重組人源性抗菌肽c16ll-37及其對變異鏈球菌生物活性作用的應用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物工程技術領域，是一種重組人源性抗菌肽C16LL?37及其對變異鏈球菌生物活性作用的應用方法，對重組抗菌肽C16LL?37的抗菌活性、靶向性、溶血性等各項生物活性分析應用。采用標準固相合成技術合成，將人源性抗菌肽LL?37的氨基酸序列與變異鏈球菌CSP的C端16個氨基酸序列CSPC16通過連接體?GGG?連接，合成特異性靶向能力的重組人源性抗菌肽C16LL?37。綜上所述，人源性特異性靶向抗菌肽C16LL?37的研發(fā)不僅解決了天然抗菌肽抗菌譜廣、易產(chǎn)生耐藥性、生物效能低、篩選難度高等問題，而且克服了化學合成抗菌肽化學結合效率低、融合性蛋白不穩(wěn)定等缺點。此外，C16LL?37的AMP區(qū)域來源于人體，較高的生物安全性為其今后在臨床的廣泛應用奠定了堅實基礎。
【專利說明】
重組人源性抗菌肽C16LL-37及其對變異鏈球菌生物活性作用 的應用方法
技術領域
[00011本發(fā)明涉及生物工程技術領域，是一種重組人源性抗菌肽C16LL-37及其對變異鏈 球菌生物活性作用的應用方法，對重組抗菌肽Cl 6LL-37的抗菌活性、靶向性、溶血性等各項 生物活性分析應用。
【背景技術】
[0002] 變異鏈球菌（Streptococcus mutans，SM)為人類離病的最主要致病菌，抑制變異 鏈球菌的增殖對阻斷齲病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。目前，臨床常用的抗齲藥物如氯己定、 氟制劑、銀離子制劑等均為化學合成抗生素，具有廣譜的抗菌活性，長期使用易導致耐藥菌 株增多及口腔菌群失衡等不良后果。
[0003] 天然抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMP)是一種具有生物活性的小分子多肽， 種類繁多，作用迅速，為機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。AMP主要通過破壞細菌細胞膜，使其 內(nèi)容物外溢導致細菌死亡，這一獨特的抗菌機制賦予了其不易產(chǎn)生耐藥性、對大多耐藥微 生物仍具顯著抗菌活性的優(yōu)勢。但因 AMP具備廣譜的抗菌活性，無法針對特定病原菌發(fā)揮抑 制作用，易造成口腔生態(tài)系統(tǒng)失衡等不良后果。此外，AMP還存在生物效能低、篩選難度高、 蛋白水解不穩(wěn)定等缺點。以上問題的出現(xiàn)伴隨著耐藥致病菌日益增多，研發(fā)一種可針對某 種病原菌發(fā)揮顯著抑菌活性的抗菌肽尤為迫切。
[0004] 1995年，研究者首次發(fā)現(xiàn)天然抗菌肽LL-37廣泛分布于人體，如皮膚、口腔、精液及 創(chuàng)傷部位等，是迄今為止唯一被發(fā)現(xiàn)的cathelicidins家族抗菌肽，也是人體內(nèi)唯一的α-螺 旋結構抗菌肽。作為人源性抗菌肽，LL-37不僅具備極高的生物安全性，且與其它AMP相似， 其獨特的抗菌機制不易導致病原菌發(fā)生抗性突變。因此，LL-37可作為新型抗生素設計、合 成的理想模板和分子骨架。
[0005] 特異性革巴向抗菌肽（Specifically Targeted AntiMicrobial Peptides, STAMPS)由靶向定位區(qū)域(KH)、抗菌區(qū)域(AMP)和(或)連接體區(qū)域組成。STAMPS通過KH區(qū)域 增高目標細菌表面AMP濃度，使抗菌肽的殺傷效力及動態(tài)性能全面提升。Eckert等以變異鏈 球菌非依賴感受態(tài)刺激肽（competence stimulating peptide，CSP)C端16個氨基酸序列 (TFFRLFNRSFTQALGK)即CSPcl6作為STAMP的KH區(qū)域，通過連接體（-GGG-)與抗生素 novispirin G2連接合成新型抗菌肽C16G2。研究發(fā)現(xiàn)，C16G2抗菌活性強，且對變異鏈球菌 有顯著的祀向特異性。然而，novispirin G2作為一種化學合成抗生素，具有一定的細胞毒 性。因此，C16G2能否長期安全的應用于臨床還需進一步考證。
[0006] 本研究擬以LL-37為AMP區(qū)域，以變形鏈球菌CSPC16為KH區(qū)域合成一種人源性重組 抗菌肽，并對其靶向特異性、體外抗菌活性、生物安全性及穩(wěn)定性等生物學活性進行分析討 論。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種重組人源性抗菌肽C16LL-37及其對變異鏈球菌生物活性作用的 應用方法，其目的在于重組人源性抗菌肽C16LL-37對變異鏈球菌具備顯著的靶向特異性及 較強的抗菌活性，且具有較高的生物安全性及良好的穩(wěn)定性;C16LL-37主要通過破壞細菌 細胞膜使細胞內(nèi)容物外溢，導致細菌死亡。
[0008] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案為： 一種重組人源性抗菌肽C16LL-37，采用標準固相合成技術合成，其特征在于將人源性 抗菌肽LL-37的氨基酸序列為LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES與變異鏈球菌CSP 的C端16個氨基酸序列CSPC16為TFFRLFNRSFTQALGK通過連接體-GGG-連接，合成特異性靶向 能力的重組人源性抗菌肽C16LL-37為 TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2。
