用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的人源化重組載體和細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組載體和重組細(xì)胞，具體涉及一種用于檢測芳香烴受體配體(例如二惡英類物質(zhì))的人源化重組載體以及重組細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述重組載體和細(xì)胞在芳香烴受體配體(例如二惡英類物質(zhì))生物檢測方面的用途。本發(fā)明將包含DRE序列的人類CYP1A1基因的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子的部分區(qū)段克隆到帶有熒光素酶報(bào)告基因的基礎(chǔ)載體上，所獲得的重組載體和細(xì)胞對(duì)二惡英有良好的響應(yīng)，最低檢測限可達(dá)到0.3pM，特別適合用于評(píng)估芳香烴受體配體(例如二惡英類物質(zhì))對(duì)人體健康的影響及其相關(guān)機(jī)理研究。
【專利說明】
用于二惡英類物質(zhì)生物檢測的人源化重組載體和細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種重組載體和重組細(xì)胞，具體涉及一種用于檢測芳香烴受體(AhR， 也叫二惡英受體)的配體(例如二惡英類物質(zhì)）的人源化重組載體以及包含該重組載體的重 組細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述重組載體和細(xì)胞用于檢測芳香烴受體的配體(例如二惡英類物 質(zhì)）的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 二惡英類污染物（Dioxins)包括多氯二苯并二惡英（PCDDs)、多氯二苯并呋喃 (PCDFs)和多氯聯(lián)苯(PCBs)等，是一類典型的持久性有機(jī)污染物，對(duì)人體具有廣泛的毒性效 應(yīng)。由于其具有環(huán)境持久性、可以遠(yuǎn)距離迀移、難降解及生物累積性，將對(duì)人類健康構(gòu)成長 期的威脅。歷史上二惡英的人體暴露事件已屢見不鮮。例如1949年，美國孟山都化工廠的一 次混有二惡英類物質(zhì)的化學(xué)品泄露導(dǎo)致當(dāng)?shù)鼐用窕忌下瑞畀?、肝臟疾病、癌癥等，并導(dǎo)致了 部分居民的死亡;2004年，烏克蘭總統(tǒng)尤先科在二惡英中毒后患上了嚴(yán)重的氯痤瘡等一系 列疾病。二惡英的人體暴露事件以及其帶來的嚴(yán)重健康危害引起了人們對(duì)二惡英健康效應(yīng) 的廣泛關(guān)注和深入研究。研究表明，二惡英類物質(zhì)能夠干擾神經(jīng)系統(tǒng)功能及發(fā)育、阻礙生 殖、引發(fā)肝臟毒性、促進(jìn)腫瘤的生成、造成嚴(yán)重的皮膚病變等等。
[0003] 正是由于人們對(duì)二惡英類污染物的持續(xù)高度關(guān)注，目前對(duì)這類污染物的毒理機(jī)制 的研究是持久性有機(jī)污染物中最完善和最深入的。研究表明，二惡英受體(AhR，芳香烴受 體)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是二惡英類污染物造成毒性效應(yīng)的主要分子機(jī)制。二惡英類污染 物在進(jìn)入細(xì)胞后與胞質(zhì)內(nèi)的AhR結(jié)合，并活化AhR，隨后二惡英-AhR復(fù)合物轉(zhuǎn)移入核，在細(xì)胞 核中聚集并與AhR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合形成異源二聚體，進(jìn)而與基因上游的特異性增強(qiáng)子即二惡 英反應(yīng)原件(Dioxins responsive element,DRE)結(jié)合，激活效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，其中最經(jīng)典 的效應(yīng)基因包括CYP家族成員，如CYP1A1等。二惡英類物質(zhì)的生物檢測系統(tǒng)正是基于上述生 物過程而構(gòu)建的。其中基于報(bào)告基因的二惡英類生物檢測系統(tǒng)具有檢測周期短、成本低、高 靈敏度的特征，并在評(píng)價(jià)二惡英類污染物總體毒性方面有突出的優(yōu)勢，適用于二惡英類污 染物的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
