一種基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體，其特征在于所述載體構(gòu)建方法為：將靶向基因的目的片段導(dǎo)入過(guò)渡載體，構(gòu)建獲得可以產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的RNAi載體；本發(fā)明方法利用同尾酶的特性，只需要通過(guò)一次PCR擴(kuò)增獲得一段DNA片段，對(duì)該片段酶切一次，可以簡(jiǎn)化構(gòu)建流程，提高構(gòu)建效率。同時(shí)，該方法構(gòu)建的RNAi載體中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(目的片段?內(nèi)含子?反向重復(fù)目的片段)的部分只需要兩個(gè)同尾酶酶切位點(diǎn)，這樣可以預(yù)留出更多的單克隆位點(diǎn)，提高載體構(gòu)建的靈活性。利用本方法構(gòu)建的RNAi載體可被廣泛用于多個(gè)物種基因的功能研究、遺傳改造以及分子育種等，在基礎(chǔ)研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上都具有十分重要的價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種基于同尾酶構(gòu)建的RNA i載體及其應(yīng)用 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種RNAi載體，特別涉及一種基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體及其應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由靶基因同源雙鏈RNA引發(fā)的在動(dòng)植物中普 遍存在的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Hannon, (2002)Nature,418:244-251)。最早在植物 體中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已成為后基因組時(shí)代的重要研究手段。RNAi在植物功能基因組、生長(zhǎng)發(fā)育、抗 病毒、品質(zhì)改良等方面都有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 在植物中，RNAi-般是通過(guò)具有雙鏈RNA(dsRNA)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(hairpin RNA (hpRNA))來(lái)實(shí)現(xiàn)的（Waterhouse and Helliwell，（2003)Nat Rev Genet,4:29-38)。雖然， 反義RNA介導(dǎo)的基因沉默作為一種RNAi現(xiàn)象已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物基因功能分析，hpRNA介導(dǎo) 的RNAi具有更高的效率(Chuang and Meyerowitz，（2000)P Natl Acad Sci USA 97:4985-4990)。產(chǎn)生hpRNA的載體通常是從靶標(biāo)基因上克隆到一組反向互補(bǔ)的核苷酸序列，這一組 序列中間由一段無(wú)關(guān)的間隔序列連接，然后用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。啟動(dòng)子可以是35S CaMV (多用于雙子葉植物)或者maize ubiquitin 1(多用于單子葉植物）。反向互補(bǔ)序列中間的 無(wú)關(guān)的間隔序列最好是內(nèi)含子(Intron)，這對(duì)反向重復(fù)序列在Escherichia coli中的穩(wěn)定 性以及在植物中的基因沉默效率的提高都十分重要（Smith et al.，（2000)Nature 407: 319-320;Wesley et al^UOODPlant J 27:581-590)。上述產(chǎn)生hpRNA的載體穩(wěn)定性和效 率都比較高，但是載體構(gòu)建起來(lái)也相對(duì)復(fù)雜，簡(jiǎn)單高效的產(chǎn)生hpRNA的載體構(gòu)建方法亟待發(fā) 現(xiàn)。
[0004] 同尾酶是指能酶切產(chǎn)生相同的粘性末端的限制性內(nèi)切酶。常用的同尾酶包括： Bglll和BamHI，NheI和XbaI，SalI和Xhol等。這些同尾酶的特性可以用于簡(jiǎn)化產(chǎn)生hpRNA的 RNAi載體的構(gòu)建。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體及其應(yīng)用，解決目前構(gòu)建產(chǎn)生 發(fā)夾RNA載體需要克隆多個(gè)目標(biāo)片段(正向序列、反向序列、內(nèi)含子)的技術(shù)問(wèn)題。該方法只 需要用PCR的方法克隆一個(gè)目的片段就可以構(gòu)建出具有高干擾效率的RNAi載體。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體，所述載體構(gòu)建方法為:將靶向基因 的目的片段導(dǎo)入過(guò)渡載體，構(gòu)建獲得可以產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的RNAi載體；
