miR-34a沉默表達(dá)重組載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及miR-34a沉默表達(dá)重組載體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] microRNA是一類長度約為22~25個(gè)核苷酸的單鏈短序列小RNA，它不編碼蛋白質(zhì)， 但能以其5'末端第2~8位核苷酸以非完全性堿基配對的方式結(jié)合于同源mRNA的3'UTR( 3' 非轉(zhuǎn)譯區(qū)），通過抑制mRNA的表達(dá)或是誘導(dǎo)其降解，對mRNA進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，影響相關(guān)蛋白的 生成。microRNA-34a(miR_34a)是microRNA的一種，它在腦組織、心肌、肺、肝臟、前列腺等全 身各部位組織中廣泛表達(dá)，成熟micRNA34a序列如序列1所示，在體內(nèi)先形成micRNA34a的前 體序列，然后體內(nèi)加工形成了成熟的micRNA34a。其編碼基因定位于1號染色體長臂3區(qū)6帶 (1ρ36)，染色體（1ρ36)部位的缺失可發(fā)生于多種腫瘤細(xì)胞中，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肝癌、結(jié)直 腸癌等，因此，miR-34a常被用于研究在腫瘤發(fā)生中所起的作用;此外，miR-34a可以與多種 基因的mRNA非特異性結(jié)合，如MYCN、BCL2、SIRT1、N0TCH1、JAG1、CCND1、CDK6以及E2F3 等，這些基因參與體內(nèi)各種生物過程如腫瘤發(fā)生及惡性轉(zhuǎn)移、神經(jīng)發(fā)生及分化、血管生成、 細(xì)胞凋亡及壞死等，miR-34a因此也被廣泛地用于研究在腫瘤中所起的作用。
[0003] 然而，關(guān)于miR-34a在阿爾茨海默病或焦慮癥中所起的作用現(xiàn)有技術(shù)中尚未見報(bào) 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對miR_34a來設(shè)計(jì)抑制miR_34a表達(dá)的tud_mir34a，利用tud_mir34a構(gòu)建 miR-34a沉默重組載體并抑制miR-34a在AD小鼠海馬腦組織中大的表達(dá)，確定miR-34a抑制 可顯著改善AD轉(zhuǎn)基因小鼠焦慮障礙樣行為學(xué)障礙。研究結(jié)果顯示，該重組載體在整體動物 水平成功高效表達(dá)，并顯著改善AD轉(zhuǎn)基因小鼠焦慮樣障礙。本研究結(jié)果不但為深入研究 miR-34a的功能提供新的技術(shù)手段，同時(shí)為AD神經(jīng)精神障礙如焦慮樣障礙靶向基因治療提 供了新的候選策略。
[0005] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供miR_34a基因在制備治療阿爾茨海默病神經(jīng)精神 障礙或焦慮癥的藥物中的用途，所述miR_34a基因如序列1所示。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制miR-34a表達(dá)的tud-mir34a，其基因序列如 序列2所示。
[0007] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供miR_34a沉默表達(dá)重組載體，其含有序列2所示的基因 序列。
[0008] 本發(fā)明還提供了構(gòu)建miR_34a沉默表達(dá)重組載體的方法，該方法包括：（A)合成 tud-mir34a，其序列如序列表中序列2所示；（B)將合成的tud-mir34a和載體進(jìn)行酶切，將酶 切的tud-mir34a和載體連接；（C)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定后提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行包裝。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了堿基序列如序列2所示的tud-mir34a或含有tud-mir34a的 miR-34a沉默表達(dá)重組載體在制備治療阿爾茨海默病神經(jīng)精神障礙或焦慮癥的藥物中的用 途。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0011]本發(fā)明設(shè)計(jì)了抑制miR-34a表達(dá)的tud-mir34a，利用其有效構(gòu)建miR-34a沉默載 體，并在腦組織中成功抑制miR-34a的表達(dá)；同時(shí)確定miR-34a的抑制可顯著改善AD轉(zhuǎn)基因 小鼠焦慮樣障礙。
【附圖說明】
[0012]圖1為酶切鑒定結(jié)果圖。
[0013]M:DNAmarker(5000bp)
[0014]1 ~2:重組質(zhì)粒pAAV-tudmiRNA_34A
[0015] 3:pAAV-ZsGreen-ShRNA空載體測序鑒定 [0016]圖2為目的基因片段的序列測定圖。
[0017]圖3為TudmiR_34a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系在光鏡和熒光顯微鏡下的圖片。
[0018] (A)TudmiR-34a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系在光鏡下的圖片，圖中的標(biāo)尺代表100μπι; (B)這是 在熒光顯微鏡下的圖片，來自與(Α)相同的視野。我們構(gòu)建的TudmiR-34a表達(dá)載體含有GFP結(jié)構(gòu)域，在表達(dá)miR_34a的同時(shí)可以表達(dá)GFP，因此陽性細(xì)胞可以發(fā)綠色熒光。圖中的標(biāo)尺代 表100μL?ο
[0019]圖4為TudmiR-34a沉默表達(dá)載體在小鼠海馬CA3區(qū)的表達(dá)情況。
[0020] 圖5為APPSwe/PSlMi46v/Taup3(nL轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織CA3區(qū)TudmiR_34a表達(dá)情況。
[00211圖6為miR_34a沉默表達(dá)對Tg小鼠曠場實(shí)驗(yàn)行為學(xué)的影響。