[0009] 2、根據(jù)權利要求1所述的重組人源性抗菌肽C16LL-37的制備方法，其特征在于包 括如下步驟： A、 樹脂的溶脹 使用前，將反應管在濃度為7.6ml/g的二氯甲烷DCM中浸泡處理5h，再稱取5g Fomc-Rink-amide-MBHA樹脂加至反應管中，沿管壁加入濃度為7.6ml/g的二氯甲烷DCM50ml，使其 將樹脂浸沒，浸泡2_3h樹脂充分溶脹后，濾去反應液保留樹脂，用質量濃度20%的N，N二甲基 甲酰胺DMF洗滌3次； B、 氨基Fmoc保護基團的脫去 氨基酸縮合之前，需將Fmoc保護基團從樹脂上脫去，向反應管中加入質量濃度25%的哌 啶溶液，并通入氮氣反應3min，濾除溶液，使用哌啶溶液反復進行5次，再用質量濃度30%的 異丙醇溶液和質量濃度20%的DMF溶液將樹脂洗滌3次，每次3min; C、 激活和交聯(lián) 按目標多肽LL-37及C16LL-37的氨基酸序列自C端向N端依次縮合氨基酸，逐一縮合每 一個氨基酸，反應時觀察樹脂是否變色，若不變色始終淡黃色代表縮合反應已完成，若變色 變?yōu)榈{色則需延長縮合時間直至變回淡黃色代表縮合反應已完成;再對氨基酸的羧基用 20ml質量濃度為90% N，N-二環(huán)己基碳二亞胺DCC進行溶脹活化，活化的氨基酸與已接在固 相載體的第一個氨基酸，氨基反應形成肽鍵，LL-37氨基酸序列為 LL⑶FFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，其C端的第一個氨基酸為L，即亮氨酸； C16LL-37的氨基酸序列為 TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2,其 C端的第 一個氨基酸為T，即蘇氨酸，將要合成的目標多肽羧基端的第一個氨基酸縮合后，在樹脂載 體上形成了含一個肽鍵的暫時的短肽為二肽，即在樹脂載體上就形成了一個帶有保護基的 二肽； D、 洗脫和脫保護 向反應管內(nèi)加入20ml質量濃度25%哌啶溶液浸沒樹脂，通入氮氣進行吹沸反應2min，重 復5次，脫去多肽鏈最后一個氨基酸的Fmoc保護基團；再向反應管加入20ml質量濃度25%乙 酸酐-哌啶溶液于室溫下處理30min，使多肽的末端氨基乙酰化，分別使用20ml質量濃度 20%的異丙醇及DFM溶液洗滌樹脂3次，用氮氣吹干樹脂； E、 分離、純化及檢測 應用反相高效液相色譜法RP_high pressure liquid chromatography-RP-HPLC分離、 利用C18反相柱純化，尺寸為柱內(nèi)徑4.6mm X柱長度250mm，填料的粒徑為5μηι，檢測波長為 220nm，并利用Mass spectroscopy對色譜分離主峰尖出現(xiàn)時的餾分進行質譜圖分析。
[0010] 所述步驟E的檢測結果為LL-37的分子質量為4493.37km，純度為95.22%; C16LL-37的分子質量為6579.77km，純度為98.87%。
[0011] 一種重組人源性抗菌肽C16LL-37對變異鏈球菌生物活性作用的應用方法，其特征 在于包括如下步驟： A、 指不細囷制備 選用變異鏈球菌ATCC 2517、粘性放線菌ATCC 15987、嗜酸乳桿菌ATCC 4356、大腸桿菌 ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923為指示菌，上述指示菌選用標準菌，在厭氧條件 下37°C恒溫搖床增殖處理12小時，增殖培養(yǎng)基選用MH培養(yǎng)基，增殖后菌落通過麥氏標準比 濁法測定濁度為0.5-1，菌落數(shù)為10 8CFU/ml，用MH培養(yǎng)基將各菌液稀釋至1 X 106CFU/ml的細 菌懸液備用； B、 抗菌肽最小抑菌濃度MIC及最小殺菌濃度MBC測試 將C16LL-37及LL-37母液進行二倍梯度稀釋法稀釋，母液濃度選用5120μπι〇1/1，分別稀 釋為 256ymol/L、128ymol/L、64ymol/L、32ymol/L、16μmol/L、8μmol/L，取各濃度抗菌肽100μ 1分別裝入無菌離心管內(nèi)，每個濃度多肽均設5組，分別加入變異鏈球菌ATCC 2517、粘性放 線菌ATCC 15987、嗜酸乳桿菌ATCC 4356、大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923充分混勻； 陰性對照組，即無抑菌活性的培養(yǎng)基，與實驗組多肽的抑菌效果進行比較，加入1〇〇μ1 ΜΗΒ培養(yǎng)基，將離心管置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育2h，將各菌液1 X 103倍稀釋后均勻涂布于ΜΗ 瓊脂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育16-18h，利用菌落計數(shù)儀計數(shù)； C、 C16LL-37對變異鏈球菌靶向特異性的測定 將濃度為64μπι〇1/1的C16LL-37分別加至含5種細菌懸液1 X 106CFU/ml的無菌離心管 內(nèi)，1〇〇μ1/支，充分混勻，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別選30、60、120 mins為兩種抗菌肽 作用觀察時間點，取每組樣品1〇μ1并行IX 1〇3倍稀釋后，再取各樣品30μ1分別均勻涂布于 ΜΗΑ瓊脂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育16-18h，利用菌落計數(shù)儀計數(shù)，并計算各組細菌的 存活率，菌落計數(shù)法同上； D、 時間-殺菌實驗 分別取步驟B中濃度128口111〇1凡、64口1]1〇1凡、32口1]1〇1凡的(]161^-37抗菌肽100口1裝入無菌 離心管內(nèi)，分別加入含1〇〇μ1濃度1 X l〇6CFU/ml的變異鏈球菌細菌懸液，充分混勻； MHB培養(yǎng)基為陰性對照組，將離心管置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱孵育，分別于0、30、60、90、 120、150mins時作用觀察時間點，取每組樣品10μ1并行1X103倍稀釋后，再取各樣品30μ1分 別均勻涂布于ΜΗΑ瓊脂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育16-18h，利用菌落計數(shù)儀計數(shù)，計算 各組細菌的存活率，并對菌落計數(shù)。
