一種中試化生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒的新技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明專利涉及一種中試化生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒的新技術(shù)，尤其涉及一種利用 WAVE波浪式生物反應(yīng)器進(jìn)行293系列細(xì)胞微載體培養(yǎng)和重組腺相關(guān)病毒包裝實現(xiàn)病毒中 試化生產(chǎn)的技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺相關(guān)病毒（Adeno associated virus, AAV)是目前世界公認(rèn)的安全，可靠的基因 傳遞載體，已在眾多臨床研究和應(yīng)用中得到進(jìn)一步的見證，包括帕金森病和阿爾茨海默病 在內(nèi)的一些腦部疾病、血友病、肌肉萎縮、心臟衰竭乳腺癌、肺癌等腫瘤和先天性失明眼疾 病中都有很好地治療。
[0003] 近兩年來國家自然科學(xué)基金涉及基因治療的技術(shù)方法中有關(guān)AAV的研究比例上 升3~5倍之多。以及一些如中國人民解放軍總醫(yī)院、西南醫(yī)院、云南省腫瘤醫(yī)院、上海腫 瘤醫(yī)院等大型醫(yī)院對AAV載體基因治療臨床方案和生產(chǎn)應(yīng)用均具有強烈的市場需求；同時 國內(nèi)一些藥物研發(fā)企業(yè)已有AAV治療方案，且已進(jìn)入大規(guī)模動物體內(nèi)實驗階段或臨床前藥 物階段。由此看來，未來幾年隨著全球大型藥企的新藥逐步大量進(jìn)入臨床階段而推向市場， 以及國內(nèi)藥企的新藥研究也將陸續(xù)進(jìn)入大動物（狗和猴）體內(nèi)給藥實驗階段和臨床前試驗 階段。因此，對AAV基因載體的市場需求將呈爆發(fā)式增長。
[0004] 目前，腺相關(guān)病毒載體的生產(chǎn)多是利用轉(zhuǎn)瓶方式進(jìn)行病毒包裝細(xì)胞的培養(yǎng)，然后 實施手動細(xì)胞轉(zhuǎn)染來完成病毒包裝。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞增殖緩慢且生產(chǎn)過程中對細(xì)胞的培養(yǎng)條 件如pH，通氣溶氧、培養(yǎng)液成分等難以監(jiān)控和適時補給，無法提供細(xì)胞最適增殖條件，勞動 強度大，自動化程度低；手動細(xì)胞轉(zhuǎn)染容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)染不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染效率低等情況易產(chǎn)生認(rèn)為 誤差。再加上轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時培養(yǎng)條件的不可控性，導(dǎo)致批量間細(xì)胞活力差異性大、不穩(wěn)定等， 易引起病毒包裝生產(chǎn)過程中出現(xiàn)產(chǎn)病毒的滴度低或者不產(chǎn)毒現(xiàn)象。此外，利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)和 人工手動細(xì)胞轉(zhuǎn)染不適合大批量生產(chǎn)病毒載體，如要實現(xiàn)病毒的大量生產(chǎn)只能通過增加轉(zhuǎn) 瓶數(shù)量的方法，結(jié)果導(dǎo)致車間規(guī)模、設(shè)備、人員的大量投入。而用生物反應(yīng)器進(jìn)行病毒包裝 細(xì)胞培養(yǎng)則可以克服上述的不足，同時在生物反應(yīng)器內(nèi)實施病毒包裝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染過程，不 僅充分提高了生物反應(yīng)器的利用效率，也增加了設(shè)備的生產(chǎn)能力，更加有利于實現(xiàn)病毒載 體的中試化生產(chǎn)。
[0005] WAVE波浪式生物反應(yīng)器采用非介入式的波浪混合方式，提供溫和低剪切力高溶氧 的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，有利于提高細(xì)胞密度、改善細(xì)胞狀態(tài)，易于線性放大。無菌細(xì)胞培養(yǎng)袋 培養(yǎng)體積靈活、操作簡單、有效降低污染風(fēng)險，從而縮短工藝開發(fā)周期，提高產(chǎn)能。
[0006] 采用WAVE波浪式生物反應(yīng)器進(jìn)行重組腺相關(guān)病毒包裝細(xì)胞培養(yǎng)和病毒細(xì)胞的轉(zhuǎn) 染以實現(xiàn)中試化生產(chǎn)病毒。其中所使用的微載體類型、加入的微載體含量，細(xì)胞接種密度， 培養(yǎng)袋中培養(yǎng)液的體積以及培養(yǎng)袋的搖動轉(zhuǎn)速等均影響到病毒包裝細(xì)胞的生理活性，進(jìn)而 影響到后續(xù)的病毒產(chǎn)毒能力和產(chǎn)毒效率，在生產(chǎn)實踐中需要對上述培養(yǎng)技術(shù)和條件進(jìn)行優(yōu) 化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明專利的目的是利用WAVE波浪式生物反應(yīng)器進(jìn)行微載體培養(yǎng)293系列病毒 包裝細(xì)胞來中試化生產(chǎn)重組腺相關(guān)病毒的技術(shù)。該技術(shù)通過對所使用的微載體類型、加入 的微載體含量，細(xì)胞的接種密度，培養(yǎng)袋中培養(yǎng)液的體積以及培養(yǎng)袋搖動的轉(zhuǎn)速等進(jìn)行優(yōu) 化，有效地保持細(xì)胞穩(wěn)定性，提高病毒的滴度和產(chǎn)毒效率，滿足更廣大客戶需求，節(jié)省大量 人力資源的消耗。
