溶栓酶基因及含有該基因的重組表達(dá)載體、重組菌以及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種溶栓酶基因及含有該基因的重組表達(dá)載體、重組菌以及應(yīng)用，屬 于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 枯草桿菌溶栓酶（Bacillus subtilis QK02)是通過檢測降解纖維蛋白能力的方 法篩選到的。研宄表明，該酶具有較強的纖溶活性，是一種潛在的溶栓藥物。它不僅具有良 好的溶栓效果，而且通過口服就可以達(dá)到纖溶目的，比當(dāng)前臨床應(yīng)用的溶栓藥物（如鏈激 酶、尿激酶等）更具備優(yōu)勢。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外及血管內(nèi)皮細(xì)胞中該酶具有拮抗由血 紅素 、NaNOJP H2O2帶來損傷的能力。目前，該酶主要來源于野生枯草芽孢桿菌發(fā)酵的納豆、 豆豉等，但是納豆、豆豉的風(fēng)味還不能被許多人所接受。此外，從發(fā)酵液中分離純化納豆激 酶通常產(chǎn)量較低、活性較低、生產(chǎn)成本高，這些因素都在一定程度上限制了納豆激酶的開發(fā) 和利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有溶栓酶產(chǎn)量低、酶活性較低、生產(chǎn)成本高的缺陷，提 供一種能夠高效表達(dá)枯草桿菌溶栓酶的溶栓酶基因及含有該基因的重組表達(dá)載體、重組菌 以及應(yīng)用。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，首先，本發(fā)明提供一種溶栓酶基因，其核苷酸序列或核苷酸序列 的互補鏈如SEQ ID NO: 1所示。
[0005] 本發(fā)明所提供的溶栓酶基因是從枯草桿菌Bacillus sutilisQK-02中提取基因 組DNA，再通過套疊 PCR擴(kuò)增優(yōu)化得到，其中套疊 PCR所用引物組的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、 SEQ ID N0:9,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:2USEQ ID N0:22,SEQ ID N0:23,SEQ ID N0:24,SEQ ID N0:25,SEQ ID N0:26, SEQ ID N0:27所示。通過套疊 PCR優(yōu)化后的溶栓酶基因序列可以更好地被大腸桿菌表達(dá)菌 株BL21(DE3)識別，有助于蛋白的表達(dá)。
[0006] 本發(fā)明還提供了上述溶栓酶基因在制備溶栓酶及相關(guān)藥物中的應(yīng)用。
[0007] 第二，本發(fā)明提供了一種含有溶栓酶基因的重組載體，由pET40b表達(dá)載體和核苷 酸序列如SEQ ID NO: 1所示的溶栓酶基因經(jīng)過Sal I/EcoR I酶切后重組而成。
[0008] 優(yōu)選地，上述重組載體的T7啟動子前插入有Iac操縱子。插入Iac操縱子使該重 組載體成為一種被IPTG高效誘導(dǎo)的啟動子
[0009] 本發(fā)明還提供了上述含有溶栓酶基因的重組載體在制備溶栓酶及相關(guān)藥物中的 應(yīng)用。
[0010] 第三，本發(fā)明提供了一種表達(dá)溶栓酶的重組菌，是將上述含有溶栓酶基因的重組 載體通過鈣轉(zhuǎn)的方法導(dǎo)入大腸桿菌菌株BL21(DE3)中所得到的重組菌。該重組菌用于表達(dá) 枯草桿菌溶栓酶，需要說明的是除了 CaClJi，其他如電穿孔轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等途 徑也可以將含有溶栓酶基因的重組載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中，得到的重組 菌。
[0011] 本發(fā)明還提供了上述表達(dá)溶栓酶的重組菌在制備溶栓酶及相關(guān)藥物中的應(yīng)用。