[0012] E、溶血實驗 取健康人體新鮮靜脈血分裝至含質量濃度lg/L肝素鈉溶液的無菌離心管內(nèi)，靜脈血和 肝素鈉溶液共1.51111，離心力100(^離心處理101^11，棄上清液留存紅細胞，將1((：10.28、似(：1 8.Og、KH 2P〇4 0.2g、Na2HP〇4.12H20 3.14g等化學試劑依次溶解于含1000ml無菌去離子水中 制得PBS緩沖液，并裝入三角燒瓶內(nèi)，充分混勻，調(diào)節(jié)PH值為7，置于滅菌鍋中滅菌處理，清洗 紅細胞2-3次后，再利用roS緩沖液將紅細胞配制成體積濃度4%的懸液，加入至96孔聚苯乙 稀板內(nèi)，每孔添加 100μΙ;再將步驟B中512ymol/L、128ymol/L、64ymol/L、32ymol/L、16ymol/ USymol/L不同濃度的C16LL-37和LL-37加入至各孔內(nèi)，每孔添加 100μΙ; 陰性對照組及陽性對照組分別加入100μΙ PBS緩沖液及體積濃度0.2%聚乙二醇辛基苯 基醚TritonX-100,將各板置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育2h后，離心力1000g離心處理lOmin，取 上清1〇〇μ 1，多肽如果具有溶血活性，將紅細胞的細胞膜溶解破壞，上清液的0D值會顯著增 加，轉移置新的96孔聚苯乙烯板，利用酶標儀檢測450nm處各樣品的0D值； F、 掃描電子顯微鏡SEM觀察 設MHB培養(yǎng)基為陰性對照組，取500μ1濃度32_〇1/1的(：161^-37、32_〇1/1的LL-37及 ΜΗΒ培養(yǎng)基分別加入500μ 1變異鏈球菌懸液1 X 106CFU/ml的無菌離心管內(nèi)，充分混勻，并置 于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育2hrs，2hrs后，10000 rpm離心5min棄上清，加入步驟E中PBS緩沖液 清洗2-3次，加入體積濃度2.0%戊二醛緩沖劑并于4 °C條件下固定24h，取出各樣品，離心， 棄上清，PBS緩沖液清洗2-3次后乙醇梯度脫水，再用體積濃度100 %叔丁醇置換體積濃度 100 %乙醇2-3次后溶于體積濃度100%叔丁醇，吸取細菌-叔丁醇懸浮液滴于覆有蓋玻片 的樣品臺，放置于ES-2030形凍結真空干燥裝置冷凍干燥機，0.03pa內(nèi)真空-40 °C干燥5h，E-1010離子濺射裝置噴金，S-3400N鏡下觀察。 G、 C16LL-37的穩(wěn)定性分析 G1、不同溫度測定 64μπιο1/1 的 C16LL-37分別置于 17°C、27°C、37°C、47°C、57°C溫度下處理30min，待降至 常溫，將抗菌肽分別加入1〇〇μ1變異鏈球菌細菌懸液1 X l〇6CFU/ml的96孔聚苯乙烯板內(nèi)； G2、不同鹽濃度測定 128ymol/L的C16LL-37 50μ1分別加入100μ1變異鏈球菌懸液1 X 106CFU/ml的96孔聚苯 乙稀板內(nèi)，再分別加入50μ1的200口111〇1凡、300口1]1〇1凡、400口1]1〇1凡、800口1]1〇1凡的似(31溶液，充 分混勾，稀釋調(diào)節(jié)使 Nacl 的濃度分別為 100ymol/L、200ymol/L、300ymol/L、400ymol/L; G3、不同PH值測定 分別利用PH值為6的HCL溶液及PH值為8的NaOH緩沖液將三組64_〇1/1的C16LL-37的 PH 值調(diào)至5·5、6·5、7·5; G4、不同濃度胰蛋白酶測定 128ymol/L 的 C16LL-37 分別用不同濃度 0ymol/L、2ymol/L、20ymol/L、200ymol/L、2000y mol/L的胰蛋白酶37°C處理6h，分別加入至含100μ1變異鏈球菌細菌懸液1 X 106CFU/ml的 96孔聚苯乙烯板內(nèi)，充分混勻； 將以上61、62、63、64各組樣品分別置于37°(：恒溫培養(yǎng)箱孵育211后，利用酶標儀檢測 600nm處各組的0D值。
[0013] 所述步驟B中以濃度為256μπι〇1/1的C16LL-37為例，分別取5支無菌離心管內(nèi)100 μL該濃度多肽，分別標記為256&、25613、256(：、256(1、2566，再分別向其中加入步驟4中的細菌 懸液1〇〇μ1，分別在256a中加入變異鏈球菌ATCC 2517、256b中加入粘性放線菌ATCC 15987、 256c中加入嗜酸乳桿菌ATCC 4356、256d中加入大腸桿菌ATCC 25922和256e中加入金黃色 葡萄球菌ATCC 25923。
[0014]本發(fā)明的有益效果為： 各指示菌對C16LL-37的敏感性較LL-37略低;C16LL-37對變異鏈球菌ATCC 2517具備 顯著的靶向特異性P〈〇. 05，且隨濃度增高，抗菌活性增強，作用持續(xù)時間延長;SEM觀察，發(fā) 現(xiàn)C16LL-37處理后部分變異鏈球菌形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變，表面粗糙，可見細胞外碎肩；有效 濃度<64μΜ下，C16LL-37溶血率較低，具備較高的生物安全性;不同溫度、PH值、鹽濃度對 C16LL-37抗菌活性影響較小，但高濃度胰蛋白酶處理后，C16LL-37抗菌活性顯著降低Ρ< 0.05。重組人源性抗菌肽C16LL-37對變異鏈球菌具備顯著的靶向特異性及較強的抗菌活 性，且具有較高的生物安全性及良好的穩(wěn)定性;C16LL-37主要通過破壞細菌細胞膜使細胞 內(nèi)容物外溢，導致細菌死亡。
[0015] STAMPS由ΚΗ區(qū)域、AMP區(qū)域和（或)連接體區(qū)域組成。ΚΗ區(qū)域主要包括以下三種：1、 細菌信息素或信號肽，如腸球菌信號肽cCFlO和cOBl、變異鏈球菌密度感應系統(tǒng)CSP等；2、 化學合成的小分子多肽;3、抗菌肽自身攜帶的KH區(qū)域。變異鏈球菌作為口腔主要致齲菌，其 密度感應系統(tǒng)中由comC基因編碼的菌種間特異性信號分子非依賴感受態(tài)的刺激肽(CSP)具 有介導細菌進入基因感受態(tài)，影響細胞轉化突變、粘附聚集等重要作用。
[0016] Syvitski等通過對CSP的構效分析發(fā)現(xiàn)，CSP包含C端區(qū)域和α-螺旋結構兩個重要 的功能區(qū)域，C端去除部分氨基酸殘基后仍能競爭性的抑制變形鏈球菌UA 159的密度感應， 而被擾亂的α-螺旋結構卻不能與受體結合，此研究表明，CSP的C端區(qū)域更適合作為ΚΗ區(qū)域。
[0017] 此外，Mai等將從比目魚(Pleuronectes americanus)表皮中分離出的天然多肽 pleurocidin的變異體NRC-4的部分氨基酸片段作為AMP區(qū)域，以變異鏈球菌CSP的C端部分 氨基酸作為KH區(qū)域，成功地合成了變異鏈球菌特異性靶向抗菌肽nffi-2,并對其結構及生物 活性研究發(fā)現(xiàn)，頂B-2對變異鏈球菌具有較強的抗菌活性及顯著的靶向特異性。
[0018] LL-37為宿主天然免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，與傳統(tǒng)抗生 素不同，LL-37主要通過破壞細菌細胞膜使細胞內(nèi)容物外溢或穿過細胞膜作用于胞內(nèi)的多 聚陰離子發(fā)揮抗菌活性，這一抗菌機制使其不僅不易導致耐藥菌株的出現(xiàn)，對大部分耐藥 菌株都也具有較強的抑菌作用。LL-37作為內(nèi)源性抗菌肽，廣泛分布于人體，相對化學合成 抗生素，具有極高的生物安全性。因此，本研究選擇利用人源性抗菌肽LL-37的氨基酸序列 與變異鏈球菌CSP的C端16個氨基酸序列(CSP G16)通過連接體(-GGG-)連接，合成了特異性靶 向抗菌肽C16LL-37。