[0008] 所述過(guò)渡載體中預(yù)置一個(gè)內(nèi)含子和一個(gè)終止子，內(nèi)含子的5'端依次設(shè)置同尾酶酶 切位點(diǎn)A1、B1，3 '端依次設(shè)置同尾酶酶切位點(diǎn)B2、A2，其中A1、A2為一組同尾酶酶切位點(diǎn)，B1、 B2為另一組同尾酶酶切位點(diǎn)，字母本身沒有含義，為了便于表述內(nèi)含子兩端設(shè)計(jì)的酶切位 點(diǎn)來(lái)自兩組同尾酶而命名；所述目的片段的5'端和3'端分別設(shè)置A1、B1或者A2、B2酶切位 點(diǎn);通過(guò)兩次酶切、連接和轉(zhuǎn)化反應(yīng)，把目的片段分別連入內(nèi)含子的5 '端和3 '端，形成"目的 片段-內(nèi)含子-反向重復(fù)目的片段-終止子"結(jié)構(gòu)的DNA片段，再通過(guò)一次酶切、連接和轉(zhuǎn)化反 應(yīng)把上述DNA片段連入預(yù)置有啟動(dòng)子的終載體中，或者DNA片段跟設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子通過(guò)三段連 接連入終載體，獲得RNAi載體。
[0009]進(jìn)一步，所述同尾酶為下列之一 ：（l)BglII和BamHI，（2)NheI和XbaI，（3)SalI和 Xhol。也可以是其它具有類似屬性的限制性內(nèi)切酶。
[0010]進(jìn)一步，所述內(nèi)含子核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 進(jìn)一步，所述終止子核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。
[0012] 進(jìn)一步，所述載體為pGEM-T easy Vector。
[0013] 進(jìn)一步，所述終載體為雙元載體pCambial300-pZmUbi-G10。
[0014] 進(jìn)一步，所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體構(gòu)建方法為：
[0015] (1)以pGEM-T easy Vector為骨架，把內(nèi)含子和終止子連入該載體中，同時(shí)在內(nèi)含 子兩端分別依次設(shè)置A1、B1和B2、A2酶切位點(diǎn)，形成過(guò)渡載體1; (2)對(duì)PCR擴(kuò)增獲得兩端分別 設(shè)置有A1、B1或者A2、B2酶切位點(diǎn)的目的基因進(jìn)行酶切回收，獲得目的片段；
[0016] (3)然后用設(shè)置在目的基因上的兩個(gè)同尾酶對(duì)過(guò)渡載體1進(jìn)行酶切回收，獲得載 體；
[0017] (4)把步驟⑵和步驟(3)回收的目的片段和載體連接、轉(zhuǎn)化，獲得含有一段目的基 因的過(guò)渡載體2;
[0018] (5)再用設(shè)置有同目的基因酶切位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)同尾酶對(duì)過(guò)渡載體2進(jìn)行酶切回收，并 與步驟(2)中回收的目的片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，獲得具有"目的片段-內(nèi)含子-反向重復(fù)目的片 段"結(jié)構(gòu)的過(guò)渡載體3;
[0019] (6)最后將過(guò)渡載體3中的"目的片段-內(nèi)含子-反向重復(fù)目的片段"結(jié)構(gòu)連同終止 子酶切回收后連入對(duì)應(yīng)的終載體中，即獲得RNAi載體。
[0020] 本發(fā)明還提供一種所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用?？梢岳?用該方法構(gòu)建產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的RNAi載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法導(dǎo)入植物或者動(dòng)物細(xì)胞中， 實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)基因的沉默。
[0021] 本發(fā)明還提供一種所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。 可以利用該方法構(gòu)建RNAi載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中，獲得靶標(biāo)基因被沉默 的轉(zhuǎn)基因植株。該方法可以用于基因功能的研究，也可以用于抑制和沉默靶標(biāo)基因的表達(dá)， 改良作物性狀。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0023]與目前已有的產(chǎn)生hpRNA的RNAi載體構(gòu)建方法相比，本發(fā)明方法利用同尾酶的特 性，只需要通過(guò)一次PCR擴(kuò)增獲得一段DNA片段，對(duì)該片段酶切一次，可以簡(jiǎn)化構(gòu)建流程，提 高構(gòu)建效率。同時(shí)，該方法構(gòu)建的RNAi載體中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（目的片段-內(nèi)含子-反向重復(fù)目 的片段)的部分只需要兩個(gè)同尾酶酶切位點(diǎn)，這樣可以預(yù)留出更多的單克隆位點(diǎn)，提高載體 構(gòu)建的靈活性。利用本方法構(gòu)建的RNAi載體可被廣泛用于多個(gè)物種基因的功能研究、遺傳 改造以及分子育種等，在基礎(chǔ)研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上都具有十分重要的價(jià)值。 (四）【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1:基于同尾酶的RNAi載體構(gòu)建技術(shù)方案示意圖。
