miRNA-34a過表達重組載體的構(gòu)建及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及miRNA-34a過表達重組載體的構(gòu)建及應用，尤其在研制阿爾茨海默病 的治療藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] microRNA是一類長度約為22~25個核苷酸的單鏈短序列小RNA，它不編碼蛋白質(zhì)， 但能以其5'末端第2~8位核苷酸以非完全性堿基配對的方式結(jié)合于同源mRNA的3'UTR( 3' 非轉(zhuǎn)譯區(qū)），通過抑制mRNA的表達或是誘導其降解，對mRNA進行負性調(diào)控，影響相關(guān)蛋白的 生成。microRNA-34a(miR_34a)是microRNA的一種，它在腦組織、心肌、肺、肝臟、前列腺等全 身各部位組織中廣泛表達，micRNA34a的前體序列如序列1所示，成熟micRNA34a序列如序列 2所示，在體內(nèi)先形成micRNA34a的前體序列，然后體內(nèi)加工形成了成熟的micRNA34a。其編 碼基因定位于1號染色體長臂3區(qū)6帶（1ρ36)，染色體（1ρ36)部位的缺失可發(fā)生于多種腫瘤 細胞中，如神經(jīng)母細胞瘤、肝癌、結(jié)直腸癌等，因此，miR-34a常被用于研究在腫瘤發(fā)生中所 起的作用；此外，miR-34a可以與多種基因的mRNA非特異性結(jié)合，如MYCN、BCL 2、SIRT 1、 NOTCH 1、JAG 1、CCND 1、⑶K 6以及E2F3等，這些基因參與體內(nèi)各種生物過程如腫瘤發(fā)生及 惡性轉(zhuǎn)移、神經(jīng)發(fā)生及分化、血管生成、細胞凋亡及壞死等，miR-34a因此也被廣泛地用于研 究在腫瘤中所起的作用。
[0003] 然而，關(guān)于miR_34a在阿爾茨海默病或焦慮癥中所起的作用現(xiàn)有技術(shù)中尚未見報 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明通過構(gòu)建miR-34a(miRNA-34a)過表達重組表達載體，并在整體動物水平成 功高效過度表達，發(fā)現(xiàn)miR-34a過度表達可促進小鼠焦慮樣行為學障礙如阿爾茨海默病焦 慮樣障礙，表明miR-34a可成為治療此類疾病重要候選靶點。
[0005] 本發(fā)明的目的是提供miR_34a過表達重組表達載體，其含有序列1所示的序列。
[0006] 所述載體是相關(guān)病毒重組載體。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供構(gòu)建該miR_34a過表達重組表達載體的方法，該方法 包括：（A)設計引物，PCR擴增miR-34a基因；（B)將擴增的基因和表達載體酶切，連接目的基 因和表達載體;（C)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng);（D)鑒定后提取重組質(zhì)粒并包裝。
[0008] 所述引物是5'-CGGGATCCGCAGCCTCTCCATCTTC-3'；5'_ GGAATTCGGCTAGGAGGATCAACACAC-3,〇
[0009] 本發(fā)明另外提供了一種評價焦慮癥治療藥物或篩選焦慮癥藥物的方法，該方法包 括使用miR-34a過表達重組表達載體構(gòu)建焦慮癥動物模型，比較治療前后的焦慮樣行為學 障礙的改善情況。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種評價阿爾茨海默病治療藥物或篩選阿爾茨海默病藥物的方 法，該方法包括使用miR-34a過表達重組表達載體構(gòu)建阿爾茨海默病動物模型，比較治療前 后的焦慮樣行為學障礙的改善情況。
[0011]因此，本發(fā)明的miR-34a過表達重組表達載體可用于篩選阿爾茨海默病治療藥物 或焦慮癥治療藥物的用途。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點
