復(fù)制型重組人55型腺病毒載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種復(fù)制型重組人55型腺病毒載體及其 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺病毒是一類無包膜的雙鏈DNA病毒，其基因組約35_40kb，已知人腺病毒共7個 亞群（A-G)，60多個血清型，其中3、4、7、14型感染可導(dǎo)致急性呼吸道疾病甚至致死性肺炎。 近年來，出現(xiàn)了由人11型與14型腺病毒重組產(chǎn)生的55型腺病毒（以下簡稱Ad55)，因人群 普遍缺乏針對這種病毒的免疫力，很容易引起呼吸道傳染病疫情，尤其是入伍新兵、寄宿制 學(xué)校、托幼機構(gòu)等在封閉環(huán)境中生活的群體。目前，尚無針對腺病毒感染的特效治療藥物， 亦無可在普通人群中使用的腺病毒疫苗。因此，構(gòu)建基于Ad55病毒的復(fù)制型報告病毒，對 于研發(fā)抗人55型腺病毒的疫苗、藥物及中和抗體至關(guān)重要。
[0003]同時，由于Ad55尚未大規(guī)模流行，人群中針對Ad55的中和抗體陽性率較低。因 此，基于Ad55的基因載體可潛在的攜帶抗原基因或治療性基因在普通人群中使用。腺病毒 載體具有一系列優(yōu)勢，包括：1.安全性，腺病毒遺傳背景相對清楚，基因組不整合至宿主染 色體因而不會導(dǎo)致插入突變，刪除其E1或E3基因可進一步降低腺病毒的致病力；2.有效 性，腺病毒可高效感染分裂期及靜息期細胞，攜帶的外源基因可長期高水平表達，具備較大 的容納外源基因的能力；3.生產(chǎn)工藝成熟，腺病毒可在宿主細胞中復(fù)制增長到很高的滴度 因而容易大規(guī)模生產(chǎn)，理化性狀穩(wěn)定因而可方便地運輸、儲存等。因此，腺病毒載體已廣泛 用作基因表達載體、重組疫苗載體和基因治療載體等，全球范圍內(nèi)已有數(shù)百項臨床試驗以 腺病毒作為基因載體，居各類載體之首（24.8%)。我國具自主知識產(chǎn)權(quán)的基因治療藥物今 又生（重組人P53腺病毒注射液），即使用復(fù)制缺陷型的人5型腺病毒載體。
[0004]然而，多數(shù)人體內(nèi)由于既往腺病毒感染而產(chǎn)生一定水平的抗腺病毒免疫反應(yīng)，包 括抗腺病毒中和抗體和殺傷性T細胞（CTL)。研究表明非洲和南美等發(fā)展中國家和地區(qū)的 人群中Ad2、Ad5中和抗體陽性率很高，甚至超過90%。我們的研究也表明廣東地區(qū)人群中 Ad5中和抗體陽性率高達75%。這些中和抗體會抑制腺病毒載體產(chǎn)品進入機體細胞，使其 難以行使免疫或治療功能。此外，針對腺病毒載體的CTL反應(yīng)亦可殺死靶細胞而抑制治療 性基因的持續(xù)表達。
[0005]為克服預(yù)存抗腺病毒免疫反應(yīng)，研究者已開發(fā)一系列技術(shù)：
[0006] 1)采用免疫抑制劑如環(huán)孢霉素、環(huán)磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反應(yīng)。但是 免疫抑制劑不具有特異性，往往帶來顯著的毒副作用，尤其是在免疫缺陷的人群。
[0007]2)修飾或改造腺病毒載體表面蛋白，繞開預(yù)存中和抗體。腺病毒表面蛋白經(jīng)修飾 或改造之后，掩蓋其中和表位，從而可有效的進入靶細胞發(fā)揮生物學(xué)功能。但是，包裹的腺 病毒粒子在細胞內(nèi)釋放效率被削弱，而改造表面蛋白的腺病毒載體使用一次即可產(chǎn)生新的 抗載體免疫反應(yīng)，不能重復(fù)使用。
[0008] 3)以腺病毒體外感染PBMC然后自體回輸?shù)腁VIP技術(shù)。PBMC分離并清洗之后，可 經(jīng)離心感染技術(shù)高效感染腺病毒載體。該技術(shù)可有效應(yīng)用于經(jīng)血液途徑免疫或輸送治療性 基因，但其應(yīng)用范圍有限。