[0004] 隨著對(duì)AhR信號(hào)通路的研究的深入，越來越多的證據(jù)表明該受體可能具有重要的 生物學(xué)功能，包括維持免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的平衡，調(diào)節(jié)腸道固有免疫功能，參與心血管及神經(jīng)系 統(tǒng)發(fā)育等等。同時(shí)也提出一系列內(nèi)源性配體可以激活A(yù)hR并引發(fā)下游信號(hào)通路機(jī)制從而引 起一系列功能基因表達(dá)的改變，例如色氨酸的光解產(chǎn)物6-甲酰基吲哚并[3，2-B]咔唑 (FICZ)，其激活A(yù)hR的能力與最強(qiáng)的二惡英類污染物2,3，7,8_四氯二苯并二惡英(T⑶D)相 當(dāng)。另外，研究人員也發(fā)現(xiàn)一系列的藥物及中間體，天然產(chǎn)物及生物代謝物也可以作用于 AhR，激活或抑制其下游的信號(hào)通路及基因表達(dá)，從而引起一系列分子及細(xì)胞效應(yīng)。隨著前 述基于AhR的生物檢測系統(tǒng)的建立和完善，不斷有更多的作用于AhR的化合物被發(fā)現(xiàn)，這些 化合物可能成為一些藥物研發(fā)的備選化合物。
[0005] 目前已有的生物檢測系統(tǒng)大多基于小鼠 CYP1A1基因的增強(qiáng)子所構(gòu)建，雖然對(duì)二惡 英類污染物具有良好的響應(yīng)，但是并不能真實(shí)反映出二惡英類物質(zhì)對(duì)人體的影響。原因在 于AhR信號(hào)通路具有顯著的種屬差異性，例如一些多氯聯(lián)苯類物質(zhì)能夠與2,3,7,8_四氯二 苯并二惡英(TCDD)競爭結(jié)合小鼠 AhR，但不會(huì)競爭結(jié)合人類AhR，說明鼠源和人源的AhR與二 惡英類化合物的結(jié)合方式存在差異；另外也有證據(jù)表明鼠源和人源的AhR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的序列不同。
[0006] 因此，無論是環(huán)境監(jiān)測、公共衛(wèi)生，還是活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及新藥研發(fā)都迫切需要人 源化的芳香烴受體配體(例如二惡英類物質(zhì)）的生物檢測系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)和大量創(chuàng)造性勞動(dòng)，提供了基于人的CYP1A1基因啟 動(dòng)子的生物檢測系統(tǒng)，其靈敏度高，對(duì)芳香烴受體的配體化合物(例如二惡英類化合物)有 良好的響應(yīng)，由此完成了本發(fā)明。
[0008] 本發(fā)明第一方面涉及重組載體，所述重組載體沿著其基因轉(zhuǎn)錄的方向可操作地連 接有來源于人的CYP1A1啟動(dòng)子或該啟動(dòng)子的部分區(qū)段，以及報(bào)告基因；
[0009] 所述人的CYP1A1啟動(dòng)子或該啟動(dòng)子的部分區(qū)段調(diào)節(jié)所述報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。
[0010] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其中所述人的CYP1A1啟動(dòng)子的序列包含人的CYP1A1 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-3534~-2448所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID N0: 3所示的序列。
[0011]在本發(fā)明中，所述-3534~-2448所示的序列的變體是指由于不同人群所產(chǎn)生的 CYP1A1啟動(dòng)子的不同序列，其在序列長短和具體序列上可能有微小的差異，例如可以包括 個(gè)別堿基的插入、缺失或替換等，但只要其具有與本發(fā)明的人的CYP1A1啟動(dòng)子相同的功能， 即包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0012] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其中所述人的CYP1A1啟動(dòng)子的部分區(qū)段包括該啟動(dòng) 子的基本區(qū)段和兩個(gè)或多個(gè)(例如3、4、5、6、7、8個(gè))相同或不同的二惡英反應(yīng)元件(01^)富 集區(qū)段，并且所述的兩個(gè)或多個(gè)DRE富集區(qū)段位于所述啟動(dòng)子的基本區(qū)段的上游。
[0013] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，人的CYP1A1啟動(dòng)子的基本區(qū)段和兩個(gè)相同的二惡英 反應(yīng)元件富集區(qū)段之間可操作地連接。
[0014] 在本發(fā)明中，所述啟動(dòng)子的基本區(qū)段為能夠啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動(dòng)子核心 區(qū)段。
[0015] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其中所述的基本區(qū)段包含人的CYP1A1基因轉(zhuǎn)錄起始 位點(diǎn)上游的-2706~-2448所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID N0:10所示的序 列。