[0025] 圖2 :pGEM-T-LOG-intron-Ter載體結(jié)構(gòu)不意圖。LOG-Intron為水稻LOG基因第二個(gè) 內(nèi)含子。LOG-Intron 5 '端設(shè)置有4個(gè)酶切位點(diǎn)，分別為EcoRI、HindIII、BamHI、XhoI，其中 EcoRI、HindIII用于終載體構(gòu)建，BamHI、XhoI分別為兩組同尾酶中的一個(gè)，用于連接目的片 段；3 '端依次設(shè)置有SalI和BglII酶切位點(diǎn)，SalI和BglII分別為Xhol和BamHI的同尾酶。 Apal和SacI之間為人工合成的終止子Ter。
[0026] 圖3:接入目的片段的RNAi終載體中產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA部分的結(jié)構(gòu)示意圖。p35S: 35S啟動(dòng)子;F:靶向目的基因的目的片段;LOG-Intron:水稻LOG基因第二個(gè)內(nèi)含子;R:靶向 目的基因的目的片段的反向重復(fù)序列；Ter:人工合成的終止子。把片段R連入載體后，酶切 位點(diǎn)Sa 11和XhoI，Bg 1II和BamHI連接后被鈍化。 (五)【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0028] 實(shí)施例l、RNAi過(guò)渡載體構(gòu)建
[0029] 水稻LOG基因 （gene = 〃0s01g0588900〃）第2個(gè)內(nèi)含子序列（核苷酸序列為SEQ ID Ν0· 1所示）的獲得：設(shè)計(jì)PCR引物L(fēng)OG-intron-F: (5' GAATTCAAGCTTGGATCCCTCGAGTCAAGGATTTCGGGATGACC)和L0G-intron-R(5 ' ACATGGGCCCAGATCTGTCGACTGGTCGCCATGTCA TTGG)，以商業(yè)水稻品種秀水 134基因組為模板， 通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得大小為0.7kb的基因組片段。PCR反應(yīng)條件為:95°C3分鐘；95°C 15秒，66°C 15秒，72°C1分鐘，重復(fù)33個(gè)循環(huán)；然后72°C10分鐘。然后，把該片段克隆到pGEM-T easy Vector中，測(cè)序驗(yàn)證后保存，用于接下來(lái)的過(guò)渡載體構(gòu)建。該載體命名為pGEM-T-L0G-intron。上述PCR獲得的片段的5'端依次設(shè)置有EcoRI、HindIII、BamHI、XhoI酶切位點(diǎn)，其中 EcoRI、HindIII用于終載體構(gòu)建，BamHI、XhoI分別為兩組同尾酶中的一個(gè)，用于連接目的片 段;3 '端依次設(shè)置有Sa 11、Bg III、Apa I酶切位點(diǎn)，其中Sa 11和Bg 1II分別為Xho I和BamHI的同 尾酶，用于連接目的片段，Apal用于接入終止子。
[0030] 終止子為人工合成序列Ter(SEQ ID N0.2)，5'端設(shè)置有Apa頂每切位點(diǎn)，3'端設(shè)置 有ΚρηΙ和Sac頂每切位點(diǎn)。
[0031] 含有內(nèi)含子和終止子的過(guò)渡載體的構(gòu)建：用EcoRI和Apal對(duì)pGEM-T-LOG-intron進(jìn) 行雙酶切，回收大小約為〇 · 7kb的LOG-intron片段；用EcoRI和SacI對(duì)pGEM-T-LOG-intron進(jìn) 行雙酶切，回收大小約為3.Okb的pGEM-T載體；用Apal和SacI對(duì)人工合成后連入pUC57載體 中的Ter進(jìn)行酶切，回收終止子。然后，把上述回收到的載體和片段進(jìn)行三段連接，獲得的載 體命名為pGEM-T-L0G-intron-Ter(圖2)，核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。
[0032]實(shí)施例2、沉默水稻OsTEL基因的RNAi載體的構(gòu)建
[0033] 水稻中的OsTEL(又命名為PLAST0CHR0N2)基因編碼一個(gè)RNA結(jié)合蛋白。Tai ji等發(fā) 現(xiàn)OsTEL基因發(fā)生功能缺失突變的水稻的葉片起始生長(zhǎng)的速率加快，葉片成熟加快，且植株 矮小，說(shuō)明其有調(diào)控葉片起始和成熟的功能(1^￥&1?^811，（2006)1116?1&1^〇61118 :612-625;Xiong et al.，（2006)Cell Research 16:267-276)。但是，由于上述突變體中OsTEL基 因的功能完全缺失，無(wú)法觀察OsTEL基因表達(dá)下調(diào)的表型，以及不同下調(diào)程度與表型的對(duì)應(yīng) 關(guān)系。因此，構(gòu)建沉默OsTEL基因的RNAi載體可以幫助我們進(jìn)一步研究OsTEL基因的功能。
