表達(dá)鴨坦布蘇病毒e蛋白的重組鴨瘟病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表達(dá)鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨瘟病 毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 2010年4月以來，我國(guó)鴨主產(chǎn)區(qū)的蛋鴨和種鴨爆發(fā)一種新的傳染病，該病以傳 播迅速、產(chǎn)蛋量驟降為主要臨床特征、以出血性卵巢炎為主要病變特征。通過病原分離鑒 定和全序列測(cè)定，明確該病原屬于黃病毒科（Flaviviridae)、黃病毒屬（Flavivirus)、蚊 媒病毒類（Mosquito-borne)、Ntaya病毒群，與該群Tembusu病毒（TMUV)具有最近的 遺傳進(jìn)化關(guān)系，可以認(rèn)為是TMUV的一個(gè)新成員，暫定名為鴨坦布蘇病毒（DuckTembusu virus,DTMUV)(SuJ,LiS,HuX,etal.Duckegg-dropsyndromecausedbyBYDvirus,a newTembusu-relatedflavivirus[J].PLoS0ne,2011,6(3):el8106)。該病可危害不 同品種的種鴨和蛋鴨，發(fā)病率高低不一，群內(nèi)發(fā)病率高達(dá)100%，死淘率5%~15%，繼發(fā) 感染時(shí)死淘率可達(dá)30% (曹貞貞，張存，黃瑜，等.鴨出血性卵巢炎的初步研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010,46(12) :3_6.)(CaoZ,ZhangC,LiuY，etal.Tembusuvirusin ducks，china[J].EmergingInfectiousDiseases, 2011，17 (10): 1873-1875.)。臨床上主 要表現(xiàn)為發(fā)病后2~5d內(nèi)，鴨群的產(chǎn)蛋量驟然下降，從產(chǎn)蛋高峰迅速下降至30%~10%， 嚴(yán)重的甚至停產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，該病毒主要危害除番鴨外的所有品種產(chǎn)蛋鴨、肉種鴨及野鴨 等，最近也有產(chǎn)蛋雞（陳仕龍，陳少鶯，王劭，等.一種引起蛋雞產(chǎn)蛋下降的新型黃病毒 的分離與初步鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，26(2): 170-174.)、鵝自然感染發(fā)病的報(bào)道 (趙冬敏，黃欣梅，劉宇卓，等.新型黃病毒在種鵝中垂直傳播的研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué) 報(bào)，2012, 43 (1) :99-102.)。該病的流行給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，而目前尚沒有有效的 疫苗及藥物控制該病的發(fā)生。
[0003] 隨著病原學(xué)研究的深入和病毒基因組的破譯，發(fā)現(xiàn)該病毒對(duì)雞紅細(xì)胞無血凝活 性，病毒直徑約45nm，有囊膜。病毒基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，由10990個(gè)核苷酸 組成，具有典型的黃病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。病毒基因組編碼一個(gè)大多聚蛋白，由3426個(gè)氨 基酸構(gòu)成，該多聚蛋白前體經(jīng)過病毒自身和宿主細(xì)胞的蛋白酶，被切割成至少十種成熟的 蛋白，其中包括3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（核衣殼蛋白C、膜蛋白prM、囊膜蛋白E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋 白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b與 NS5)(YunT，YeW，NiZ，etal.Identification andmolecularcharacterizationofanovelflavivirusisolatedfromPekin ducklingsinChina[J].VeterinaryMicrobiology，2012, 157(3-4) :311_319.)。E蛋白 全長(zhǎng)501個(gè)氨基酸，位于成熟病毒顆粒表面，構(gòu)成病毒顆粒的突起。E蛋白是黃病毒的主要 結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染靶細(xì)胞的受體結(jié)合、膜融合和侵入過程中起著關(guān)鍵作用；同時(shí)，E蛋 白具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性，是宿主抗感染免疫的主要保護(hù)性抗原，也是檢測(cè)該病 毒特異性抗體的理想革E抗原（GublerDJ，KunoG,MarkoffL.Flaviviruses.InFields Virology.KnipeDM,andHowleyPM(eds).Philadelphia:LippincottWilliamsand Wilkins,2007:1153-1252.)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種表達(dá)鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨瘟病毒，具有制備雙聯(lián)疫苗 的潛質(zhì)。
[0005] -種重組鴨瘟病毒，所述重組鴨瘟病毒的基因組中插入有鴨坦布蘇病毒E蛋白基 因，所述鴨坦布蘇病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDN0.9所示。