[0016] 在本發(fā)明中，所述-2706~-2448所示序列的變體是指由于不同人群所產(chǎn)生的 CYP1A1啟動(dòng)子基本區(qū)段的不同序列，或者由于在區(qū)段的劃分標(biāo)準(zhǔn)上略有不同而產(chǎn)生的基本 區(qū)段的不同序列，該變體在序列長短和具體序列上可能有微小的差異，例如在該序列5'端 和3'端的選擇上可能略有不同，或者可以包括個(gè)別堿基的插入、缺失或替換等，但只要其具 有與本發(fā)明的人的CYP1A1啟動(dòng)子基本區(qū)段相同的功能，即包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0017] 在本發(fā)明中，所述二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上DRE且 DRE位置相對(duì)比較接近的序列區(qū)段。
[0018] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述二惡英反應(yīng)元件（DRE)富集區(qū)段含有人的 CYP1A1啟動(dòng)子5'端的3個(gè)DRE序列。
[0019] 在本發(fā)明中，所述二惡英反應(yīng)元件(DRE)選自GCGTG和CACGC。
[0020] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其中所述的二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段是指包 含人的CYP1A1啟動(dòng)子5'端的3個(gè)DRE序列的相應(yīng)區(qū)段，例如包含人的CYP1A1基因轉(zhuǎn)錄起始位 點(diǎn)上游的-3534~-3217所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID N0:11所示的序列。
[0021] 在本發(fā)明中，所述-3534~-3217所示序列的變體是指由于不同人群所產(chǎn)生的含有 三個(gè)DRE的富集區(qū)段的不同序列，或者由于在區(qū)段的劃分標(biāo)準(zhǔn)上略有不同而產(chǎn)生的富集區(qū) 段的不同序列，該變體在序列長短和具體序列上可能有微小的差異，例如在該序列5'端和 3'端的選擇上可能略有不同，或者可以包括個(gè)別堿基的插入、缺失或替換等，但只要其具有 與本發(fā)明的DRE富集區(qū)段相同的功能，即包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0022] 在本發(fā)明中，所述人的CYP1A1啟動(dòng)子的基本區(qū)段和兩個(gè)或多個(gè)二惡英反應(yīng)元件富 集區(qū)段之間的連接方式、或兩個(gè)或多個(gè)二惡英反應(yīng)元件富集區(qū)段之間的連接方式為本領(lǐng)域 所公知，例如為可操作地連接，例如可以通過linker或酶切位點(diǎn)序列等多種方式可操作地 連接。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其中所述的兩個(gè)或多個(gè)二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段 之間、或啟動(dòng)子的基本區(qū)段與兩個(gè)或多個(gè)二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段之間通過酶切位 點(diǎn)序列連接。
[0023] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，人的CYP1A1啟動(dòng)子的基本區(qū)段和兩個(gè)二惡英反應(yīng)元 件富集區(qū)段之間連接后的序列如SEQ ID N0:12所示。
[0024] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其中所述的報(bào)告基因可以選自熒光素酶(例如為螢 火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶)基因、熒光蛋白（例如綠色、黃色、青色、紅色熒光蛋白）基因 或其它報(bào)告基因。
[0025] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述重組載體的基礎(chǔ)載體可以選自適用于真核細(xì)胞 表達(dá)的含有報(bào)告基因的載體，例如pGL、pECFP、pEmcherry、pEGFP、pEmvenus、pEYFP等系列載 體。
[0026] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述重組載體的基礎(chǔ)載體為pGL系列載體。所述重組 載體是在PGL系列載體的螢火蟲熒光素酶基因的上游可操作地連接有所述人的CYP1A1啟動(dòng) 子或該啟動(dòng)子的部分區(qū)段。
[0027] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，其是在基礎(chǔ)載體的多克隆位點(diǎn)處連接有所述人的 CYP1A1啟動(dòng)子或該啟動(dòng)子的部分區(qū)段。
