基因重組桿狀病毒的構建方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域，尤其設及一種TGEV S2基因重組桿狀病毒的構建 方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 豬傳染性胃腸炎（Porcine transmiss;Lble gastroenteritis,TGE)是由豬傳染性 胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一種W嚴重 腹瀉、嘔吐和脫水為臨床癥狀的高度傳染性疾病，主要侵害2周齡W內(nèi)的仔豬，死亡率高達 100%，各階段的豬都易感，給養(yǎng)豬業(yè)造成了不可估量的損失。五、六十年代該病開始在我國 有相關報道，近年來我國各個地方時有該病發(fā)生。當前還沒有特別有效的藥物來醫(yī)治該病， 主要依靠接種疫苗來進行防控。TGEV主要是通過消化道粘膜和呼吸道粘膜感染易感豬群， 可見腸道粘膜免疫誘導的SIgA能夠有效抵御TGEV感染。因此，研究一種有效刺激機體免疫 系統(tǒng)產(chǎn)生粘膜免疫應答的新型疫苗，對TGE的防治具有重要意義。TGEV S蛋白具有主要的B 淋己細胞抗原決定簇，唯一誘導機體產(chǎn)生中和抗體并提供免疫保護作用的;且S蛋白含有宿 主細胞氨膚酶受體(pAPN)的識別位點。因此在研究TGEV基因工程疫苗時將S基因作為首選 祀基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種TGEV S2基因重組桿狀病毒的構建方法及其應用，旨 在W桿狀病毒為載體，表達TGEV主要抗原表位基因 S2，將重組桿狀病毒口服和肌注免疫小 鼠，檢測小鼠糞便中的sIgA和血清中的IgG水平，試驗結果初步證明重組桿狀病毒可誘導 小鼠產(chǎn)生粘膜免疫和體液免疫應答。
[0004] 本發(fā)明是運樣實現(xiàn)的，一種TGEV S2基因重組桿狀病毒的構建方法，所述TGEV S2基 因重組桿狀病毒的構建方法包括：
[0005] S2基因的擴增，用TGEV感染ST細胞，37°C培養(yǎng)4她，反復凍融，10000巧m/min離屯、 lOmin，收集上清，利用RNAiso plus方法提取病毒總RNA，按照體系進行擴增；
[0006] 重組轉移載體的構建，將回收的S2基因和炸as巧ac?Dual質(zhì)粒經(jīng)EcoR巧日Sail雙酶 切后連接，S2基因定向克隆于pFastBac?Dual的化啟動子下游，構建重組轉移載體 pFastBac?Dual-S2,轉化D冊日，經(jīng)PCR鑒定，將初步鑒定為陽性的質(zhì)粒進行測序，用DNAstar 軟件分析插入片段的正確性；
[0007] 重組Bacmid質(zhì)粒的構建與鑒定，取扣L重組供體質(zhì)粒pFas巧ac?Dual-S2,將其轉入 E.coliDHlOBac感受態(tài)細胞，在含卡那霉素（50μg/ml)、慶大霉素（化g/ml)、四環(huán)素（1化邑/ ml)、X-gal (100μg/ml)和IPTG(40μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C避光培養(yǎng)48h，挑取白色較 大的單個菌落，培養(yǎng)過夜，按照化reLink? fliF>ure Plasmid DNA化rification Kits的操 作手冊提取穿梭質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR鑒定后，將陽性重組穿梭載體命名為Bacmid-S2,用于轉染 S巧細胞；
[000引重組桿狀病毒的獲得及鑒定，將鑒定為陽性的Bacmid-S2利用CellfectinR π Reagent轉染sf 9昆蟲細胞，27°C，5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)直至出現(xiàn)病變，收獲細胞上清，進行PCR 鑒定，將上清液在sf 9昆蟲細胞盲傳3代，重組病毒命名為巧acmid-S2;
[0009] SDS-PAGE檢測，分別用巧acmid-S2P3代毒、野生桿狀病毒P3代毒感染Sf9細胞，27 °C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，反復凍融，10000巧m/min離屯、約lOmin，分別收集上清液和沉 淀，配制分離膠和濃縮膠。
[0010] 進一步，所述TGEV S2基因重組桿狀病毒的構建方法選擇一對M13通用引物：
[0011] S2上游引物:5 ' -ACTGAATTCATG TCATTGAACACAACGGGT-3 '，其5 ' 端斜體下劃線部分 設計有EcoRI酶切位點；
[0012] S2下游引物：5 '-CGTGTCGACTAAGCCACTAAGTAGCGTCCT-3 '，其5 ' 端斜體下劃線部分 設計有Sail酶切位點；
[0013] 113上游引物:5'-〔0：461^4〔64〔6176了4444〔6-3'；
[0014]