[0019]研究發(fā)現(xiàn)，C16LL-37各區(qū)域分別發(fā)揮作用，KH區(qū)域(CSPq6)可靶向誘導抗菌肽到達 目標菌即變異鏈球菌細胞表面，并與其表面受體特異性結合，細菌細胞表面抗菌肽濃度在 短時間內(nèi)急劇上升，因此，C16LL-37對變異鏈球菌的抑菌效果較其它指示菌顯著提高。然 而，LL-37為α-螺旋結構抗菌肽，其抗菌活性主要依賴α-螺旋結構的維持。LL-37與CSP C16重 組后，其螺旋結構受到一定程度的破壞，因此，C16LL-37對五種指示菌的抗菌活性均不同 程度降低，但其對變異鏈球菌的抗菌活性最強，表現(xiàn)出顯著的靶向特異性。此外，本研究通 過紅細胞溶血實驗發(fā)現(xiàn)，C16LL-37在有效劑量下溶血率甚小，即便在高濃度藥物作用下，溶 血率仍低于30%，表明C16LL-37具備較高的生物安全性，具有進一步的研究價值及臨床應用 價值。
[0020] 為初探C16LL-37的抗菌機制，本研究將C16LL-37處理后的變異鏈球菌通過SEM鏡 下觀察發(fā)現(xiàn)，部分處理后的細菌細胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變，細胞膜破壞，可見細胞外碎肩。 此現(xiàn)象進一步證實，與天然抗菌肽相似，C16LL-37也是通過破壞細菌細胞膜使細胞內(nèi)容物 外溢導致細菌死亡。因此，這一抗菌機制同樣賦予C16LL-37不易產(chǎn)生耐藥性的特點。
[0021] 口腔為牙齒的外環(huán)境與齲病的發(fā)生發(fā)展密切相關。改變口腔環(huán)境的主導因素包括 兩個方面:食物和唾液。進入口腔的食物不僅可通過自身的溫度、濕度、酸堿度等直接改變 口腔環(huán)境，還可刺激唾液腺唾分泌唾液間接改變口腔環(huán)境，其改變程度與進食頻率、食物在 口腔內(nèi)的滯留時間等息息相關。面對如此復雜多變的口腔環(huán)境，本研究已證實，Cl 6LL-37具 備較高的穩(wěn)定性，除胰蛋白酶的極度增高會影響C16LL-37的抗菌活性外，在口腔環(huán)境正常 變化范圍內(nèi)，C16LL-37可充分發(fā)揮抗菌活性。
[0022]綜上所述，人源性特異性靶向抗菌肽C16LL-37的研發(fā)不僅解決了天然抗菌肽抗菌 譜廣、易產(chǎn)生耐藥性、生物效能低、篩選難度高等問題，而且克服了化學合成抗菌肽化學結 合效率低、融合性蛋白不穩(wěn)定等缺點。此外，C16LL-37的AMP區(qū)域來源于人體，較高的生物安 全性為其今后在臨床的廣泛應用奠定了堅實基礎。
[0023] 然而，本研究選用天然抗菌肽LL-37全部(37個）的氨基酸作為AMP區(qū)域，導致重組 抗菌肽氨基酸數(shù)目多，分子量大，結構不穩(wěn)定，合成、分離及純化過程費時、費力。因此，多肽 合成前應對LL-37進行構效分析確定其氨基酸序列的主要功能區(qū)域后，在保證具備較強抗 菌活性的基礎上盡量減少氨基酸數(shù)目，使得STAMPS的合成及處理過程高效、快捷，結構穩(wěn)定 性增強。
[0024] 近年來，抗生素的大規(guī)模及大量應用帶來了一系列公共安全問題。耐藥菌株的日 益增多成為許多感染性疾病難以控制的根本因素。因此，醫(yī)學工作者們需研發(fā)出新藥物新 方法才能從根本上解決耐藥菌株增多的問題，以更好地控制感染性疾病的發(fā)生發(fā)展。 STAMPS在靶向抑制病原菌增殖的同時，良好的預防了 口腔菌群失衡及耐藥菌株增多等問 題，隨著各項研究手段日益成熟，其勢必成為解決以上臨床問題的一把金鑰匙。
【附圖說明】
[0025] 圖1為C16LL-37對變異鏈球菌ATCC 2517的靶向特異性； 圖2為C16LL-37、LL-37的紅細胞溶血實驗； 圖3為不同濃度C16LL-37對變異鏈球菌ATCC 2517的時間一殺菌曲線； 圖4為掃描電鏡觀察變異鏈球菌ATCC 2517的細胞形態(tài)學變化； 圖5為不同濃度胰蛋白酶處理后C16LL-37對S.mutans ATCC 2517的抑菌活性； 圖6為LL-37產(chǎn)物色譜圖； 圖7為LL-37產(chǎn)物色譜圖峰值讀取結果； 圖8為LL-37主峰餾分的質譜鑒定圖譜； 圖9為C16 LL-37產(chǎn)物色譜圖； 圖10為C16LL-37產(chǎn)物色譜圖峰值讀取結果； 圖11為C16LL-37主峰餾分的質譜鑒定圖譜。
【具體實施方式】
[0026] 一種重組人源性抗菌肽C16LL-37,采用標準固相合成技術合成，將人源性抗菌肽 LL-37 的氨基酸序列為 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES 與變異鏈球菌 CSP 的 C端 16個氨基酸序列CSPC16為TFFRLFNRSFTQALGK通過連接體-GGG-連接，合成特異性靶向能力 的重組人源性抗菌肽C16LL-37為 TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2。
[0027] 一種重組人源性抗菌肽C16LL-37的制備方法，包括如下步驟： A、 樹脂的溶脹 使用前，將反應管在濃度為7.6ml/g的二氯甲烷DCM中浸泡處理5h，再稱取5g Fomc-Rink-amide-MBHA樹脂加至反應管中，沿管壁加入濃度為7.6ml/g的二氯甲烷DCM50ml，使其 將樹脂浸沒，浸泡2_3h樹脂充分溶脹后，濾去反應液保留樹脂，用質量濃度20%的N，N二甲基 甲酰胺DMF洗滌3次； B、 氨基Fmoc保護基團的脫去 氨基酸縮合之前，需將Fmoc保護基團從樹脂上脫去，向反應管中加入質量濃度25%的哌 啶溶液，并通入氮氣反應3min，濾除溶液，使用哌啶溶液反復進行5次，再用質量濃度30%的 異丙醇溶液和質量濃度20%的DMF溶液將樹脂洗滌3次，每次3min; C、 激活和交聯(lián) 按目標多肽LL-37及C16LL-37的氨基酸序列自C端向N端依次縮合氨基酸，逐一縮合每 一個氨基酸，反應時觀察樹脂是否變色，若不變色始終淡黃色代表縮合反應已完成，若變色 變?yōu)榈{色則需延長縮合時間直至變回淡黃色代表縮合反應已完成;再對氨基酸的羧基用 20ml質量濃度為90% N，N-二環(huán)己基碳二亞胺DCC進行溶脹活化，活化的氨基酸與已接在固 相載體的第一個氨基酸，氨基反應形成肽鍵，LL-37氨基酸序列為 LL⑶FFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，其C端的第一個氨基酸為L，即亮氨酸；C16LL-37的氨基酸序列為 TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2,其 C端的第 一個氨基酸為T，即蘇氨酸，將要合成的目標多肽羧基端的第一個氨基酸縮合后，在樹脂載 體上形成了含一個肽鍵的暫時的短肽為二肽，即在樹脂載體上就形成了一個帶有保護基的 二肽； D、 洗脫和脫保護 向反應管內(nèi)加入20ml質量濃度25%哌啶溶液浸沒樹脂，通入氮氣進行吹沸反應2min，重 復5次，脫去多肽鏈最后一個氨基酸的Fmoc保護基團；再向反應管加入20ml質量濃度25%乙 酸酐-哌啶溶液于室溫下處理30min，使多肽的末端氨基乙?