[0012] 第四，本發(fā)明所提供了一種溶栓酶的表達(dá)方法，的枯草桿菌重組蛋白的制備方法， 該方法利用上述表達(dá)溶栓酶的重組菌在蛋白表達(dá)時，其誘導(dǎo)過程中加入IPTG誘導(dǎo)，再通過 腸激酶酶切，分離純化得到枯草桿菌溶栓酶；其中，所加入IPTG是誘導(dǎo)表達(dá)上述的工程菌， 再通過腸激酶酶切，分離純化得到枯草桿的濃度為0. 1~1.0 mM，優(yōu)選為0. 5mM，誘導(dǎo)溫度為 16~37°C，優(yōu)選為22°C，誘導(dǎo)時間為3~16小時，優(yōu)選為12小時。
[0013] 本發(fā)明還提供了上述溶栓酶的表達(dá)方法在制備溶栓酶及相關(guān)藥物中的應(yīng)用。
[0014] 針對本發(fā)明的設(shè)計原理作出如下說明
[0015] 研宄中，我們對現(xiàn)有的溶栓酶基因進(jìn)行改造時，一般通過PCR擴(kuò)增的方法得到枯 草桿菌溶栓酶基因組DNA，但是由于大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)對基因序列具有一定的 密碼子偏愛性，因此常規(guī)方法得到的基因序列表達(dá)蛋白質(zhì)的量并不高。
[0016] 而套疊 PCR技術(shù)可以將序列進(jìn)行優(yōu)化，從而解決這個問題。套疊 PCR技術(shù)，又稱 重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法（gene splicing by overlap extension，gene SOEing)，是利用 PCR技術(shù)在體外進(jìn)行有效的基因重組和定點突變，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理。該 技術(shù)使用簡易，可利用這一技術(shù)很快獲得其他依靠內(nèi)切酶消化方法根本難以做到的產(chǎn)物。 SOEing法的基本原理是向PCR產(chǎn)物內(nèi)摻入一段新的、在原模板內(nèi)不存在的序列。引物只需 與其模板有效結(jié)合而不必完全匹配，特別是5'端序列。任何與原模板不匹配的堿基都將摻 入到PCR產(chǎn)物中，這為創(chuàng)造定點突變提供了簡便易行的方法。
[0017] 表達(dá)載體的選擇也會對蛋白表達(dá)量及蛋白活性有一定的影響。本發(fā)明人通過大量 實驗和數(shù)據(jù)得到，pET-40b與其他載體如pET-23a相比，在蛋白表達(dá)時更具備優(yōu)勢，可以提 高蛋白的可溶性，進(jìn)而增加目的蛋白的表達(dá)量。pET-40b是一種用于周質(zhì)表達(dá)的原核質(zhì)粒， 包含T7啟動子、His標(biāo)簽、腸激酶酶切位點，具有卡那霉素抗性，可表達(dá)出DsbC(二硫鍵異 構(gòu)酶）融合蛋白。以pET-40b作為表達(dá)載體，大腸桿菌BL21(DE3)為宿主細(xì)胞的原核周質(zhì) 表達(dá)系統(tǒng)具有多方面的優(yōu)勢：（1)在DsbC的C末端進(jìn)行融合表達(dá)，DsbC作為細(xì)菌蛋白的信 號肽，引導(dǎo)目的蛋白穿膜到達(dá)周質(zhì)空間。（2)DsbC具有還原性，能夠幫助蛋白質(zhì)形成正確的 二硫鍵，還可增加蛋白的可溶性。因此該系統(tǒng)表達(dá)的蛋白不需氧化復(fù)性。（3)表達(dá)出的融合 蛋白含有腸激酶酶切位點和His標(biāo)簽，可通過腸激酶酶切得到目的蛋白。同時His標(biāo)簽可 以簡化融合蛋白純化及融合蛋白酶切后目的蛋白分離的過程。（4)相對于酵母表達(dá)，該表達(dá) 系統(tǒng)周期較短。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：提供了一種溶栓酶基因、及由其構(gòu)建的重組表達(dá)載體、重組菌 以及應(yīng)用，本發(fā)明通過套疊 PCR技術(shù)優(yōu)化得到的qk序列可以更好地被大腸桿菌表達(dá)菌株 DE3識別，同時選用增加蛋白可溶性的載體pET_40b與優(yōu)化后的qk構(gòu)建形成新的重組表達(dá) 載體和制備表達(dá)蛋白的重組菌，可以將功能性胞外蛋白酶分泌到細(xì)胞周質(zhì)中，增加融合蛋 白的可溶性和活性，最終獲得的表達(dá)量高和酶活性高的枯草桿菌溶栓酶。該方法不包含包 涵體溶解及蛋白復(fù)性的操作，降低了成本，具有更好的實用性。
【附圖說明】
[0019] 圖1為枯草桿菌溶栓酶的基因 qk擴(kuò)增后PCR電泳結(jié)果圖。
[0020] 圖2為枯草桿菌溶栓酶誘導(dǎo)型表達(dá)載體pET40b示意圖。