[0009] 4)采用在人群中流行率較低的稀有血清型腺病毒作為載體。人群中針對稀有血清 型腺病毒的預(yù)存免疫反應(yīng)往往較低，因而這些載體在臨床中具有極大的應(yīng)用潛力。
[0010] 因此，基于人55型的腺病毒載體，一方面可為抗腺病毒疫苗、藥物或中和抗體研 究提供技術(shù)平臺，另一方面也可作為腫瘤、遺傳性疾病的基因治療載體及抗其他傳染性疾 病如HIV、流感等的疫苗載體。
[0011] 此外，腺病毒基因組長達35-40Kb，較少出現(xiàn)單酶切位點，在目標區(qū)域敲除特定基 因或整合外源序列有一定操作難度。目前常用的技術(shù)是在目標區(qū)域找到合適酶切位點（往 往并非單一酶切位點）并進行部分酶切，使部分基因組在該位點斷裂，與含重組臂并帶有 目的序列的質(zhì)粒同源重組。該技術(shù)的缺陷在于，部分酶切往往導(dǎo)致多數(shù)基因組質(zhì)粒未被有 效切開，重組克隆難以通過抗性篩選高效獲得。因此，本發(fā)明開發(fā)了一種基于基因組部分 酶切以及雙抗性篩選的重組技術(shù)，使得在目標區(qū)域整合入特定外源序列的操作更加簡便易 行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種復(fù)制型人Ad55重組腺病毒載體及其制備方法。
[0013] 實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0014] 一種復(fù)制型重組人55型腺病毒載體的制備方法，包括以下步驟：
[0015] (1)以人55型腺病毒基因組為模板，分別擴增人55型腺病毒基因組兩端反向重復(fù) 序列（ITR)作為同源重組臂L和R，并連接至氨芐抗性載體，線性化后與人55型腺病毒基因 組在大腸桿菌中同源重組，得到環(huán)化的基因組質(zhì)粒A(即pAd55);
[0016] (2)以Ad55基因組為模板，擴增人55型腺病毒E3區(qū)兩端序列并反向連接至卡那 抗性載體，線性化后與線性化的步驟（1)所述基因組質(zhì)粒A重組，再經(jīng)氨芐/卡那雙抗篩 選，得到去除E3基因的基因組質(zhì)粒B(即pAd55AE3-Kana);
[0017] (3)構(gòu)建敲除Kana基因的穿梭質(zhì)粒，與線性化的步驟⑵所述基因組質(zhì)粒B同源 重組，得到去除Kana基因的pAd55ΛE3質(zhì)粒，并整合入唯一酶切位點，線性化后轉(zhuǎn)染哺乳動 物細胞，密度梯度離心得到純化的復(fù)制型重組人55型腺病毒載體。
[0018] 或者，一種復(fù)制型重組人55型腺病毒載體的制備方法，包括以下步驟：
[0019] (1)以人55型腺病毒基因組為模板，分別擴增人55型腺病毒基因組兩端ITR區(qū)序 列作為同源重組臂L和R，并連接至氨芐抗性載體，線性化后與人55型腺病毒基因組在大腸 桿菌中同源重組，得到環(huán)化的基因組質(zhì)粒Α(即pAd55);
[0020] (2)以Ad55基因組為模板，擴增人55型腺病毒E3區(qū)兩端序列并反向連接至卡那 抗性載體，線性化后與如步驟（1)所述環(huán)化的基因組質(zhì)粒A重組，再經(jīng)氨芐/卡那雙抗篩 選，得到去除E3基因的基因組質(zhì)粒B(即pAd55AE3-Kana);
[0021] (3)構(gòu)建敲除Kana基因的穿梭質(zhì)粒，與線性化的基因組質(zhì)粒B同源重組，得到去除 Kana基因的pAd55ΔE3質(zhì)粒；