[0013]本發(fā)明通過構(gòu)建miR_34a過表達腺相關(guān)病毒重組載體并在小鼠海馬中過表達，確 定miR-34a對焦慮障礙行為學的影響。研究結(jié)果顯示，該重組載體在整體動物水平成功高效 表達，miR-34a過表達可導致焦慮障礙樣的行為，表明miR-34a可成為治療此類疾病重要候 選靶點。本發(fā)明為研究miR-34a表達失調(diào)相關(guān)疾病(如阿爾茨海默病焦慮樣障礙)提供新的 技術(shù)手段。
【附圖說明】
[0014] 圖1為PCR擴增miR-34a基因圖；
[0015] M:DNA marker(2000bp)
[0016] 1：Sample DNA
[0017] 圖2為菌落PCR鑒定結(jié)果圖；
[0018] M：DNA marker(2000bp)
[0019] 1~2:重組質(zhì)粒 PAAV_miR-34a 單菌落;3 :pAAV-ires_GFP
[0020] 圖3為目的基因片段的序列測定圖；
[0021]圖4為miR_34a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系在光鏡和熒光顯微鏡下的圖片。
[0022] (A)miR-34a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系在光鏡下的圖片，圖中的標尺代表lOOymjB)是在熒 光顯微鏡下的圖片，來自與(A)相同的視野。本發(fā)明構(gòu)建的miR-34a表達載體含有GFP結(jié)構(gòu) 域，在表達miR-34a的同時可以表達GFP，因此陽性細胞可以發(fā)綠色熒光。圖中的標尺代表 100μL?ο
[0023]圖5為miR-34a過表達載體在小鼠海馬CA3區(qū)的表達情況。
[0024] 圖6為WT小鼠腦組織CA3區(qū)miR-34a表達情況圖。
[0025] 圖7為miR_34a過表達對WT小鼠曠場實驗行為學的影響圖。
[0026] (A)中央?yún)^(qū)時間；（B)總路程。結(jié)果表示為平均值土標準誤，每組8-10只小鼠；用t檢 驗對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，以P〈〇. 05認為有統(tǒng)計學差別，***p〈0.001 vs WT。
[0027] 圖8為miR_34a過表達對WT小鼠高架十字迷宮實驗行為學的影響圖。
[0028] (A)進入開臂次數(shù)；（B)進入閉臂次數(shù)；（C)開臂時間；（D)閉臂時間；（E)進入開臂次 數(shù)占進入開臂閉臂總次數(shù)的比例；（F)總路程。結(jié)果表示為平均值土標準誤，每組8-10只小 鼠；用t檢驗對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，以p〈0.05認為有統(tǒng)計學差別，*p〈0.05，***p〈0.0 Olvs WT〇
【具體實施方式】
[0029] 以下通過【具體實施方式】來說明本發(fā)明。
[0030] 一、miR-34a過表達載體構(gòu)建
[0031] 1、序列獲得和引物設計
[0032] 從叱131的仙(：16〇1:丨(16數(shù)據(jù)庫661^&111<:上找到小鼠111丨1?-34&基因序列（六(^68 8；[011 如4?606691)，然后利用01丨807軟件分別選取各個^3兩端的部分序列進行分析，確定上 下游引物，再在上游引物的5'端前面加上保護堿基和BamH頂每切位點序列(CGGGATCC)，下 游引物的5 '端加上保護堿基和EcoR頂每切位點序列(CGGAATTC)。引物委托上海生工生物有 限公司進行合成，其序列見表1所示：
[0033] 表l.miR_34a基因擴增引物
[0034]
[0035] 2、模板DNA的獲得
[0036]培養(yǎng)Ni3T3細胞，用Blood&Cell Culture DNA Mini Kit(QIAGEN)提取總DNA，具體 方法參考試劑盒說明書。
[0037] 3、目的基因的獲得
[0038]將新合成的引物加入TE buffer溶解，調(diào)整引物的最終濃度為ΙΟμΜ，以上述DNA為 模板，加入引物，PrimeSTAR Max DNA Polymerase。