；?，分別使用20ml質量濃度 20%的異丙醇及DFM溶液洗滌樹脂3次，用氮氣吹干樹脂； E、 分離、純化及檢測 應用反相高效液相色譜法RP_high pressure liquid chromatography-RP-HPLC分離、 利用C18反相柱純化，尺寸為柱內(nèi)徑4.6mm X柱長度250mm，填料的粒徑為5μηι，檢測波長為 220nm，并利用Mass spectroscopy對色譜分離主峰尖出現(xiàn)時的餾分進行質譜圖分析。所述 步驟E的檢測結果為LL-37的分子質量為4493.37km，純度為95.22%; C16LL-37的分子質量 為6579 · 77km，純度為 98 · 87%。
[0028] 一種重組人源性抗菌肽C16LL-37對變異鏈球菌生物活性作用的應用方法，包括如 下步驟： A、指不細菌制備 選用變異鏈球菌ATCC 2517、粘性放線菌ATCC 15987、嗜酸乳桿菌ATCC 4356、大腸桿菌 ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923為指示菌，上述指示菌選用標準菌，在厭氧條件 下37°C恒溫搖床增殖處理12小時，增殖培養(yǎng)基選用MH培養(yǎng)基，增殖后菌落通過麥氏標準比 濁法測定濁度為0.5-1，菌落數(shù)為10 8CFU/ml，用MH培養(yǎng)基將各菌液稀釋至1 X 106CFU/ml的細 菌懸液備用； B、 抗菌肽最小抑菌濃度MIC及最小殺菌濃度MBC測試 將C16LL-37及LL-37母液進行二倍梯度稀釋法稀釋，母液濃度選用5120μπι〇1/1，分別稀 釋為 256ymol/L、128ymol/L、64ymol/L、32ymol/L、16μmol/L、8μmol/L，取各濃度抗菌肽100μ 1分別裝入無菌離心管內(nèi)，每個濃度多肽均設5組，分別加入變異鏈球菌ATCC 2517、粘性放 線菌ATCC 15987、嗜酸乳桿菌ATCC 4356、大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923充分混勻； 所述步驟B中以濃度為256μπι〇1/1的C16LL-37為例，分別取5支無菌離心管內(nèi)100μΙ該 濃度多肽，分別標記為256a、256b、256c、256d、256e，再分別向其中加入步驟Α中的細菌懸液 1〇〇μ 1，分別在256a中加入變異鏈球菌ATCC 2517、256b中加入粘性放線菌ATCC 15987、256c 中加入嗜酸乳桿菌ATCC 4356、256d中加入大腸桿菌ATCC 25922和256e中加入金黃色葡萄 球菌ATCC 25923。
[0029] 陰性對照組，即無抑菌活性的培養(yǎng)基，與實驗組多肽的抑菌效果進行比較，加入 100μΙ MHB培養(yǎng)基，將離心管置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育2h，將各菌液1 X 103倍稀釋后均勻涂 布于MH瓊脂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育16-18h，利用菌落計數(shù)儀計數(shù)； C、 C16LL-37對變異鏈球菌靶向特異性的測定 將濃度為64μπι〇1/1的C16LL-37分別加至含5種細菌懸液1 X 106CFU/ml的無菌離心管 內(nèi)，1〇〇μ1/支，充分混勻，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別選30、60、120 mins為兩種抗菌肽 作用觀察時間點，取每組樣品1〇μ1并行IX 1〇3倍稀釋后，再取各樣品30μ1分別均勻涂布于 ΜΗΑ瓊脂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育16-18h，利用菌落計數(shù)儀計數(shù)，并計算各組細菌的 存活率，菌落計數(shù)法同上； D、 時間-殺菌實驗 分別取步驟B中濃度128口111〇1凡、64口1]1〇1凡、32口1]1〇1凡的(]161^-37抗菌肽100口1裝入無菌 離心管內(nèi)，分別加入含1〇〇μ1濃度1 X l〇6CFU/ml的變異鏈球菌細菌懸液，充分混勻； MHB培養(yǎng)基為陰性對照組，將離心管置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱孵育，分別于0、30、60、90、 120、150mins時作用觀察時間點，取每組樣品10μ1并行1X103倍稀釋后，再取各樣品30μ1分 別均勻涂布于ΜΗΑ瓊脂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育16-18h，利用菌落計數(shù)儀計數(shù)，計算 各組細菌的存活率，并對菌落計數(shù)。
