重組質(zhì)粒、重組病毒載體、重組病毒毒株及其應用、重組蛋白及含有該蛋白的亞單位疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物基因工程與動物病毒學技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及重組質(zhì)粒、重組病毒 載體、重組病毒毒株及其應用、重組蛋白及含有該蛋白的亞單位疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)是一種嚴重危害豬群的病毒病。主要特征表現(xiàn)母豬 繁殖障礙及育肥豬和小豬呼吸困難。GP5是PRRSV重要的糖蛋白，能夠誘導中和抗體產(chǎn)生及 免疫保護。因此作為研究對抗PRRS的基因工程疫苗的主要靶位點。雖然滅活和修飾后的 活疫苗可以利用，但是其保護性不再完整。因此為了研究對抗PRRSV感染的有效疫苗，須發(fā) 展一種新的技術(shù)。
[0003] 作為RNA病毒，PRRSV的基因在合成時容易出現(xiàn)內(nèi)在性錯誤，滅活疫苗誘導細胞免 疫的能力較弱，產(chǎn)生的保護作用較短，藍耳病還存在"抗體依賴性增強作用"。因此用于發(fā) 展預防PRRS的滅活疫苗和弱毒疫苗都存在一定的弊端?；诖?，利用基因工程方法研制 PRRSV的亞單位疫苗具有更好的免疫原性，將成為防治該病的重要方向。因此，該亞單位疫 苗在豬藍耳病的防制方面將具有很廣泛的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供重組質(zhì)粒、重組病毒載體、重組病毒毒株及其應用、重組蛋 白及含有該蛋白的亞單位疫苗。該重組病毒毒株高效表達豬藍耳病病毒GP5蛋白，使其具 有更好的免疫原性，并且制得了免疫效果好的亞單位疫苗。
[0005] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，由具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的PRRSV GP5 基因片段與質(zhì)粒載體重組構(gòu)建而成。
[0007] 根據(jù)PRRSV GP5基因序列，利用PCR擴增結(jié)合DNA拼接、克隆的方法（參見：J.薩 姆布魯克等，王嘉等譯.分子克隆實驗指南（第三版），科學出版社，2002年版）對0RF基因 進行修飾，通過PCR方法去除GP5基因其N端信號肽的31個氨基酸。將GP5基因插入到桿 狀病毒表達載體中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。引物A1(如SEQ ID No. 5所示核苷酸序列）、A2(如 SEQ ID No. 6所示核苷酸序列）用于擴增GP64編碼的序列；引物B1(如SEQ ID No. 7所示 核苷酸序列）、B2(如SEQ ID No. 8所示核苷酸序列）用于擴增GP64 TM-CTD編碼的序列； 引物C1(如SEQ ID No. 2所示核苷酸序列）、C2(如SEQ ID No. 3所示核苷酸序列）用于擴 增PRRSV-0RF5基因，獲得目的片段。
[0008] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，重組質(zhì)粒中所述PRRSV GP5基因片段的擴增引 物組由如SEQIDNo. 2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQIDNo. 3所示核苷酸序列的下 游引物組成。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種重組病毒載體，其由具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的 PRRSV GP5基因片段與病毒載體重組構(gòu)建而成。
[0010] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，重組病毒載體中所述PRRSV GP5基因片段的擴 增引物組由如SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID No. 3所示核苷酸序列 的下游引物組成。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，重組病毒載體中所述病毒載體為昆蟲桿狀病毒 表達質(zhì)粒載體。
[0012] 在本發(fā)明中，構(gòu)建了一種新型的pBacSC載體。編碼gp64 SS，HIS6的序列、多克隆 位點（BssH II，Nco I位，NHE位和Sph I位）集中在HIS6與桿狀病毒gp64 CTD之間，桿狀 病毒細胞進入是通過gp64蛋白介導，在宿主細胞表達后，gp64蛋白SS直接穿過細胞膜，并 以三聚體的形式出現(xiàn)于受感染細胞表面，該融合蛋白的表達與本體的糖蛋白gp64啟動后， 轉(zhuǎn)入質(zhì)膜，進入桿狀病毒包膜內(nèi)。以假型桿狀病毒作為一個潛在的疫苗傳遞系統(tǒng)的方法已 被廣泛使用。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種重組病毒毒株，由本發(fā)明提供的上述重組病毒載體經(jīng)包裝細 胞包裝而成。
[0014] 本發(fā)明首先擴增PRRSV-0RF5基因，獲得507bp目的基因片段（如SEQ ID No. 1所 示核苷酸序列），將其與昆蟲桿狀病毒表達載體質(zhì)粒連接，通過酶切反應鑒定及序列分析得 到重組表達質(zhì)粒；測序表明，擴增得到507bp的PRRSV-0RF5基因，與已發(fā)表的PCV2序列同 源性達到97%以上，表明該基因具有很高的保守性。將所得到的重組表達質(zhì)粒與線性化桿 狀病毒DNA共浴，加入細胞轉(zhuǎn)染試劑，取轉(zhuǎn)感細胞培養(yǎng)上清做蝕斑克隆與篩選試驗，采用病 毒培養(yǎng)物上清，接種昆蟲細胞，篩選獲得一株穩(wěn)定、高效表達PRRSV-GP5蛋白的重組桿狀病 毒毒株（BacSC-Dual-GP5)。
[0015] 本發(fā)明提供的病毒株的生物保藏編號為CGMCC No. 2467或CGMCC No. 2657。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，包裝細胞為昆蟲細胞，優(yōu)選為sf-9細胞。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述重組桿狀病毒毒株在制備預防和/或治療PRRSV感染相關(guān)疾 病的藥物制劑的應用。