[0039] PCR 反應體系（10ul): 水: 4ul PrimcSTAR Max： Sul
[0040] 上游引物： 0.3u! 下游引物： 〇.3ul -模板: 〇.4ul
[0041 ] PCR反應條件如下： 98 °C 5mm
[0042] 98 T： 10 s 55 V 10 s
[0043] 72V 15s
[0044] PCR循環(huán)為30個，PCR完成后跑1 %的瓊脂糖凝膠鑒定，結(jié)果見圖1。
[0045] 將上述反應體系擴大10倍，根據(jù)Marker來確定目的基因，切膠回收(步驟參照膠回 收試劑盒）。
[0046] 4、目的基因和表達載體的雙酶切
[0047] (l)miR-34a 基因酶切體系（50ul): 目的基因: 30ul 反應 buffer.: 5ul
[0048] 水: l〇ul EcoKJ： 2,Sul BanHI; 2.5ul
[0049] (2)pAAV-ZSGREEN-miRNA載體酶切體系（50ul): 載體： 20ul Bullcr： Sul
[0050] 水 20ul EcoRI： 2,5ul BamHh 2.5ul
[0051] 將上述反應體系置于37°C，過夜或酶切5小時。電泳檢測酶切產(chǎn)物，并切膠回收。 pAAV-ZSGREEN-miRNA載體購自優(yōu)寶生物(VT2243)。
[0052] 5、連接目的基因和pAAV-ZSGREEN-miRNA
[0053] 將上述酶切的目的基因 miR-34a連接到酶切載體pAAV-ZSGREEN-miRNA上形成重組 質(zhì)粒PAAV-miR-34a，同時取酶切的pAAV-ZSGREEN-miRNA和無菌水為陰性對照，按表2配制 l〇ul的連接體系：
[0054] 表2· 10μ1 miR-34a 連接體系
[0055]
[0056] 然后置于22Γ3-6小時，或4Γ過夜。
[0057] 6、轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10和涂板
[0058] 取5ul連接產(chǎn)物和陰性對照分別加到50ul的感受態(tài)Top 10中，輕柔的混勻，4°C冰 浴30min，然后42 °C熱激lmin，4°C冷卻，加100ul無抗性培養(yǎng)基，置于搖床200轉(zhuǎn)速1小時。將 菌液涂布在氨芐青霉素板上，分別標記為pAAV-MIR-34A、pAAV( -）。37°C培養(yǎng)14h，重組質(zhì)粒 PAAV-MIR-34A平板長出單菌落，而pAAV(-)平板沒有單菌落。
[0059] 7、菌落PCR鑒定和測序
[0060] (1)菌落?0?鑒定
[0061 ] 隨機挑取10個單菌落，同時利用pAAV-ires-GFP為模板，引物miR-34a-F、miR-34a- R進行PCR擴增，結(jié)果見圖2。
[0062] (2)測序鑒定
[0063]將1、2號樣品送上海生工測序，結(jié)果見圖3。
[0064] 8、大量提取重組質(zhì)粒
[0065]測序正確后，將測序正確的菌液按1:500擴大培養(yǎng)，放37°C培養(yǎng)過夜。收集菌液，提 取質(zhì)粒，方法參考E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid Max Kit Spin說明書。
[0066] 9、包裝腺相關(guān)病毒AAV9
[0067] 按照AAV病毒包裝試劑盒說明書步驟將重組質(zhì)粒 分別和AAV2/9、pHELP質(zhì)粒共感染AAV9細胞，包裝腺相關(guān)病毒，24h觀察細胞的狀態(tài)和熒光強 度，結(jié)果見圖4。481!收集病毒上清，并超速離心純化病毒，最后將純化的病毒用PBS溶解，定 量分析。
[0068] 10、病毒滴度檢測
[0069] (1)取20ul濃縮病毒液，加入lul RNAse-free DNAse，混勻，37°C水浴反應30min。
[0070] (2)4°C，12000rpm，離心10min，取 10ul上清到另一個無菌的 1.5ml EP管中。
[0071] (3)加入90ul