[0030] E、溶血實驗 取健康人體新鮮靜脈血分裝至含質量濃度lg/L肝素鈉溶液的無菌離心管內(nèi)，靜脈血和 肝素鈉溶液共1.51111，離心力100(^離心處理101^11，棄上清液留存紅細胞，將1((：10.28、似(：1 8.Og、KH 2P〇4 0.2g、Na2HP〇4.12H20 3.14g等化學試劑依次溶解于含1000ml無菌去離子水中 制得PBS緩沖液，并裝入三角燒瓶內(nèi)，充分混勻，調(diào)節(jié)PH值為7，置于滅菌鍋中滅菌處理，清洗 紅細胞2-3次后，再利用roS緩沖液將紅細胞配制成體積濃度4%的懸液，加入至96孔聚苯乙 稀板內(nèi)，每孔添加 1〇〇μ1;再將步驟B中512ymol/L、128ymol/L、64ymol/L、32ymol/L、16ymol/ USymol/L不同濃度的C16LL-37和LL-37加入至各孔內(nèi)，每孔添加 100μΙ; 陰性對照組及陽性對照組分別加入100μΙ PBS緩沖液及體積濃度0.2%聚乙二醇辛基 苯基醚TritonX-100,將各板置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育2h后，離心力1000g離心處理lOmin， 取上清1〇〇μ 1，多肽如果具有溶血活性，將紅細胞的細胞膜溶解破壞，上清液的0D值會顯著 增加，轉移置新的96孔聚苯乙烯板，利用酶標儀檢測450nm處各樣品的0D值； F、 掃描電子顯微鏡SEM觀察 設MHB培養(yǎng)基為陰性對照組，取500μ1濃度32_〇1/1的(：161^-37、32_〇1/1的LL-37及 ΜΗΒ培養(yǎng)基分別加入500μ 1變異鏈球菌懸液1 X 106CFU/ml的無菌離心管內(nèi)，充分混勻，并置 于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育2hrs，2hrs后，10000 rpm離心5min棄上清，加入步驟E中PBS緩沖液 清洗2-3次，加入體積濃度2.0%戊二醛緩沖劑并于4 °C條件下固定24h，取出各樣品，離心， 棄上清，PBS緩沖液清洗2-3次后乙醇梯度脫水，再用體積濃度100 %叔丁醇置換體積濃度 100 %乙醇2-3次后溶于體積濃度100%叔丁醇，吸取細菌-叔丁醇懸浮液滴于覆有蓋玻片 的樣品臺，放置于ES-2030形凍結真空干燥裝置冷凍干燥機，0.03pa內(nèi)真空-40 °C干燥5h，E-1010離子濺射裝置噴金，S-3400N鏡下觀察。 G、 C16LL-37的穩(wěn)定性分析 G1、不同溫度測定 64μπιο1/1 的 C16LL-37分別置于 17°C、27°C、37°C、47°C、57°C溫度下處理30min，待降至 常溫，將抗菌肽分別加入1〇〇μ1變異鏈球菌細菌懸液1 X l〇6CFU/ml的96孔聚苯乙烯板內(nèi)； G2、不同鹽濃度測定 128ymol/L的C16LL-37 50μ1分別加入100μ1變異鏈球菌懸液1 X 106CFU/ml的96孔聚苯 乙稀板內(nèi)，再分別加入50μ1的200口111〇1凡、300口1]1〇1凡、400口1]1〇1凡、800口1]1〇1凡的似(31溶液，充 分混勾，稀釋調(diào)節(jié)使 Nacl 的濃度分別為 100ymol/L、200ymol/L、300ymol/L、400ymol/L; G3、不同PH值測定 分別利用PH值為6的HCL溶液及PH值為8的NaOH緩沖液將三組64_〇1/1的C16LL-37的 PH 值調(diào)至5·5、6·5、7·5; G4、不同濃度胰蛋白酶測定 128ymol/L 的 C16LL-37 分別用不同濃度 0ymol/L、2ymol/L、20ymol/L、200ymol/L、2000y mol/L的胰蛋白酶37°C處理6h，分別加入至含100μ1變異鏈球菌細菌懸液1 X 106CFU/ml的 96孔聚苯乙烯板內(nèi)，充分混勻； 將以上61、62、63、64各組樣品分別置于37°(：恒溫培養(yǎng)箱孵育211后，利用酶標儀檢測 600nm處各組的0D值。
[0031 ]統(tǒng)計分析 應用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差統(tǒng)計分析，利用Tukey HSD多重比較檢驗， 檢驗水準為P〈0.05。下文中μΜ為ymol/Lo
[0032] MIC及MBC的測定 本研究通過測定重組抗菌肽C16LL-37的MIC及MBC，并將其與CSPq6、LL-37進行比較，檢 測細菌對C16LL-37的敏感性。結果顯示（圖2)，五種指示菌對C16LL-37的敏感性較LL-37減 弱，但相對其他四種指示菌，變異鏈球菌對C16LL-37的敏感性最強(ΜΚ=16μΜ，ΜΒ0=64 μΜ); CSPC16不具備抗菌活性。
[0033] 表1多肽的氨基酸序列、純度、分子量及抗菌活性 Tab 1 Amino acid sequence, purity, molecular weight，and antimicrobial activity of peptides.
2.2 C16LL-37對變異鏈球菌靶向特異性的測定 本研究將C16LL-37與LL-37的體外抗菌活性進行分析比較，檢測C16LL-37的靶向特異 性。結果顯示圖1，與對照組相比，C16LL-37對變異鏈球菌的抗菌活性最為顯著(P<0.05)， 在30min時變異鏈球菌的存活率顯著下降，lh、1.5h時變異鏈球菌的存活率為0%;C16LL-37 對其它四種指示菌的抑菌作用較弱，各時間點，其余四種指示菌存活率均大于60%。
[0034] 2.3紅細胞溶血實驗 本研究通過紅細胞溶血實驗對C16LL-37的安全性進行分析。結果顯示圖2，C16LL-37 的紅細胞溶血率與LL-37無顯著差異（P>0.05);當C16LL-37濃度為32μΜ時，溶血率約為 0 · 1%;當C16LL-37濃度為64μΜ時，溶血率約為0 · 3%;當C16LL-37濃度高達128μΜ及256μΜ時， 溶血率仍低于30%;C16LL-37與LL-37均具備較高生物安全性。
[0035] 2.4時間一殺菌實驗 本研究通過時間一殺菌實驗對C16LL-37對變異鏈球菌的殺菌動力學分析發(fā)現(xiàn)圖3,4X MIC時，C16LL-37作用30min后可將細菌全部殺死，150min后，細菌的存活率仍為0%;2XMIC 時，C16LL-37在90min內(nèi)可顯著抑制細菌的增殖，細菌生存率小于10%，90min-150min時抑菌 效果穩(wěn)定，細菌生存率仍略有降低；1XMIC時，C16LL-37的抑菌活性最弱，于2h后抑菌效果 顯著下降，細菌有增殖趨勢。研究表明，C16LL-37對變異鏈球菌的抑菌效果呈一定的時間依 賴性，Cl 6LL-37濃度越高，抑菌活性越強，作用時間越長。
[0036] 2.5掃描電子顯微鏡(SEM)觀察 用有效抑菌濃度(32tiM)C16LL-37處理變異鏈球菌2h后，置于掃描電子顯微鏡（日本，S-3400N)鏡下觀察發(fā)現(xiàn)圖4)，藥物作用后部分變異鏈球菌細胞形態(tài)不規(guī)則改變，表面粗糙，可 見大量細胞外碎肩；部分細菌細胞與陰性對照組相似，形態(tài)呈球狀或短棒狀，表面光滑完 整，未見細胞溶解或碎片形成。由此可見，C16LL-37主要通過破壞變異鏈球菌的細胞膜，使 細胞內(nèi)容物外溢，進而導致細胞裂解死亡。