[0028]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其中所述的pGL系列載體選自pGL2、pGL3、pGL4和 pGL6〇
[0029] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，其中所述的pGL系列載體為pGL3系列載體，例如為 pGL3_bas i c 載體。
[0030] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其為重組載體pCL-HFL或PCL-HCR2。
[0031] 本發(fā)明第二方面涉及重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的重組載體。
[0032] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，其中所述細(xì)胞為含有芳香烴受體的來源于人的細(xì)胞 (例如為來源于人的腫瘤細(xì)胞），例如為來源于人的肝源、肺源、腎源、神經(jīng)源或上皮源細(xì)胞 等。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為來源于人的肝癌細(xì)胞，例如為ifep G2細(xì)胞。
[0033] 本發(fā)明第三方面涉及檢測試劑或試劑盒，其含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的重組載 體或第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞。
[0034] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述檢測試劑或試劑盒用于檢測芳香烴受體的配 體，或者在體外或體內(nèi)用于評(píng)估芳香烴受體的配體對(duì)人體(包括人的細(xì)胞、組織或器官）的 影響，或者在體外或體內(nèi)用于研究芳香烴受體的配體與人體(包括人的細(xì)胞、組織或器官） 相互作用的機(jī)理。
[0035] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的重組載體或第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞 或第三方面的檢測試劑或試劑盒用于檢測芳香烴受體的配體的用途，或者在體外或體內(nèi)用 于評(píng)估芳香烴受體的配體對(duì)人體(包括人的細(xì)胞、組織或器官）的影響的用途，或者在體外 或體內(nèi)用于研究芳香烴受體的配體與人體(包括人的細(xì)胞、組織或器官)相互作用的機(jī)理的 用途，或者在制備試劑中的用途，所述試劑用于在體外或體內(nèi)評(píng)估芳香烴受體的配體對(duì)人 體(包括人的細(xì)胞、組織或器官）的影響或者研究芳香烴受體的配體與人體(包括人的細(xì)胞、 組織或器官)相互作用的機(jī)理。
[0036] 本發(fā)明還涉及一種檢測芳香烴受體的配體、或者在體外或體內(nèi)評(píng)估芳香烴受體的 配體對(duì)人體(包括人的細(xì)胞、組織或器官）的影響或研究芳香烴受體的配體與人體(包括人 的細(xì)胞、組織或器官)相互作用的機(jī)理的方法，所述方法包括使用本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的 重組載體或第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞或第三方面的檢測試劑或試劑盒的步驟。
[0037] 在本發(fā)明中，其中所述的芳香烴受體的配體是指能夠與芳香烴受體結(jié)合進(jìn)而活化 或抑制芳香烴受體的物質(zhì)，例如選自二惡英類化合物以及其它能夠與芳香烴受體結(jié)合的化 合物或其混合物。優(yōu)選地，其中所述的二惡英類化合物選自多氯二苯并二惡英(PCDDs)(例 如2,3,7,8_四氯二苯并二惡英）、多氯二苯并呋喃(PCDFs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、鹵代芳香烴 (HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/ Fs和PBBs)及其它混合鹵代化合物中的一種或兩種以上。優(yōu)選地，其中所述其它能夠與芳香 烴受體結(jié)合的化合物例如選自合成藥物及其中間體、植源性藥物、其他天然來源的活性單 體化合物、生物代謝物等，包括吲哚類化合物、黃酮類化合物、咪唑類、嘧啶類化合物、生物 堿等，例如奧美拉唑（0ΜΕ)、2-巰基-5-甲氧基苯并咪唑（0ΜΕ合成中間體）、伯氨喹、人參皂 苷、金絲桃苷、黃芩素、桑辛素、芒柄花素，次野鳶尾黃素、異鼠李素、靛藍(lán)、靛玉紅、大黃素、 吳茱萸次堿、煙堿、6-甲酰吲哚[3，2-b]咔唑(FICZ)、犬尿喹啉酸等。