[0021] 圖3為pET40b的酶切鑒定電泳結(jié)果。
[0022] 圖4為枯草桿菌溶栓酶在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的Western blot結(jié)果。
[0023] 圖5A為不同溫度對枯草桿菌溶栓酶誘導(dǎo)分泌表達(dá)影響的電泳結(jié)果圖。
[0024] 圖5B為不同誘導(dǎo)時間對枯草桿菌溶栓酶誘導(dǎo)分泌表達(dá)影響的電泳結(jié)果圖。
[0025] 圖5C為IPTG濃度對枯草桿菌溶栓酶誘導(dǎo)分泌表達(dá)影響的電泳結(jié)果圖。
[0026] 圖6分泌表達(dá)的枯草桿菌溶栓酶純化后的電泳結(jié)果圖。
[0027] 圖7為枯草桿菌溶栓酶在大腸桿菌中誘導(dǎo)型表達(dá)產(chǎn)物酶切后的SDS-PAGE凝膠電 泳檢測結(jié)果。
[0028] 圖8為分泌表達(dá)的枯草桿菌溶栓酶的蛋白平板活性檢測結(jié)果照片。
[0029] 圖9為qk基因序列優(yōu)化前后重組載體蛋白表達(dá)量對比電泳結(jié)果圖。
[0030] 圖10為重組表達(dá)載體pET23a_qk和pET40b_qk上清裂解液蛋白表達(dá)量對比電泳 結(jié)果圖。
[0031] 圖11為重組表達(dá)載體pET23a_qk和pET40b_qk上清裂解液酶活力測定實驗結(jié)果 照片。
【具體實施方式】
[0032] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。下述實施例中所用方法如無特 別說明均為常規(guī)方法，所有引物合成及測序工作均由上海生工完成。
[0033] 實施例1枯草桿菌QK-02的制備過程
[0034] 將水稻葉置于85°C熱處理10分鐘，再用其包裹滅過菌的大豆，42°C培養(yǎng)24小時， 后用培養(yǎng)液浸泡處理后的大豆，將浸泡過大豆的培養(yǎng)液作10-2~10-6稀釋，涂布于營養(yǎng)瓊脂 平板，37°C倒置培養(yǎng)。所獲的菌落分別接種在5mL培養(yǎng)液中，37°C，250rpm/min培養(yǎng)24h后， 以6000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心5min。各取20 μ 1上清液在纖維蛋白平板上測定溶栓酶活性， 然后選擇酶活性最高的菌株。
[0035] 實施例2編碼溶栓酶的基因 qk的PCR擴(kuò)增及序列優(yōu)化
[0036] 2. 1編碼枯草桿菌溶栓酶的基因 qk的PCR擴(kuò)增和克隆
[0037] 枯草桿菌Bacillus Subtilis QK-02的基因組DNA提取按照常規(guī)方法（Saito， H.etal, 1963, Biochim. Biophys. Acta 72:619-629)來進(jìn)行。
[0038] PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計：
[0039] 引物 PI : 5 ' ACGCGTCGACATGGCGCAATCTGTTCCTTACGGC
[0040] 引物 P2 :3 ' CCGGAATTCTAGCTATTATTGTGCAGCTGC
[0041] PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系50ul體系中：5 μ 1枯草桿菌基因組DNA作為模板，引物P1、 Ρ2 (10 μ Μ)各 1 μ 1，10 X PCR 緩沖液 5 μ I，dNTP (2_〇1) 5 μ I，KOD 酶 0. 5 μ 1，最后用無菌水 補足至 50ul。反應(yīng)程序為：94°C，5min ;94°C，30s ;56°C，IOs ;74°C，30s ;74°C，6min，一共 35 個循環(huán)。擴(kuò)增完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增出的片段大小為828bp。結(jié) 果見圖1，圖中，M:Marker，l、2均為qk基因片段。
[0042] 2. 2編碼溶栓酶的基因 qk的優(yōu)化
[0043] 利用套疊 PCR的方法優(yōu)化qk基因。
[0044] 引物如表1:
[0045] 表1引物序列表
[0046]
[0047] 其中下劃線標(biāo)記為引入的酶切位點，最終擴(kuò)增出的片段大小為1068bp，與原始序 列對比多余的