[0018] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，上述重組桿狀病毒毒株在制備預防和/或治療 PRRSV感染相關(guān)疾病的藥物制劑應用中，所述PRRSV感染相關(guān)疾病為豬繁殖與呼吸綜合征。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述重組病毒毒株表達的重組蛋白。
[0020] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0021] 本發(fā)明重組毒株所表達的重組蛋白除去融合部分，其產(chǎn)物表達產(chǎn)量比未用桿狀病 毒做載體的高30%。由于本發(fā)明在重組蛋白的C末端設計了 His-6序列，該序列具有強烈 的親和作用，該序列被加在表達的蛋白的兩端，容易在親和層析柱中洗脫下來，達到較好的 分離效果。為下一步重組蛋白的純化奠定了基礎。
[0022] 該重組毒株可以在昆蟲細胞高效表達重組PRRSV-GP5蛋白，所表達的重組 PRRSV-GP5蛋白具有良好的免疫反應活性，可作為豬藍耳病病毒亞單位疫苗。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種亞單位疫苗，其包含：
[0024] (I)如上述重組病毒毒株表達的重組蛋白或與其同源性達80%以上的蛋白；
[0025] 和 / 或
[0026] (II)如上述重組蛋白或與其同源性達80%以上的蛋白。
[0027] 本發(fā)明構(gòu)建了一種高效表達豬藍耳病病毒GP5蛋白的重組桿狀病毒毒株 BacSC-Dual-GP5,使其具有更好的免疫原性。本發(fā)明重組毒株所表達的重組蛋白除去融合 部分，其產(chǎn)物表達產(chǎn)量非常高。此外，本發(fā)明在重組蛋白的C末端設計了 His-6序列，該序 列具有強烈的親和作用，被加在表達蛋白的兩端，容易在親和層析柱中洗脫下來，達到較好 的分離效果，為下一步重組蛋白純化奠定基礎。用研制的PRRSV-GP5亞單位疫苗制品對本 動物是安全的。疫苗免疫效力試驗結(jié)果表明，所有疫苗免疫后28天抗體檢測全部轉(zhuǎn)陽；強 毒攻擊試驗結(jié)果表明，lml和2ml免疫組均獲得100 %保護，0. 5ml組獲得80% (4/5)保護。
[0028] 生物保藏說明
[0029] 重組桿狀病毒BacSC-Dual-GP5。保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為 CGMCC No. 2467〇
【附圖說明】
[0030] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0031] 圖1示藍白斑篩選重組桿狀病毒的結(jié)果；其中，圖1(A)示野生型桿狀病毒包涵體； 圖1 (B)示重組型桿狀病毒（藍斑）；
[0032] 圖2示重組毒株感染sf-9細胞后形成的病毒包涵體；其中，E示野生型桿狀病毒 包涵體；F示重組桿狀病毒包涵體；
[0033] 圖3示重組PRRSV-GP5蛋白用親和層析柱純化結(jié)果；其中，M :蛋白分子量標記物； L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8 分別為：96h、72h、60h、48h、36h、24h、12h、6h 的表達產(chǎn)物結(jié)果；
[0034] 圖4示表達產(chǎn)物的Western blot分析結(jié)果；
[0035] 圖5示本發(fā)明獲得的重組質(zhì)粒圖譜。
【具體實施方式】
[0036] 本發(fā)明公開了重組質(zhì)粒、重組病毒載體、重組病毒毒株及其應用、重組蛋白及含有 該蛋白的亞單位疫苗，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需 要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為 包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在 不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合， 來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。
[0037] 本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒、重組病毒載體、重組病毒毒株及其應用、重組蛋白及含有 該蛋白的亞單位疫苗中所用原料及試劑均可由市場購得。
[0038] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0039] 實施例1 :本發(fā)明重組桿狀病毒（BacSC-Dual_GP5)的構(gòu)建和重組蛋白的表達
[0040] 1材料與方法
[0041] 1. 1病毒、細胞及抗血清
[0042] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株：系由吉林大學動物醫(yī)學學院傳染病教研室丁壯教 授贈送。細胞培養(yǎng)采用01^11培養(yǎng)液，添加8-12%胎牛血清和1001]/1111青霉素及100 1^/1111 鏈霉素。按常規(guī)方法進行細胞培養(yǎng)，接種病毒當Marc-145細胞長到培養(yǎng)表面單層75-80% 時，細胞傳代效果好（蘭海楠，趙小麗，et al.豬藍耳病CH-IR株（PRRSV-CH-IR)在侯腎細 胞（marc-145)中的培養(yǎng)[J].動物傳染病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生，2008. 231-234)。利用Grace氏 昆蟲細胞培養(yǎng)基和昆蟲sf-9細胞在27°C環(huán)境中培養(yǎng)桿狀病毒載體，同時添加胎牛血清、同 時添加10 %、l〇〇U/ml青霉素及100 y g/ml鏈霉素。
[0043] 1. 2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0044] PRRSV-0RF5基因序列擴增：取100 y 1病毒培養(yǎng)物，加入2 y 1蛋白酶K(20mg/ml) 于37°C消化2h，經(jīng)水浴煮沸5min，12000r/min離心10min，取上清用于DNA擴增。引物A1 (如 SEQ ID No. 5所示核苷