[0008] 本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0009] 一種利用WAVE波浪式生物反應(yīng)器進(jìn)行293系列病毒包裝細(xì)胞微載體培養(yǎng)實現(xiàn)重 組腺相關(guān)病毒中試化生產(chǎn)的新技術(shù)，包括：（1)細(xì)胞培養(yǎng)：將293系列細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng) 袋中的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；(2)病毒包裝：沉降微載體， 加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑和病毒包裝所用三質(zhì)粒體系，進(jìn)行共轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng) 細(xì)胞實現(xiàn)病毒包裝；（3)病毒分離與純化：細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心、抽濾或過濾的形式 收集上清，利用AKTA蛋白核酸層析系統(tǒng)進(jìn)行病毒的分離純化；(4)病毒滴度測定：利用熒光 定量實時PCR儀檢測病毒的基因組拷貝數(shù)來測定病毒滴度。
[0010] 采用WAVE波浪式生物反應(yīng)器培養(yǎng)293系列細(xì)胞時，培養(yǎng)袋中培養(yǎng)液的裝液量影響 細(xì)胞培養(yǎng)過程中的溶氧；搖動培養(yǎng)參數(shù)對于細(xì)胞在微載體上的吸附以及細(xì)胞生長有明顯的 影響，為了確定最適宜的裝液量和搖動培養(yǎng)參數(shù)，本發(fā)明對培養(yǎng)袋中培養(yǎng)液的裝液量、搖動 培養(yǎng)時的擺動角度以及擺動速度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化考察，觀察不同的培養(yǎng)條件對細(xì)胞生長 的影響。通過實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液的裝液量為50%~65% (v/v) WAVE擺動角度是8~15°， 擺動速度是10~15rpm時，細(xì)胞生長狀態(tài)最佳，細(xì)胞產(chǎn)量最高。
[0011] 微載體類型影響細(xì)胞與微載體間的吸附作用力，細(xì)胞只有被吸附方可實現(xiàn)增殖； 同種材料的微載體不同粒徑影響微載體的比表面積，影響吸附細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)而影響細(xì)胞的 生長特性。Cytodexl 適用于通用微載體培養(yǎng)（general purpose microcarrier culture)， 尤其適用于大多數(shù)已建立的細(xì)胞系（established cell lines)。Cytodex2適用于病毒，原 代細(xì)胞或成纖維二倍體細(xì)胞的培養(yǎng)；CytodeX3是用于某些難以生長的細(xì)胞、分化細(xì)胞培養(yǎng) 系統(tǒng)、尤其是具有上皮樣形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞的首選微載體。
[0012] 在固定每克微載體接種相同細(xì)胞數(shù)的前提下，本發(fā)明考察微載體Cytodex 1、 Cytodex 2和Cytodex 3對細(xì)胞生長的影響，確定適合的微載體為Cytodex 1和Cytodex 3〇
[0013] 此外，細(xì)胞接種密度與微載體含量對細(xì)胞生長也有顯著影響，其中重要的是細(xì)胞 接種密度與微載體的比例關(guān)系。本發(fā)明考察微載體Cytodex 1和Cytodex 3,用量均設(shè)置 為 lg/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，細(xì)胞接種密度設(shè)置為 1 X 105個 /mL，3 X 10 5個 /mL, 5 X 105個 /mL, 7 X 10 5個 /mL, 1 X 10 6個 /mL, 3 X 10 6個 /mL, 5 X 10 6個 /mL,確定細(xì)胞接 種密度為3X 105~1 X 10 6個/mL，微載體的用量為2~5g/L時，細(xì)胞生長密度較高。
[0014] 利用實用新型專利（CN201520715680. 5)中提到的一種用于實現(xiàn)磷酸鈣法快速批 量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裝置，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑和病毒包裝所用三質(zhì)粒系統(tǒng)適當(dāng)比例混合，然后再 將混合液栗入WAVE反應(yīng)器內(nèi)與所培養(yǎng)的病毒包裝細(xì)胞混合進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)，并 完成病毒包裝，獲得高滴度的病毒。
[0015] 利用AKTA purel50蛋白核酸層析系統(tǒng)進(jìn)行病毒的分離純化，獲得高純度的病毒。
[0016] 本發(fā)明技術(shù)優(yōu)化了重組腺相關(guān)病毒中試化生產(chǎn)的工藝參數(shù)，提高了 293系列病毒 包裝細(xì)胞的培養(yǎng)效率，進(jìn)行了病毒包裝細(xì)胞的半自動化批量轉(zhuǎn)染，獲得了高滴度、高純度的 重組腺相關(guān)病毒，實現(xiàn)了病毒的中試化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為WAVE反應(yīng)器微載體培養(yǎng)293系列細(xì)胞光學(xué)顯微鏡圖（放大倍數(shù)為10 X 10)
[0018] 圖2為293系列包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染后白光顯微鏡圖（放大倍數(shù)為4X 10)
[0019] 圖3為293系列包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡圖（放大倍數(shù)為4X 10)
[0020] 圖4重組腺相關(guān)病毒AKTA分離純化圖
【具體實施方式】
[0021] 結(jié)合具體實施方案進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實施例僅為范例性，并不對本發(fā)明的 范圍構(gòu)成任何限