[0038] 在本發(fā)明中，所述人的CYP1A1啟動(dòng)子是指該基因的完整啟動(dòng)子，其包含該啟動(dòng)子 的基本區(qū)段和能夠進(jìn)一步調(diào)芐基因轉(zhuǎn)錄的區(qū)段，例如增強(qiáng)子序列等。所述基本區(qū)段可以實(shí) 現(xiàn)啟動(dòng)子的基本功能，例如包含TATA框、GC框和CAAT盒等。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述人 的CYP1A1啟動(dòng)子是指人類CYP1A1基因5'端位置由-3534bp到-2448bp的序列，其包含該啟動(dòng) 子的基本區(qū)段和含有6個(gè)DRE序列的區(qū)段。
[0039] 在本發(fā)明中，有關(guān)人的CYP1A1啟動(dòng)子的位點(diǎn)計(jì)算方法為本領(lǐng)域公知，例如是以其 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG中的A為1，A上游的一個(gè)堿基為-1，以此類推。
[0040] 發(fā)明的有益效果
[00411本發(fā)明將包含DRE序列的人類CYP1A1基因的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子的部分區(qū)段克隆到帶 有熒光素酶報(bào)告基因的基礎(chǔ)載體上，得到重組二惡英報(bào)告基因載體以及含有該載體的細(xì) 胞。所獲得的重組載體和細(xì)胞對(duì)二惡英有良好的響應(yīng)，最低檢測限可達(dá)到0.3pM，特別適合 用于評(píng)估芳香烴受體的配體(例如二惡英類物質(zhì))對(duì)人體生理功能及健康的影響及其相關(guān) 機(jī)理研究。
【附圖說明】
[0042] 圖1為pCL-HFL載體構(gòu)建示意圖；
[0043] 圖2為pCL-HCR2載體構(gòu)建示意圖；
[0044] 圖3為pCL-HFL瞬轉(zhuǎn)Hep G2后TCDD刺激不同時(shí)間的比較；
[0045] 圖4為pCL-HCR2瞬轉(zhuǎn)Hep G2后T⑶D刺激不同時(shí)間的比較；
[0046]圖5為pCL-HFL瞬轉(zhuǎn)Hep G2后對(duì)梯度濃度的T⑶D的反應(yīng)情況；
[0047]圖6為pCL-HCR2瞬轉(zhuǎn)Hep G2后對(duì)梯度濃度的T⑶D的反應(yīng)情況；
[0048]圖7為pCL-HFL與pCL-HCR2載體在低濃度TCDD刺激下的反應(yīng)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0050] pGL3_basic vector購自Promega.
[0051] 基因組抽提試劑盒購自康為世紀(jì)(北京）.
[0052] pRL_SV40,購自 Promega.
[0053] ltx 試劑盒（Lipofectamine? ltx&pIus Reagent)貝勾自 Invitrogen.
[0054] 雙報(bào)告檢測試劑盒（Dual-L:uciferas.e? Reporter Assay System)購自 Promega ·貨號(hào)E1910 ·
[0055] Hep G2細(xì)胞，Michael S.Denison贈(zèng)。
[0056] 酶標(biāo)儀:GloMax Mluti+(Promega，USA)
[0057] 實(shí)施例1載體的構(gòu)建
[0058] (l)pCL-HFL 載體的構(gòu)建
[0059] 人類基因組DNA來自于Hep G2細(xì)胞，按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方法抽提。并通過標(biāo)準(zhǔn)的分子 克隆手段分別構(gòu)建獲得pCL-HFL(圖1)。
[0060] 本實(shí)驗(yàn)的目的是構(gòu)建包括人類CYP1A1啟動(dòng)子(-3534~-2448)原始序列的二惡英 報(bào)告基因檢測載體，該序列包含6個(gè)DRE序列。以人類基因組DNA為模板，用以下引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)。
[0061 ] 5 ' 引物為：CGGGGTACCGAGGCTGGCCCTTTAAGAGC(SEQ ID NO: 1)
[0062] 3'引物為：CCCAAGCTTACTGCCACCTTTATAGGCGG(SEQ ID NO:2)
[0063] 獲得PCR片段后，以Κρη I和Hind ΙΠ 雙酶切，并對(duì)載體pGL3-basic進(jìn)行同樣的雙酶 切，最后將該片段構(gòu)建入pGL3-basic中。最后經(jīng)酶切測序鑒定后，獲得pCL-HFL載體。
[0064]其中人類CYP1A1啟動(dòng)子（-3534~-2448)的序列為（其中帶下劃線部分為DRE序 列）：
[0066] (2)pCL_HCR2 載體的構(gòu)建
[0067] 本載體的構(gòu)建分為三步，即分別獲得CYP1A1啟動(dòng)子的基本區(qū)段和兩個(gè)相同的富含 DRE區(qū)段，最后把該三段構(gòu)建在一起(見圖2)。第一段為CYP1A1啟動(dòng)子的基本部分，包括(-2706~-2448)區(qū)段，共259bp。人類基因組DNA來自于Hep G2細(xì)胞，按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方法抽 提。以人類基因組DNA為模板，用如下引物進(jìn)行PCR:
[0068] 5'引物為：GGA AGATCTGGTTCTGCACTGCCCTTG(SEQ ID N0:4)
[0069] 3'引物為：CCCAAGCTTACTGCCACCTTTATAGG(SEQ ID NO:5)
[0070] 獲得PCR片段后，以Hind ΙΠ 和Bglll雙酶切，并對(duì)載體pGL3-Basic進(jìn)行同樣的雙酶 切，最后將該片段構(gòu)建入pGL3-Basic中。
[0071] 克隆兩個(gè)相同的CYP1A1啟動(dòng)子的DRE富集區(qū)段（-3534~-3217)。該區(qū)段包含3個(gè) DRE序列，長度為318bp。同樣以人類基因組DNA為模板，用如下引物進(jìn)行PCR:
[0072]第一對(duì)該DRE富集區(qū)域的引物為：
[0073] 5'引物為：CGGGGTACCGAGGCTGGCCCTTTAAGA(SEQ ID N0:6)
[0074] 3 ' 引物為：CGACGCGTTGGCAGAGCACAGAAATC(SEQ ID NO: 7)
[0075] 第二對(duì)該DRE富集區(qū)域的引物為：
[0076] 5'引物為：CGACGCGTGAGGCTGGCCCTTTAAGA(SEQ ID N0:8)
[0077] 3'引物為：CCCCCCGGGTGGCAGAGCACAGAAATC(SEQ ID N0:9)
[0078] 獲得PCR片段后分別以Κρη I和Mlu I、Mlu I和Xmal雙酶切并分別構(gòu)建入前述包含 CYP1A1基本啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體中，經(jīng)鑒定確認(rèn)后，獲得pCL-HCR2。
[0079]所插入的基本啟動(dòng)子(-2706~-2448)序列是：
[0080]

[0081 ] 其中插入片段在上述序列的5'端及3'端分別還包含Bglll(AGATCT)和Hind m (AAGCTT)限制性內(nèi)切酶序列。
[0082]所插入的DRE富集區(qū)段(-3534~-3217)序列是(其中帶下劃線部分為DRE序列）：
[0084] 插入片段在上述序列的5'端及3'端分別還包含Kpn I(GGTACC)和Mlu I(ACGCGT)、 Mlu I(ACGCGT)及Xmal(CCCGGG)限制性內(nèi)切酶序列。將三個(gè)片段均插入pGL3-Basic載體后 獲得PCL-HCR2載體。
[0085]插入上述三個(gè)片段后，包含酶切位點(diǎn)的整個(gè)序列為（其中帶下劃線部分為DRE序 列）：
[0087]實(shí)施例2載體瞬轉(zhuǎn)Hep G2細(xì)胞獲得最佳暴露時(shí)間
[0088]將Hep G2細(xì)胞以1 X 105/孔的數(shù)量接種到24孔板中，同時(shí)用脂質(zhì)體(LTX)瞬轉(zhuǎn)載 體。即0.5yg載體(pCL-HFL或pCL-HCR2載體）另加1/50量的pRL-SV40(對(duì)照?qǐng)?bào)告基因載體，表 達(dá)海腎熒光素酶)共轉(zhuǎn)細(xì)胞22-24小時(shí)。以T⑶D終濃度為10nM的α-ΜΕΜ培養(yǎng)基(DMS0含量1%) 培養(yǎng)該細(xì)胞4h、12h、24h、48h，而以終濃度1 % DMS0的培養(yǎng)基(不含TCDD)在相同條件下處理 的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。到預(yù)定時(shí)間后，棄去原培養(yǎng)基，用500ml PBS清洗后加入200μ1細(xì)胞裂 解液，400r/min震蕩15分鐘。然后分別吸取50μ1細(xì)胞裂解液到96孔白色不透明酶標(biāo)板中，每 個(gè)樣品重復(fù)3次。按照說明書配好雙報(bào)告檢測所用底物，然后用帶有自動(dòng)加樣栗的酶標(biāo)儀分 別檢測TCDD誘導(dǎo)的螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)值和陰性對(duì)照的反應(yīng)值。最后以pRL-SV40的反應(yīng) 值作為系統(tǒng)對(duì)照，獲得不同誘導(dǎo)時(shí)間下，TCDD誘導(dǎo)的螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)值相對(duì)于其溶 劑DMSO誘導(dǎo)的螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)值的倍數(shù)情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得出的時(shí)間效應(yīng)圖 如圖3和圖4。其中"倍數(shù)"的計(jì)算方法為：（待測載體的反應(yīng)值/該孔pRL-SV40的反應(yīng)值)/(陰 性對(duì)照的反應(yīng)值/該孔PRL-SV40的反應(yīng)值），以下各圖的計(jì)算方法與此相同。