[0034] OsTEL基因 （gene = 〃0s01g0907900〃）中靶標(biāo)片段（核苷酸序列為SEQ ID N0.4所 示）的獲得：設(shè)計(jì)PCR引物OsTEL-RNAi-F: (5'GACCTCGAGGGCTTCAGCATCGTCGTCTACC)和OsTEL-RNAi-R(5 ' CTTGGATCCGTCCGTGAGCAGCT TGCCGT)，以商業(yè)水稻品種秀水-134的總cDNA為模 板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得大小為0.7kb的片段。PCR反應(yīng)條件為:95 °C 3分鐘;95 °C 15秒，66 °C 15 秒，72°C1分鐘，重復(fù)33個(gè)循環(huán)；然后72°C10分鐘。然后，把該片段克隆到pGEM-T easy Vector中，測(cè)序驗(yàn)證后保存，用于接下來(lái)的過(guò)渡載體構(gòu)建。上述PCR獲得的片段的5'端設(shè)置 有Xho頂每切位點(diǎn)，3 '端設(shè)置有BamM酶切位點(diǎn)。
[0035]含有靶向OsTEL基因的目的片段的過(guò)渡載體的構(gòu)建：
[0036] 第一步：用BamHI和Xhol對(duì)連有靶向OsTEL基因的目的片段的pGEM-T easy Vector 進(jìn)行雙酶切，回收該目的片段；
[0037] 第二步：用Bglll和Sail對(duì)實(shí)施例1中構(gòu)建好的pGEM-T-LOG-intron-Ter載體進(jìn)行 雙酶切，回收載體片段；
[0038]第三步:把上述回收到的目的片段和載體進(jìn)行連接，構(gòu)建好的載體命名為pGEM-T-LOG-intron-目的片段(反向重復(fù))-Ter;
[0039] 第四步:BamHI和XhoI對(duì)pGEM-T-LOG-intron-目的片段（反向重復(fù))-Ter載體進(jìn)行 雙酶切，回收該載體片段，并與第一步中的片段進(jìn)行連接，構(gòu)建好的過(guò)渡載體命名為pGEM-T-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重復(fù))-Ter。
[0040] 靶向OsTEL基因的RNAi終載體的構(gòu)建：
[0041] 雙元載體PCambial300-pZmUbi-G10(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069: SEQ ID勵(lì).49)是基于?0&1111^&1300修改而來(lái)的，該載體包含一個(gè)耐草甘膦基因江?3?3)，作 為轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因。用BamHI和ΚρηΙ對(duì)pGEM-T-目的片段-LOG-intron-目的片段（反向重 復(fù))-Ter載體進(jìn)行雙酶切，獲得含有"目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重復(fù))-Ter"結(jié) 構(gòu)的片段。人工合成35S啟動(dòng)子p35S(SEQ ID勵(lì).5，經(jīng)過(guò)把11(1111和8&111!11酶切），用于驅(qū)動(dòng)上 述片段的轉(zhuǎn)錄。把經(jīng)過(guò)BamHI和ΚρηΙ雙酶切的pCambial300-pZmUbi-G10載體、以及酶切回收 的"目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重復(fù))-Ter"結(jié)構(gòu)片段、p35S進(jìn)行三段連接，構(gòu)建 成終載體。載體T-DNA中包含如下基因結(jié)構(gòu)："p35S-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向 重復(fù)）-Ter-啟動(dòng)子-耐草甘膦基因"。這個(gè)載體命名為：pCambial300-G10-0sTEL-RNAi(圖 3) 〇
[0042] 實(shí)施例3、沉默玉米Ms45基因的RNAi載體的構(gòu)建
[0043]玉米的Ms45基因在頂花中特異性表達(dá)，該基因發(fā)生功能缺失突變的玉米植株雄性 不育（Cigan et al.，2001)。只有構(gòu)建一個(gè)高效的RNAi載體，把Ms45基因完全沉默，才能達(dá) 到生產(chǎn)使用的標(biāo)準(zhǔn)。
[0044] Ms45基因（GenBank:AF360356.1)中靶標(biāo)片段（核苷酸序列為SEQIDN0.6所示）的 獲得：設(shè)計(jì)PCR引物MS45-RNAi-F: (5 ' GGTGCTCGAGCTCTAGATTAGTAAAAAGGGAGAGAGAGAG)和 MS45-RNAi-R(5 ' TGGATCCTGCAGGTTCCTCTTCTCCATGCTGGTGGAC)，以商業(yè)玉米品種鄭丹958的 基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得大小為0.4kb的片段。PCR反應(yīng)條件為:95°C 3分鐘;95 °C 15 秒，6 6 °C 15秒，7 2 °C 3 0秒，重復(fù)3 3個(gè)循環(huán)；然后7 2 °C 10分鐘。然后，把該片段克隆到p G E Μ - T easy Vector中，測(cè)序驗(yàn)證后保存，用于接下來(lái)的過(guò)渡載體構(gòu)建。上述PCR獲得的片段的5 '端 設(shè)置有Xho頂每切位點(diǎn)，3 '端設(shè)置有BamM酶切位點(diǎn)。
[0045] 含有靶向Ms45基因的目的片段的過(guò)渡載體的構(gòu)建：