[0015] 進一步，按照W下體系進行擴增：RT:MgCl2 化U10XRT Buffer 化L、RNase Free 出0 1.75yL、dNTP Mixture lyL、RNase Inhibitor 0.25yL、AMV Reverse Transcriptase 0.扣L、Random 9mers化L、RNA模板化L、TGEV S2下游引物0.扣L。反應條件為30°C10min，42 °C30min，95°C5min，5°C5min;
[0016] PCR反應體系：上、下游引物各0.化UTaKaRa Ex Taq HS 0.5^、5ΧΡ〔Κ Buffer lOyL、模板化L，用dd 出0補至50化，反應條件為94°C3min，94°C30s，55°C30s，72°Clmin30s， 30個循環(huán)；72°C延伸lOmin，擴增產(chǎn)物與克隆載體pMDlS-T連接，WpMD18-T-S2質(zhì)粒為模板， 擴增S2基因，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0017] 進一步，配制分離膠和濃縮膠的方法如下：
[001引分別取上清及沉淀于離屯、管中，按比例加入5 X SDS Loading Buffer，混勻煮沸 lOmin后，瞬時離屯、，制成蛋白樣品，小屯、拔去梳子，組裝好電泳裝置；
[0019]在樣品槽中各加入20化樣品，加樣完畢后，連接電泳儀，先將電流巧制在8mA，20 ~30min;當漠酪藍指示劑到達分離膠之后，將電流調(diào)至16mA，保持電流穩(wěn)定；
[0020] 當漠酪藍指示劑遷移至前沿時即可停止電泳，1~化，電泳結束后，取膠，使用 0.25 %的考馬斯亮藍染液染色30min，棄去染色液，用蒸饋水漂洗數(shù)次，加入脫色液進行脫 色過夜，期間更換脫色液，直至蛋白質(zhì)帶清晰為止，觀察對比條帶，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[0021] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述TGEV S2基因重組桿狀病毒的構建方法的 TGEV S2基因重組桿狀病毒在誘導機體免疫中的應用。
[0022] 本發(fā)明提供的TGEV S2基因重組桿狀病毒的構建方法及其應用，利用桿狀病毒表 達系統(tǒng)表達TGEV S2基因，獲得重組桿狀病毒，將其經(jīng)肌肉、口服免疫小鼠，分別于免疫前與 免疫后14、28、42d收集小鼠糞便和血清，ELISA方法檢測糞便中抗TGEV sIgA和血清中抗 TGEV sIgG水平，結果顯示，口服組28d，sIgA抗體水平最高，之后隨著時間延長抗體水平逐 漸下降?？诜M和肌注組42d，血清中抗TGEV sIgG仍維持較高水平。實驗結果證實了重組 TGEV S2基因的桿狀病毒可誘導小鼠產(chǎn)生粘膜免疫和體液免疫應答，為研究新型TGEV基因 疫苗探索了新途徑。
【附圖說明】
[0023] 圖1是本發(fā)明實施例提供的TGEV S2基因重組桿狀病毒的構建方法流程圖。
[0024] 圖2是本發(fā)明實施例提供的S2基因擴增片段電泳圖；
[0025] 圖中：M.DL6000 DNA Marker;1.S2基因 PCR產(chǎn)物。
[0026] 圖3是本發(fā)明實施例提供的S2基因擴增片段電泳圖；
[0027] 圖中：M.DL6000 DNA Marker;1.S2基因 PCR產(chǎn)物。
[002引圖4是本發(fā)明實施例提供的組穿梭質(zhì)粒Bacmid-S2的PCR鑒定示意圖；
[0029] 圖中：M.DL6000 DNA 1日濁6';1.]?13片段口0?產(chǎn)物。
[0030] 圖5是本發(fā)明實施例提供的巧acmid-S2蛋白質(zhì)電泳示意圖；
[0031] 圖中：Μ:蛋白Marker; 1:野生桿狀病毒細胞沉淀；2:野生桿狀病毒細胞上清；3:正 常細胞沉淀；4:正常細胞上清；5: rBacmid-S2細胞沉淀；6: rBacmi d-S2細胞上清。
[0032] 圖6是本發(fā)明實施例提供的重組桿狀病毒rBacmid-S2免疫小鼠糞便特異性抗體 IgA示意圖。
[0033] 圖7是本發(fā)明實施例提供的重組桿狀病毒rBacmid-S2免疫小鼠血清特異性抗體 IgG示意圖。
【具體實施方式】
[0034] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，W下結合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0035] 本發(fā)明利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達TGEV S2基因，獲得重組桿狀病毒，將其經(jīng)肌 肉、口服免疫小鼠，檢測重組桿狀病毒誘導小鼠機體產(chǎn)生體液免疫和粘膜免疫應答效果，為 新型TGEV基因疫苗探索了新途徑。
[0036] 下面結合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。
[0037] 如圖1所示，本發(fā)明實施例的