[0089] 由圖可見，在所選時(shí)間范圍內(nèi)，載體的響應(yīng)倍數(shù)隨著時(shí)間的增加而增大，但是為了 未來檢測方便，選取24小時(shí)為最佳暴露時(shí)間；并且從圖中可以看出，pCL-HCR2的響應(yīng)倍數(shù)大 于pCL-HFL，前者大約是后者的兩倍以上。而響應(yīng)倍數(shù)一般作為載體篩選的一個(gè)重要指標(biāo)， 響應(yīng)倍數(shù)越高，不同濃度二惡英樣品表現(xiàn)出的區(qū)別越明顯，因此更有利于提高樣品檢測的 靈敏度和準(zhǔn)確性，同時(shí)可降低對(duì)檢測器的要求從而降低檢測成本。
[0090] 實(shí)施例3載體瞬轉(zhuǎn)Hep G2細(xì)胞獲得濃度效應(yīng)曲線
[0091]將Hep G2細(xì)胞以1 X 105/孔的數(shù)量接種到24孔板中，同時(shí)用脂質(zhì)體(LTX)瞬轉(zhuǎn)載 體。即0 · 5yg載體(pCL-HFL、pCL-HCR2或pGL6 · 1載體)另加1/50量的pRL-SV40(對(duì)照?qǐng)?bào)告基因 載體，表達(dá)海腎熒光素酶)共轉(zhuǎn)細(xì)胞22-24小時(shí)。吸取舊培養(yǎng)基，以TCDD終濃度為1.0 Χ10-13 ~1.0 X 10-8M TCDD的α-ΜΕΜ培養(yǎng)基(DMS0含量1 % )培養(yǎng)該細(xì)胞24h，而以終濃度1 %DMS0的培 養(yǎng)基（不含TCDD)在相同條件下處理的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。24h后，棄去原培養(yǎng)基，用500ml PBS清洗后加入200μ1細(xì)胞裂解液，400r/min震蕩15分鐘。然后分別吸取50μ1細(xì)胞裂解液到 96孔白色不透明酶標(biāo)板中，每個(gè)樣品重復(fù)3次。按照說明書配好雙報(bào)告檢測所用底物，然后 用帶有自動(dòng)加樣栗的酶標(biāo)儀分別檢測TCDD誘導(dǎo)的螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)值和陰性對(duì)照的 反應(yīng)值。最后以PRL-SV40的反應(yīng)值作為系統(tǒng)對(duì)照，獲得不同濃度TCDD誘導(dǎo)的螢火蟲熒光素 酶的反應(yīng)值相對(duì)于其溶劑DMS0誘導(dǎo)的螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)值的倍數(shù)情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 計(jì)算得出的時(shí)間效應(yīng)圖如圖5、圖6、圖7。
[0092] 由圖可見，在T⑶D暴露濃度為0.3pM時(shí)，pCL-HFL、pCL-HCR2對(duì)T⑶D的響應(yīng)相對(duì)于其 對(duì)照DMS0開始顯示出明顯的差異(p〈0.05)，即兩種載體的最低檢測限為0.3pM。因此，在靈 敏度上，我們構(gòu)建的質(zhì)粒非常有利于痕量二惡英類物質(zhì)的分析。同時(shí)為降低對(duì)酶標(biāo)儀檢測 參數(shù)的要求，進(jìn)而降低檢測成本，實(shí)現(xiàn)檢測方法的大范圍推廣提供了更加有利的條件。 [0093]盡管本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 重組載體，所述重組載體沿著其基因轉(zhuǎn)錄的方向可操作地連接有來源于人的CYPlAl 啟動(dòng)子或該啟動(dòng)子的部分區(qū)段，以及報(bào)告基因； 所述人的CYPlAl啟動(dòng)子或該啟動(dòng)子的部分區(qū)段調(diào)節(jié)所述報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。2. 權(quán)利要求1的重組載體，其中所述人的CYP IAl啟動(dòng)子的序列包含人的CYPIA1基因轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)上游的-3534~-2448所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID NO:3所示 的序列。3. 權(quán)利要求1的重組載體，其中所述人的CYPlAl啟動(dòng)子的部分區(qū)段包括該啟動(dòng)子的基 本區(qū)段和兩個(gè)或多個(gè)相同或不同的二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段，并且所述的兩個(gè)或多 個(gè)二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段位于所述啟動(dòng)子的基本區(qū)段的上游。4. 權(quán)利要求3的重組載體，其中所述的基本區(qū)段包含人的CYPlAl基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上 游的-2706~-2448所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID NO: 10所示的序列。