揮作用（Zhang和Lam, 2011)?；痚berichts等（2003)在灰葡萄抱菌引起的番茄 葉片超敏反應(yīng)中觀察到II型metacaspase基因LeMCAl表達量明顯升高，說明metacaspase 參與了植物抗病的超敏反應(yīng)。在煙草中，超量表達metacaspase基因NbMCl能增強煙草對 毀滅炭痘菌的抗性化ao等，2007)。歐洲云杉II型metacaspase的下調(diào)能抑制其胚胎形 成時期胚柄細胞的細胞程序化死亡過程（Suarez等，2004)。擬南芥基因組中共存在9個 metacaspase基因，其中，兩個I型metacaspase基因（AtMCl和AtMC2)已被證實能調(diào)控細胞 程序化死亡過程，AtMCl是正調(diào)控因子，而AtMC2是負調(diào)控因子（Coll等，2010)。Watan油e 和Lam(2011)證明在生物和非生物脅迫誘導(dǎo)的擬南芥細胞程序化死亡中，AtMC4都發(fā)揮著 正調(diào)控因子的作用。小麥中該基因的同源基因TaMC4也被證實調(diào)控了條誘菌誘導(dǎo)的細胞程 序化死亡過程（Wang等，2012)。擬南芥II型metacaspase基因AtMC8在UVC和&〇2介導(dǎo) 的細胞程序化死亡過程中表達上調(diào)，該基因的缺失會減弱細胞死亡，推測AtMC8參與了氧 脅迫誘導(dǎo)的擬南芥細胞程序化死亡過程Ole等，2008)。Ahmad等（2012)也發(fā)現(xiàn)玉米II型 metacaspase基因的表達及活性受臭氧脅迫及衰老的誘導(dǎo)，metacaspase介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水 解在葉片應(yīng)對臭氧脅迫及年齡誘導(dǎo)的衰老中起重要作用。擬南芥metacaspase基因AtMC9 則特異的在發(fā)育的木質(zhì)部中表達，參與木質(zhì)部細胞死亡調(diào)控度〇1化oner等，2013)。運些研 究結(jié)果表明，metacaspase基因家族成員在發(fā)育、生物或非生物逆境誘導(dǎo)的細胞程序化死亡 過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
[0006] 到目前為止，尚沒有有關(guān)橡膠樹metacaspase家族基因的研究報道。細胞程序化 死亡在橡膠樹死皮發(fā)生中扮演重要角色，而metacaspase家族基因又在細胞程序化死亡中 起著重要調(diào)控作用。Metacaspase家族成員可能參與了橡膠樹死皮發(fā)生調(diào)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何調(diào)控細胞的死亡，W及如何抑制或防治橡膠樹 死皮。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種與橡膠樹死皮相關(guān)的蛋白質(zhì)，其名 稱為HbMCl,來源于大戟科橡膠樹屬的己西橡膠樹化evea brasiliensis Muell.Arg.)，是 如下Al)或A2): 陽009] A1)氨基酸序列為序列表中序列1的蛋白質(zhì)；
[0010] A2)在序列1的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸 殘基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白質(zhì)。 陽0川其中，序列1由367個氨基酸組成。
[0012] 為了使A1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列1所示的蛋白質(zhì)的氨基末端 或簇基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。 陽〇1引表1.標(biāo)簽的序列[0014]
陽0巧]上述A2)中的化MCI可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 上述A2)中的化MCI的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾 個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/ 或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0016] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與上述化MCI蛋白相關(guān)的生物材料，所述 生物材料為下述B1)至B12)中的任一種：
[0017] B1)編碼化MCI的核酸分子；
[0018] B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒；
[0019] B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；
[0020] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0021] B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物；
[0022] B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0023] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0024] B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[00巧]B9)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0026] B10)含有B2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0027] B11)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0028] B12)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系。
[0029] 上述生物材料中，Bl)所述核酸分子可為如下bl)或b2)或b3)或b4)的基因：
[0030]bl)核巧酸序列是序列表中序列2的第23-1126位的cDNA分子或DNA分子； 陽03Ub2)核巧酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DM分子； 陽03引 與bl)或b。限定的核巧酸序列具有90%W上同一性，且編碼化MCI的cDNA 分子或基因組DM分子；
[0033] b4)在嚴(yán)格條件下與bl)或b2)限定的核巧酸序列雜交，且編碼化MCI的cDNA分 子或基因組DNA分子。
[0034] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也 可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0035] 其中，序列2由1160個核巧酸組成，第23-1126位為編碼區(qū)，編碼序列1所示的 HbMCl。
[0036] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的編碼化MCI的核巧酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分 離得到的編碼化MCI的核巧酸序列90%或者更高同一性的核巧酸，只要編碼化MCI且具有 化MCI功能，均是衍生于本發(fā)明的核巧酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0037] 運里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的編碼化MCI所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核巧酸序列具有90%或更高，或95% 或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟 件，兩個或多個序列之間的同一性可W用百分比（％)表示，其可W用來評價相關(guān)序列之間 的同一'性。
[0038] 上述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每 次5min，又于0. 5XSSC，0. 1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次15min;或， 0. 1XSS陽（或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0039] 上述90%W上同一性，可為90%或95%W上的同一性。
[0040] 上述生物材料中，B2)所述的含有編碼化MCI的核酸分子的表達盒化bMCl基因 表達盒），是指能夠在宿主細胞中表達化MCI的DNA，該DNA不但可包括啟動化MCI基因 轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止化MCI基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增 強子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異 的啟動子，和誘導(dǎo)型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花挪菜花葉病毒的組成型啟動 子35S;來自番茄的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，亮氨酸氨基膚酶廣LAP",化ao等人（1999)Plant Physiol120:979-992);來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)病機理相關(guān)l(PRl)(由水楊酸 和BTH(苯并嚷二挫-7-硫代徑酸S-甲醋）誘導(dǎo)）；番茄蛋白酶抑制劑II啟動子（PIN2) 或LAP啟動子（均可用萊莉酬酸甲醋誘導(dǎo)）；熱休克啟動子（美國專利5,187,267);四環(huán) 素誘導(dǎo)型啟動子（美國專利5,057, 422);種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子 PF128 (CN101063139B(中國專利200710099169. 7))，種子膽存蛋白質(zhì)特異的啟動子（例如， 菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動子度eachy等人（1985化MB0 J.4 :3047-3053))。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此處引用的所有參 考文獻均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌姻脂堿合成酶終止子（N0S 終止子）、花挪菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、魏豆rbcSE9終止子和姻脂氨酸 和章魚氨酸合酶終止子（參見，例如：Od