[0037] C16LL-37的穩(wěn)定性分析 將一定濃度C16LL-37分別于不同溫度、PH值、不同濃度的鹽及胰蛋白酶條件下作用于 變形鏈球菌，以檢測C16 L L - 3 7的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)圖5，在各溫度、P Η值、鹽濃度條件下， C16LL-37的抑菌效果并無顯著改變(P>0.5);低濃度（0μΜ、2μΜ、20μΜ)胰蛋白酶處理后， C16LL-37的抑菌效果也無顯著改變(Ρ>0.5)，但高濃度（20μΜ、2000μΜ)胰蛋白酶處理后， Cl6LL-37的抑菌效果顯著下降，樣品的0D值分別為0.18、0.26(Ρ<0.5)。
【主權項】
1. 一種重組人源性抗菌肽C16LL-37,采用標準固相合成技術合成，其特征在于將人源 性抗菌肽LL-37的氨基酸序列為LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES與變異鏈球菌 CSP的C端16個氨基酸序列CSPC16為TFFRLFNRSFTQALGK通過連接體-GGG-連接，合成特異性 靶向能力的重組人源性抗菌肽C16LL-37為TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2。2. 根據(jù)權利要求1所述的重組人源性抗菌肽C16LL-37的制備方法，其特征在于包括如 下步驟： A、 樹脂的溶脹 使用前，將反應管在濃度為7.6ml/g的二氯甲烷DCM中浸泡處理5h，再稱取5g Fomc-Rink-amide-MBHA樹脂加至反應管中，沿管壁加入濃度為7.6ml/g的二氯甲烷DCM50ml，使其 將樹脂浸沒，浸泡2_3h樹脂充分溶脹后，濾去反應液保留樹脂，用質量濃度20%的N，N二甲基 甲酰胺DMF洗滌3次； B、 氨基Fmoc保護基團的脫去 氨基酸縮合之前，需將Fmoc保護基團從樹脂上脫去，向反應管中加入質量濃度25%的哌 啶溶液，并通入氮氣反應3min，濾除溶液，使用哌啶溶液反復進行5次，再用質量濃度30%的 異丙醇溶液和質量濃度20%的DMF溶液將樹脂洗滌3次，每次3min; C、 激活和交聯(lián) 按目標多肽LL-37及C16LL-37的氨基酸序列自C端向N端依次縮合氨基酸，逐一縮合每 一個氨基酸，反應時觀察樹脂是否變色，若不變色始終淡黃色代表縮合反應已完成，若變色 變?yōu)榈{色則需延長縮合時間直至變回淡黃色代表縮合反應已完成;再對氨基酸的羧基用 20ml質量濃度為90% N，N-二環(huán)己基碳二亞胺DCC進行溶脹活化，活化的氨基酸與已接在固 相載體的第一個氨基酸，氨基反應形成肽鍵，LL-37氨基酸序列為 LL⑶FFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，其C端的第一個氨基酸為L，即亮氨酸；C16LL-37的氨基酸序列為 TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2,其 C端的第一 個氨基酸為T，即蘇氨酸，將要合成的目標多肽羧基端的第一個氨基酸縮合后，在樹脂載體 上形成了含一個肽鍵的暫時的短肽為二肽，即在樹脂載體上就形成了一個帶有保護基的二 肽； D、 洗脫和脫保護 向反應管內(nèi)加入20ml質量濃度25%哌啶溶液浸沒樹脂，通入氮氣進行吹沸反應2min，重 復5次，脫去多肽鏈最后一個氨基酸的Fmoc保護基團；再向反應管加入20ml質量濃度25%乙 酸酐-哌啶溶液于室溫下處理30min，使多肽的末端氨基乙?；?，分別使用20ml質量濃度 20%的異丙醇及DFM溶液洗滌樹脂3次，用氮氣吹干樹脂； E、 分離、純化及檢測 應用反相高效液相色譜法RP_high pressure liquid chromatography-RP-HPLC分離、 利用C18反相柱純化，尺寸為柱內(nèi)徑4.6mm X柱長度250mm，填料的粒徑為5μηι，檢測波長為 220nm，并利用Mass spectroscopy對色譜分離主峰尖出現(xiàn)時的餾分進行質譜圖分析。3. 根據(jù)權利要求2所述的重組人源性抗菌肽C16LL-37的制備方法，其特征在于所述步 驟E的檢測結果為LL-37的分子質量為4493.37km，純度為95.22%; C16LL-37的分子質量為 6579 · 77km，純度為 98 · 87%。4. 根據(jù)權利要求1或2所述的一種重組人源性抗菌肽C16LL-37對變異鏈球菌生物活性 作用的應用方法，其特征在于包括如下步驟： A、 指不細囷制備 選用變異鏈球菌ATCC 2517、粘性放線菌ATCC 15987、嗜酸乳桿菌ATCC 4356、大腸桿菌 ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923為指示菌，上述指示菌選用標準菌，在厭氧條件 下37°C恒溫搖床增殖處理12小時，增殖培養(yǎng)基選用MH培養(yǎng)基，增殖后菌落通過麥氏標準比 濁法測定濁度為0.5-1，菌落數(shù)為10 8CFU/ml，用MH培養(yǎng)基將各菌液稀釋至1 X 106CFU/ml的細 菌懸液備用； B、 抗菌肽最小抑菌濃度MIC及最小殺菌濃度MBC測試 將C16LL-37及LL-37母液進行二倍梯度稀釋法稀釋，母液濃度選用5120μπι〇1/1，分別稀 釋為 256ymol/L、128ymol/L、64ymol/L、32ymol/L、16μmol/L、8μmol/L，取各濃度抗菌肽100μ 1分別裝入無菌離心管內(nèi)，每個濃度多肽均設5組，分別加入變異鏈球菌ATCC 2517、粘性放 線菌ATCC 15987、嗜酸乳桿菌ATCC 4356、大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923充分混勻； 陰性對照組，即無抑菌活性的培養(yǎng)基，與實驗組多肽的抑菌效果進行比較，加入100μΙ ΜΗΒ培養(yǎng)基，將離心管置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育2h，將各菌液1 X 103倍稀釋后均勻涂布于ΜΗ 瓊脂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育16-18h，利用菌落計數(shù)儀計數(shù)； C、C16LL-37對變異鏈球菌靶向特異性的測定 將濃度為64μπι〇1/1的C16LL-37分別加至含5種細菌懸液1 X 106CFU/ml的無菌離心管內(nèi)， 1〇〇μ1/支，充分混勻，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別選30、60、120 