[0046] 第一步：用BamHI和Xhol對(duì)連有靶向Ms45基因的目的片段的pGEM-T easy Vector 進(jìn)行雙酶切，回收該目的片段；
[0047] 第二步：用Bgl II和Sal I對(duì)實(shí)施例1中構(gòu)建好的pGEM-T-LOG-intron-Ter載體進(jìn)行 雙酶切，回收載體片段；
[0048]第三步:把上述回收到的目的片段和載體進(jìn)行連接，構(gòu)建好的載體命名為pGEM-T-LOG-intron-目的片段(反向重復(fù))-Ter;
[0049] 第四步:BamHI和XhoI對(duì)pGEM-T-LOG-intron-目的片段（反向重復(fù))-Ter載體進(jìn)行 雙酶切，回收該載體片段，并與第一步中的片段進(jìn)行連接，構(gòu)建好的過(guò)渡載體命名為pGEM-T-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重復(fù))-Ter。
[0050] 靶向Ms45基因的RNAi終載體的構(gòu)建：
[0051] 雙元載體PCambial300-pZmUbi-G10(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069: SEQ ID勵(lì).49)是基于?0&1111^&1300修改而來(lái)的，該載體包含一個(gè)耐草甘膦基因江?3?3)，作 為轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因。對(duì)pGEM-T-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重復(fù))-Ter載體進(jìn)行 酶切，獲得含有"目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重復(fù))-Ter"結(jié)構(gòu)的片段。人工合成 35S啟動(dòng)子p35S(SEQ ID勵(lì).5，經(jīng)過(guò)把11(1111和8&111!11酶切），用于驅(qū)動(dòng)上述片段的轉(zhuǎn)錄。把經(jīng) 過(guò)BamHI和ΚρηΙ雙酶切的pCambial300-pZmUbi-G10載體、以及酶切回收的"目的片段-L0G-intron-目的片段（反向重復(fù))-Ter"結(jié)構(gòu)片段、p35S進(jìn)行三段連接，構(gòu)建成終載體。載體T-DNA中包含如下基因結(jié)構(gòu)："p35S-目的片段-LOG-intron-目的片段(反向重復(fù))-Ter-啟動(dòng) 子-耐草甘膦基因"。這個(gè)載體命名為:pCambial300-G10-Ms45-RNAi(圖3)。
[0052]實(shí)施例4、水稻的轉(zhuǎn)化
[0053]轉(zhuǎn)基因水稻的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)(盧雄斌，龔祖塤（1998)生命科學(xué)10:125-131;劉凡等(2003)分子植物育種1:108-115)。選取成熟飽滿的"秀水134"種子去殼，誘導(dǎo)產(chǎn) 生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。取實(shí)施例2中構(gòu)建好的載體分別進(jìn)行農(nóng)桿菌劃板。挑單菌落接 種，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入0D為0.6左右的重組農(nóng)桿菌菌液中（重組 農(nóng)桿菌菌液的制備:將重組農(nóng)桿菌接種至培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)至0D為0.6左右;培養(yǎng)基組成： 3g/L K2HP〇4、lg/L NaH2P〇4、lg/L NH4Cl、0.3g/L MgS〇4.7H20、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl2、0.0025g/L FeS〇4 · 7H20、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶劑為水，pH=5.8)，讓重組 農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/ L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L瓊脂(sigma 7921 )+20mg/L乙酰丁香酮）中，28°C共培養(yǎng)2-3天。用 無(wú)菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L瓊脂 (sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，28°C篩選培養(yǎng)兩個(gè)月（中間繼代 一次）。把篩選后生長(zhǎng)活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L ABA+ lmg/L NAA+5mg/L 6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上28°C培養(yǎng)20天左右， 然后將預(yù)分化好的愈傷組織移到分化培養(yǎng)基上，每天14小時(shí)光照分化發(fā)芽。2-3周后，把抗 性再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1 /2MS+0 · 2mg/L NAA+20g/L蔗糖+2 · 5g/L gelrite)上壯苗 生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，選擇廣量尚、種子大或者生物量尚等能夠提尚 水稻產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因株系，培育新品種。獲得含上述轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0054]實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定