[0022] (A)中央?yún)^(qū)時(shí)間；（B)總路程。結(jié)果表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤，每組8-10只小鼠；用t檢 驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P〈〇.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，**p〈0.01vsTg。
[0023]圖7為miR_34a沉默表達(dá)對Tg小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)的影響圖。
[0024] (A)進(jìn)入開臂次數(shù)；（B)進(jìn)入閉臂次數(shù)；（C)開臂時(shí)間；（D)閉臂時(shí)間；（E)進(jìn)入開臂次 數(shù)占進(jìn)入開臂閉臂總次數(shù)的比例；（F)總路程。結(jié)果表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤，每組8-10只小 鼠；用t檢驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以p〈0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，*p〈0.05，**p〈0.01vs Tg〇
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下通過【具體實(shí)施方式】來說明本發(fā)明。
[0026]一、miR_34a沉默表達(dá)載體構(gòu)建
[0027] 1、序列獲得和引物設(shè)計(jì)
[0028] 從NCBI的仙(：16〇1:丨(16數(shù)據(jù)庫中66油&111<:上找到小鼠111丨1?-34&基因序列（4(^68 8；[011 No:EF606691)，根據(jù)TudRNA的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)miR-34a特異的長效抑制TudmiR-34a序列，在目的序 列兩端添加BamHI、Hindin酶切位點(diǎn)。將序列送至上海生工合成。
[0029]TudmiR-34a：
[0031] 2、目的基因和表達(dá)載體的雙酶切
[0032] (l)TudmiR_34a基因酶切體系（50ul):
[0033] 目的基因： 30ul
[0034] 反應(yīng)buffer: 5ul
[0035]水： l〇ul
[0036] Hindlll: 2.5ul
[0037] BanHI: 2.5ul
[0038] (2)pAAV-ZsGreen_ShRNA載體酶切體系（50ul):
[0039] 載體： 20ul
[0040] Buffer： 5ul
[0041 ]水： 20ul
[0042] HindllI: 2.5ul
[0043] BamHI：2.5ul
[0044]將上述反應(yīng)體系置于37°C，過夜或酶切5小時(shí)。電泳檢測酶切產(chǎn)物，并切膠回收。
[0045] 3、連接目的基因和pAAV-ZsGreen-ShRNA
[0046] 將上述酶切的目的基因miR-34a連接到酶切載體pAAV-ZsGreen-ShRNA(是一種腺 相關(guān)病毒載體，購自上海生工生物工程有限公司）上形成重組質(zhì)粒pAAV-TudmiR-34a，同時(shí) 取酶切的pAAV-ZsGreen-ShRNA和無菌水為陰性對照，按表1配制10ul的連接體系：
[0047]表1. 10μ1miR_34a連接體系
[0049] 然后置于22°C3_6小時(shí)，或4°C過夜。
[0050] 4、轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10和涂板
[0051 ] 取5ul連接產(chǎn)物和陰性對照分別加到50ul的感受態(tài)Top10中，輕柔的混勻，4°C冰 浴30min，然后42°C熱激lmin，4°C冷卻，加100ul無抗性培養(yǎng)基，置于搖床200轉(zhuǎn)速1小時(shí)。將 菌液涂布在氨芐青霉素板上，分別標(biāo)記為pAAV-TudmiR-34a、pAAV( -）。37°(3培養(yǎng)14h，重組 質(zhì)粒pAAV-TudmiR-34a平板長出單菌落，而pAAV(-)平板沒有單菌落。
[0052] 5、酶切鑒定及測序
[0053] (1)酶切鑒定
[0054] 隨機(jī)挑取2個(gè)單菌落，搖菌挑取質(zhì)粒，使用HindllI和BglII雙酶切重組載體和 pAAV-ZsGreen-ShRNA空載體，結(jié)果見圖1。
[0055] (2)將1、2號樣品送上海生工測序，結(jié)果見圖2。
[0056] 6、大量提取重組質(zhì)粒
[0057]測序正確后，將測序正確的菌液按1:500擴(kuò)大培養(yǎng)，放37°C培養(yǎng)過夜。收集菌液，提 取質(zhì)粒，方法參考E.Z.N.A.Endo-FreePlasmidMaxKitSpin說明書。
[0058] 7、包裝腺相關(guān)病毒AAV9
[0059] 按照AAV病毒包裝試劑盒說明書步驟將重組質(zhì)粒pAAV-TudmiR-34a、PAAV-GFP(對 照）分別和AAV2/9、pHELP質(zhì)粒共感染AAV9細(xì)胞，包裝腺相關(guān)病毒，24h觀察細(xì)胞的狀態(tài)和熒 光強(qiáng)度，結(jié)果見圖3。481!收集病毒上清，并超速離心純化病毒，最后將純化的病毒用PBS溶 解，定量分析。
[0060] 8、病毒滴度檢測
[0061] (1)取20ul濃縮病毒液，加入lulRNAse-freeDNAse，混勻，37°C水浴反應(yīng)30min。
[0062](2)4°C，12000rpm，離心lOmin，取 10ul上清到另一個(gè)無菌的 1.5mlEP管中。
[0063] (3)加入90ulDilutionBuffer(lmMTris-HCl，pH8.0,0.1mMEDTA，150mM NaCl)，混勻，100°C金屬浴反應(yīng)lOmin。
[0064] (4)自然冷卻至室溫，加入1u1蛋白酶K，37°C水浴反應(yīng)1h。
[0065] (5)100°C金屬浴反應(yīng)lOmin，自然冷卻至室溫。
[0066] (6)將上述樣品稀釋后用做Q-PCR模板，定量分析病毒滴度。
[0067]rAAV9-tudmiRNA-34A：1.7xl012vg/ml