mins為兩種抗菌肽作用 觀察時間點，取每組樣品1〇μ1并行1X103倍稀釋后，再取各樣品30μ1分別均勻涂布于MHA瓊 脂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育16-18h，利用菌落計數(shù)儀計數(shù)，并計算各組細菌的存活 率，菌落計數(shù)法同上； D、 時間-殺菌實驗 分別取步驟B中濃度128口111〇1八、64口1]1〇1八、32口1]1〇1凡的(]161^-37抗菌肽100口1裝入無菌 離心管內(nèi)，分別加入含100μΙ濃度1 X l〇6CFU/ml的變異鏈球菌細菌懸液，充分混勻； Μ Η B培養(yǎng)基為陰性對照組，將離心管置于3 7 °C恒溫培養(yǎng)箱孵育，分別于0、3 0、6 0、9 0、 120、150mins時作用觀察時間點，取每組樣品ΙΟμΙ并行1X103倍稀釋后，再取各樣品30μ1分 別均勻涂布于ΜΗΑ瓊脂平板，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育16-18h，利用菌落計數(shù)儀計數(shù)，計算 各組細菌的存活率，并對菌落計數(shù)。5. 如權利要求4所述的一種重組人源性抗菌肽C16LL-37對變異鏈球菌生物活性作用的 應用方法，其特征在于還包括如下步驟： E、 溶血實驗 取健康人體新鮮靜脈血分裝至含質量濃度lg/L肝素鈉溶液的無菌離心管內(nèi)，靜脈血和 肝素鈉溶液共1.51111，離心力100(^離心處理101^11，棄上清液留存紅細胞，將1((：10.28、似(：1 8.Og、KH 2P〇4 0.2g、Na2HP〇4.12H20 3.14g等化學試劑依次溶解于含1000ml無菌去離子水中 制得PBS緩沖液，并裝入三角燒瓶內(nèi)，充分混勻，調(diào)節(jié)PH值為7，置于滅菌鍋中滅菌處理，清洗 紅細胞2-3次后，再利用roS緩沖液將紅細胞配制成體積濃度4%的懸液，加入至96孔聚苯乙 稀板內(nèi)，每孔添加 100μΙ;再將步驟B中512ymol/L、128ymol/L、64ymol/L、32ymol/L、16ymol/ USymol/L不同濃度的C16LL-37和LL-37加入至各孔內(nèi)，每孔添加 100μΙ; 陰性對照組及陽性對照組分別加入100μΙ PBS緩沖液及體積濃度0.2%聚乙二醇辛基苯 基醚TritonX-100,將各板置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育2h后，離心力1000g離心處理lOmin，取 上清1〇〇μ 1，多肽如果具有溶血活性，將紅細胞的細胞膜溶解破壞，上清液的0D值會顯著增 加，轉移置新的96孔聚苯乙烯板，利用酶標儀檢測450nm處各樣品的0D值； F、 掃描電子顯微鏡SEM觀察 設MHB培養(yǎng)基為陰性對照組，取500μ1濃度32_〇1/1的(：161^-37、32_〇1/1的LL-37及 ΜΗΒ培養(yǎng)基分別加入500μ 1變異鏈球菌懸液1 X 106CFU/ml的無菌離心管內(nèi)，充分混勻，并置 于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育2hrs，2hrs后，10000 rpm離心5min棄上清，加入步驟E中PBS緩沖液 清洗2-3次，加入體積濃度2.0%戊二醛緩沖劑并于4 °C條件下固定24h，取出各樣品，離心， 棄上清，PBS緩沖液清洗2-3次后乙醇梯度脫水，再用體積濃度100 %叔丁醇置換體積濃度 100 %乙醇2-3次后溶于體積濃度100%叔丁醇，吸取細菌-叔丁醇懸浮液滴于覆有蓋玻片 的樣品臺，放置于ES-2030形凍結真空干燥裝置冷凍干燥機，0.03pa內(nèi)真空-40 °C干燥5h，E-1010離子濺射裝置噴金，S-3400N鏡下觀察。6. 如權利要求1所述的一種重組人源性抗菌肽C16LL-37對變異鏈球菌生物活性作用 的應用方法，其特征在于還包括 G、 C16LL-37的穩(wěn)定性分析 G1、不同溫度測定 64_〇1/1 的 C16LL-37分別置于 17°(：、27°(：、37°(：、47°(：、57°(：溫度下處理3〇1^11，待降至 常溫，將抗菌肽分別加入1〇〇μ1變異鏈球菌細菌懸液1 X l〇6CFU/ml的96孔聚苯乙烯板內(nèi)； G2、不同鹽濃度測定 128ym〇VL的C16LL-37 50μ1分別加入100μ1變異鏈球菌懸液1 X 106CFU/ml的96孔聚苯 乙稀板內(nèi)，再分別加入50μ1的200口111〇1凡、300口1]1〇1凡、400口1]1〇1凡、800口1]1〇1凡的似(31溶液，充 分混勾，稀釋調(diào)節(jié)使 Nacl 的濃度分別為 100ymol/L、200ymol/L、300ymol/L、400ymol/L; G3、不同PH值測定 分別利用PH值為6的HCL溶液及PH值為8的NaOH緩沖液將三組64μπι〇 1/L的Cl6LL-37的 ΡΗ 值調(diào)至5·5、6·5、7·5; G4、不同濃度胰蛋白酶測定 128μπιο 1 /L的 C16LL-3 7分別用不同濃度 Ομπιο 1 /L、2μπιο 1 /L、20μπιο 1 /L、200μπιο 1 /L、2000μ mol/L的胰蛋白酶37°C處理6h，分別加入至含100μ1變異鏈球菌細菌懸液1 X 106CFU/ml的 96孔聚苯乙烯板內(nèi)，充分混勻； 將以上61、62、63、64各組樣品分別置于37°(：恒溫培養(yǎng)箱孵育211后，利用酶標儀檢測 600nm處各組的0D值。7. 根據(jù)權利要求4所述的一種重組人源性抗菌肽C16LL-37對變異鏈球菌生物活性作 用的應用方法，其特征在于所述步驟B中以濃度為256μπι 〇1/1的C16LL-37為例，分別取5支 無菌離心管內(nèi)100口1該濃度多肽，分別標記為2568、25613、256(3、256(1、2566，再分別向其中加 入步驟Α中的細菌懸液100μ1，分別在256a中加入變異鏈球菌ATCC 2517、256b中加入粘性放 線菌ATCC 15987、256c中加入嗜酸乳桿菌ATCC 4356、256d中加入大腸桿菌ATCC 25922和
【文檔編號】C07K14/315GK106008718SQ201610196500
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年3月31日
【發(fā)明人】周建業(yè), 李志強, 何祥, 何祥一, 車春曉, 姜科宇, 張菊梅, 焦康禮, 胡曉潘, 張軒
【申請人】西北民族大學