[0055] 水稻是自交系，我們用獲得的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)基因水稻品系和空載體對(duì)照品系的純合 子進(jìn)行表型的分析和比較。
[0056] 將實(shí)施例4獲得的轉(zhuǎn)基因水稻品系和非轉(zhuǎn)基因受體品系的葉片數(shù)目和株高進(jìn)行比 較分析。
[0057] 我們獲得的60個(gè)轉(zhuǎn)pCambial300-G10-0sTEL-RNAi載體的轉(zhuǎn)基因品系（命名為 OsTEL-i)中有45個(gè)品系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾热~片起始發(fā)育速率和葉片成熟加快、株高變 矮。
[0058] 其中兩個(gè)典型品系的葉片數(shù)目和株高的變化如下表所示。
[0059] 表1:兩個(gè)典型品系與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌废档谋容^ 「00601
[0061 ] *表格中的參數(shù)都經(jīng)過(guò)F-Test檢驗(yàn)(P彡0.05)，并且都是和對(duì)照相比差異在5%以 上的。OsTEL-i 為載體 pCambial 300-G10-OsTEL-RNAi 的 T-DNA 轉(zhuǎn)化植株，其中 OsTEL-i 后面的 編號(hào)(20,55)是對(duì)不同品系隨機(jī)編號(hào)，用于區(qū)分不同的轉(zhuǎn)化事件。
[0062] 實(shí)施例6、玉米的轉(zhuǎn)化
[0063] 玉米的轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)比較成熟。參考文獻(xiàn)如：Vladimir Sidorov&David Duncan (in M.Paul Scott(ed.),Methods in MolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526； Yuj i Ishida,Yukoh Hiei&Toshihiko Komari(2007)Agrobacterium-mediated transformation of maize.Nature Protoc ols 2:1614-1622?；痉椒ㄈ缦拢?br>[0064] 取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小為1.0-1.5mm)。將實(shí) 施例3中構(gòu)建的含有T-DNA載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌獲得的重組農(nóng)桿菌與未成熟胚在共培養(yǎng)培養(yǎng)基 上(MS+2mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+3g/L瓊脂（sigma 7921) +40mg/L乙酰丁香酮)共培養(yǎng)2-3天 (22°C)。轉(zhuǎn)移未成熟胚到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(MS+2mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+2 · 5g/L gelrite+ 5mg/L AgNOs+SOOmg/l乙酰丁香酮），28°C暗培養(yǎng)10-14天。將所有的愈傷轉(zhuǎn)到帶有2mM草甘 膦的篩選培養(yǎng)基(與愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同）上，28°C暗培養(yǎng)2-3周。轉(zhuǎn)移所有的組織到新鮮含 2mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2-3周。然后，轉(zhuǎn)移所有篩選后成活的胚性組織到再 生培養(yǎng)基(MS+30g/L鹿糖+0 · 5mg/L kinetin+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮）上，28 °C暗培養(yǎng)10-14天，每皿一個(gè)株系。轉(zhuǎn)移胚性組織到新鮮的再生培養(yǎng)基上，26°C光照培養(yǎng)10-14天。轉(zhuǎn)移所有發(fā)育完全的植株到生根培養(yǎng)基（l/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+200mg/ L乙酰丁香酮)上，26°C光照培養(yǎng)直到根發(fā)育完全。獲得含上述轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)基因玉米植株。 [0065]實(shí)施例7、轉(zhuǎn)基因玉米的鑒定
[0066] 我們使用人工授粉的方法對(duì)實(shí)施例6中獲得的轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行授粉和收獲，然后 對(duì)收獲的T1代種子進(jìn)行種植，用于觀察和統(tǒng)計(jì)分析。