[0022] (4)將Ad55基因的E3區(qū)兩端序列連接至卡那抗性載體，并將外源序列插入至E3 區(qū)兩端序列之間，構(gòu)建攜帶外源基因表達框的穿梭質(zhì)粒，再與線性化后的基因組質(zhì)粒C同 源重組，在原E3區(qū)整合唯一酶切位點，得到E3區(qū)缺失并整合外源序列的基因組質(zhì)粒，線性 化后再轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，離心得到純化的復(fù)制型重組人55型腺病毒載體。
[0023] 在其中一個實施例中，所述步驟（1)為：
[0024] 以Ad55基因組為模板，PCR得到Ad55基因組兩端ITR區(qū)序列的重組臂L-arm及 R-arm；
[0025]L-arm連接至pUC載體得到pUC-L;R_arm以EcoRI+Xbal雙酶切后連接至 EcoRI+Xbal雙酶切的pUC-L得到環(huán)化穿梭質(zhì)粒pUC_(L+R);
[0026]pUC-(L+R)以BamHI+EcoRI線性化后，與Ad55基因組共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，得到 pAd55質(zhì)粒。
[0027] 在其中一個實施例中，所述步驟（2)為：
[0028] 以Ad55基因組為模板，進行PCR擴增，得到E3區(qū)上下游同源重組臂L_delE3及 R-delE3；
[0029]L_delE3以Spel+EcoRI酶切后連接至同樣酶切的pVax載體得到pVax-L_delE3; R-delE3以EcoRI+Xbal雙酶切后連接至同樣酶切的pVax-L-delE3得到敲除E3基因的穿梭 質(zhì)粒pVax_delE3(L+R);
[0030]pVax_delE3(L+R)以EcoRI線性化，pAd55以EcoRI經(jīng)部分酶切線性化，共轉(zhuǎn)化感 受態(tài)細胞，涂至氨芐、卡那雙抗性平板，提取陽性克隆繼續(xù)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，得到去除E3基 因并在E3區(qū)引入唯一酶切位點Swal的基因組質(zhì)粒pAd55AE3-Kana。
[0031] 在其中一個實施例中，所述步驟（3)為：
[0032] 以Ad55基因組為模板，進行PCR擴增，得到E3區(qū)上下游同源重組臂L-delK及 R-delK；
[0033]L-delK以Spel+EcoRI雙酶切后連接至Spel+EcoRI酶切的pVax載體得到 pVax-L-delK;R-delK以EcoRV+Xbal雙酶切后連接至EcoRV+Xbal雙酶切的pVax-L-delK 得到敲除Kana基因的穿梭質(zhì)粒pVax_delK(L+R) ;pVax_delK(L+R)質(zhì)粒以Spel+Xbal酶 切，回收delK(L+R)片段；pAd55AE3-Kana以Swal線性化；delK(L+R)片段和線性化的 pAd55ΛE3-Kana共轉(zhuǎn)染感受態(tài)細胞，同源重組得到去除Kana基因的pAd55ΛE3質(zhì)粒。
[0034] 在其中一個實施例中，所述步驟（4)為：
[0035] 以pVAX質(zhì)粒為模板，PCR得到VAX骨架；
[0036] 以Ad55基因組為模板，PCR得到E3區(qū)上下游同源重組臂SE3L及SE3R;
[0037]Vax骨架以Spel切，SE3L以Xbal切后加磷酸化，連接得到p-SE3L;pSE3L以 Spel+EcoRV切，SE3R以Spel切，連接得到pSE3LR;
[0038] 將外源基因表達框連接得到pSE3LR，得到攜帶外源基因表達框的目標穿梭質(zhì)粒；
[0039] 攜帶外源基因表達框的目標穿梭質(zhì)粒以BstZ17I+SgrAI切，乙醇沉淀回收； pAd55AE3以Swal線性化后乙醇沉淀回收；共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，同源重組得到攜帶外源基 因表達框的pAd55ΛE3-外