5. 權(quán)利要求3的重組載體，其中所述的二惡英反應(yīng)元件(DRE)富集區(qū)段是指包含人的 CYPlAl啟動(dòng)子5'端的3個(gè)DRE序列的相應(yīng)區(qū)段，例如包含人的CYPlAl基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游 的-3534~-3217所示的序列或該序列的變體，例如包含SEQ ID NO: 11所示的序列。6. 權(quán)利要求1的重組載體，其中所述的報(bào)告基因選自熒光素酶（例如為螢火蟲熒光素 酶、海腎熒光素酶)基因、熒光蛋白（例如綠色、黃色、青色、紅色熒光蛋白）基因或其它報(bào)告 基因。7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的重組載體，所述重組載體的基礎(chǔ)載體選自適用于真核細(xì)胞表 達(dá)的含有報(bào)告基因的載體，例如pGL、pECFP、pEmcherry、pEGFP、pEmvenus、pEYFP等系列載 體，優(yōu)選地，其中所述的PGL系列載體選自pGL2、pGL3、pGL4和pGL6。8. 權(quán)利要求7的重組載體，其為重組載體pCL-HFL或pCL-HCR2。9. 重組細(xì)胞，其含有權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的重組載體。10. 權(quán)利要求9的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為來源于人的細(xì)胞，例如為來源于人的肝源、 肺源、腎源、神經(jīng)源或上皮源細(xì)胞，例如為人的肝癌細(xì)胞，例如為H印G2細(xì)胞。11. 檢測試劑或試劑盒，其含有權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的重組載體或權(quán)利要求9或10的重 組細(xì)胞。12. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的重組載體或權(quán)利要求9或10的重組細(xì)胞或權(quán)利要求11的檢測 試劑或試劑盒用于檢測芳香烴受體的配體的用途，或者在體外或體內(nèi)用于評(píng)估芳香烴受體 的配體對(duì)人體(包括人的細(xì)胞、組織或器官）的影響的用途，或者在體外或體內(nèi)用于研究芳 香烴受體的配體與人體(包括人的細(xì)胞、組織或器官）相互作用的機(jī)理的用途，或者在制備 試劑中的用途，所述試劑用于在體外或體內(nèi)評(píng)估芳香烴受體的配體對(duì)人體(包括人的細(xì)胞、 組織或器官）的影響或者研究芳香烴受體的配體與人體(包括人的細(xì)胞、組織或器官）相互 作用的機(jī)理。13. -種檢測芳香烴受體的配體、或者在體外或體內(nèi)評(píng)估芳香烴受體的配體對(duì)人體(包 括人的細(xì)胞、組織或器官）的影響或研究芳香烴受體的配體與人體(包括人的細(xì)胞、組織或 器官)相互作用的機(jī)理的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的重組載體或權(quán)利要 求9或10的重組細(xì)胞或權(quán)利要求11的檢測試劑或試劑盒的步驟。14. 權(quán)利要求12的用途或者權(quán)利要求13的方法，其中所述的芳香烴受體的配體選自二 惡英類化合物以及其它能夠與芳香烴受體結(jié)合的化合物或其混合物;優(yōu)選地，其中所述的 二惡英類化合物選自多氯二苯并二惡英(P⑶Ds)(例如2，3,7，8_四氯二苯并二惡英）、多氯 二苯并呋喃(PCDFs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、鹵代芳香烴(HAHs)、多環(huán)芳香烴(PAHs)、氯代二苯醚 和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代(PBDD/Fs和I 3BBs)及其它混合鹵代化合物中的 一種或兩種以上;優(yōu)選地，其中所述其它能夠與芳香烴受體結(jié)合的化合物選自合成藥物及 其中間體，植源性藥物，其他天然來源的活性單體化合物，生物代謝物等，包括吲哚類化合 物、黃酮類化合物、咪唑類、啼啶類化合物、生物堿等，例如奧美拉唑(OME )、2-巰基-5-甲氧 基苯并咪挫(0ΜΕ合成中間體）、伯氨喹、人參皂苷、金絲桃苷、黃芩素、桑辛素、芒柄花素，次 野鳶尾黃素、異鼠李素、靛藍(lán)、靛玉紅、大黃素、吳茱萸次堿、煙堿、6-甲酰吲哚[3,2-b]咔唑 (FICZ)、犬尿喹啉酸等。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK105886532SQ201610286018
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年5月3日
【發(fā)明人】趙斌, 尹雪嬌, 李帥章, 謝群慧
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心