[0067] 我們獲得的58個(gè)轉(zhuǎn)pCambial300-G10-Ms45-RNAi載體的轉(zhuǎn)基因品系(命名為Ms45-i)中有28個(gè)品系完全雄性不育，20個(gè)部分雄性不育，10個(gè)育性與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障喈?dāng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體，其特征在于所述載體構(gòu)建方法為:將靶向基因的 目的片段導(dǎo)入過(guò)渡載體，構(gòu)建獲得可以產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的RNAi載體； 所述過(guò)渡載體中預(yù)置一個(gè)內(nèi)含子和一個(gè)終止子，內(nèi)含子的5'端依次設(shè)置同尾酶酶切位 點(diǎn)A1、B1，3'端依次設(shè)置同尾酶酶切位點(diǎn)B2、A2,其中A1、A2為一組同尾酶酶切位點(diǎn)，B1、B2為 另一組同尾酶酶切位點(diǎn)；所述目的片段的5'端和3'端分別設(shè)置A1、B1或者A2、B2酶切位點(diǎn)； 通過(guò)兩次酶切、連接和轉(zhuǎn)化反應(yīng)，把目的片段分別連入內(nèi)含子的5'端和3'端，形成"目的片 段-內(nèi)含子-反向重復(fù)目的片段-終止子"結(jié)構(gòu)的DNA片段，再通過(guò)一次酶切、連接和轉(zhuǎn)化反應(yīng) 把上述DNA片段連入預(yù)置有啟動(dòng)子的終載體中，或者DNA片段跟設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子通過(guò)三段連接 連入終載體，獲得RNAi載體。2. 如權(quán)利要求1所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體，其特征在于所述同尾酶為下列之一： (l)Bglll和BamHI，（2)NheI和XbaI，（3)SalI和Xhol。3. 如權(quán)利要求1所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體，其特征在于所述內(nèi)含子核苷酸序列 為SEQ ID N0.1 所示。4. 如權(quán)利要求1所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體，其特征在于所述終止子核苷酸序列 為SEQ ID NO .2所示。5. 如權(quán)利要求1所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體，其特征在于所述載體為pGEM-T easy Vector。6. 如權(quán)利要求1所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體，其特征在于所述終載體為雙元載體 pCambial300-pZmUbi-G10〇7. 如權(quán)利要求1所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體，其特征在于所述構(gòu)建方法為： (1) 以pGEM-T easy Vector為骨架，把內(nèi)含子和終止子連入該載體中，同時(shí)在內(nèi)含子兩 端分別依次設(shè)置A1、B1和B2、A2酶切位點(diǎn)，形成過(guò)渡載體1; (2) 對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的兩端分別設(shè)置有A1、B1或者A2、B2酶切位點(diǎn)的目的基因進(jìn)行酶切 回收，獲得目的片段； (3) 然后用設(shè)置在目的基因上的兩個(gè)同尾酶對(duì)過(guò)渡載體1進(jìn)行酶切回收，獲得載體； (4) 把步驟(2)和步驟(3)回收的目的片段和載體連接、轉(zhuǎn)化，獲得含有一段目的基因的 過(guò)渡載體2; (5) 再用設(shè)置有同目的基因酶切位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)同尾酶對(duì)過(guò)渡載體2進(jìn)行酶切回收，并與步 驟(2)中回收的目的片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，獲得具有"目的片段-內(nèi)含子-反向重復(fù)目的片段" 結(jié)構(gòu)的過(guò)渡載體3; (6) 最后將過(guò)渡載體3中的"目的片段-內(nèi)含子-反向重復(fù)目的片段"結(jié)構(gòu)連同終止子酶 切回收后連入對(duì)應(yīng)的終載體中，即獲得RNAi載體。8. -種權(quán)利要求1所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。9. 一種權(quán)利要求1所述基于同尾酶構(gòu)建的RNAi載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK106086063SQ201610409729
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月12日
【發(fā)明人】張先文, 王東芳, 沈志成
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)