[0006] 優(yōu)選的，所述基因組插入有Pcmv-E-BGH-pA表達(dá)框；其中E表示鴨坦布蘇病毒E蛋 白基因，Pcmv表示啟動(dòng)子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；所述基因組中g(shù)fp 基因的CMV啟動(dòng)子替換為EF1啟動(dòng)子。
[0007] 優(yōu)選的，所述鴨坦布蘇病毒E蛋白基因插入在所述基因組的US7基因和US8基因 之間。
[0008] 優(yōu)選的，所述的以鴨瘟病毒的疫苗株作為活載體。鴨瘟病毒作為病毒活載體具有 疫苗生產(chǎn)、儲(chǔ)存和免疫技術(shù)成熟，且安全性良好的優(yōu)勢(shì)。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種重組鴨瘟病毒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0010] (1)將pDEV-vac中g(shù)fp基因的CMV啟動(dòng)子替換成EF1啟動(dòng)子，獲得pDEV-EFl;
[0011] (2)將Pcmv-E-BGH-pA表達(dá)框插入pDEV-EFl，獲得pDEV-E;
[0012] (3)將pDEV-E轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞，拯救獲得所述重組鴨瘟病毒；
[0013] 其中pDEV-vac為攜帶鴨瘟病毒疫苗株全基因組的感染性細(xì)菌人工染色體，E表示 鴨坦布蘇病毒E蛋白基因，Pcmv表示啟動(dòng)子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾； 一般情況下P起始表示質(zhì)粒，r起始表示病毒；
[0014] 所述鴨坦布蘇病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDN0.9所示。
[0015] 所述CMV啟動(dòng)子替換成EF1啟動(dòng)子的方法為：
[0016] (1)以pEP-EFl-in為模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2的引 物，擴(kuò)增獲得目標(biāo)片段；
[0017] (2)將所述目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入pDEV-vac/GS1783感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行同源重組，篩選獲得 pDEV-kanEFl；
[0018] (3)敲除pDEV-kanEFl中的kan抗性基因，獲得pDEV-EFl;
[0019] 所述的pEP-EFl-in質(zhì)粒圖譜如圖6所示；
[0020] 所述的pDEV-vac/GS1783 為攜帶pDEV-vac的大腸桿菌GS1783。
[0021] 所述Pcmv-E-BGH-pA表達(dá)框插入pDEV-EFl的方法為：
[0022] (1)人工合成所述鴨坦布蘇病毒E蛋白基因，插入pEP-BGH-end，獲得pEP-BGH-E;
[0023] (2)以pEP-BGH-E為模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4的引 物，擴(kuò)增獲得目標(biāo)片段；
[0024] (3)將所述目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入pDEV-EFl/GS1783感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行同源重組，篩選獲得 pDEV-kanE；
[0025] (4)敲除pDEV-kanE中的kan抗性基因，獲得pDEV-E;
[0026]所述的pEP-BGH-end質(zhì)粒圖譜如圖7所示。
[0027] 本發(fā)明在鴨瘟病毒疫苗株的基礎(chǔ)上，結(jié)合RedE/T重組技術(shù)將pDEV-vac上gfp基 因的CMV啟動(dòng)子替換為EF1啟動(dòng)子，以便于E基因準(zhǔn)確插入到pDEV-EFl的預(yù)期位置，同時(shí) 有利于啟動(dòng)E基因的表達(dá)。該技術(shù)不需要特定的限制性酶切位點(diǎn)，只需較短的同源序列，即 可在生物體內(nèi)完成重組過程，省去了體外DNA酶切、連接等步驟。
[0028] 本發(fā)明又提供了所述的重組鴨瘟病毒在制備動(dòng)物疫苗中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明得到的重組鴨瘟病毒與親本毒株相比，其病毒蝕斑大小不具有顯著差異， 說明鴨坦布蘇病毒E蛋白基因的插入不影響鴨瘟病毒在雞胚成纖維細(xì)胞上的擴(kuò)散。
[0030] 本發(fā)明得到的重組鴨瘟病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞后成功表達(dá)E蛋白，為鴨瘟病 毒-鴨坦布蘇病毒二聯(lián)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0031] 圖1為重組克隆pDEV-EFl的XbaI酶切鑒定圖，其中1 :pDEV-EFl;2: pDEV-kanEFl;3 :pDEV_vac〇
[0032] 圖2為重組克隆pDEV-E的BamHI和XbaI酶切鑒定圖，其中a為以參考序 列GenBank(EU082088. 2)進(jìn)行預(yù)測(cè)的結(jié)果，b為電泳圖譜；1 :pDEV-vac;2 :pDEV-EFl;3: pDEV-E。
[0033] 圖3為熒光顯微鏡下（100X)重組病毒出現(xiàn)的熒光噬斑圖，其中a:rDEV-BAC;b: rDEV-EFl;c:rDEV-E。
[0034] 圖4為rDEV-BAC、rDEV-EFl和rDEV-E在CEFs上的蝕斑面積測(cè)定及比較圖。
[0035] 圖5為Westernblotting方法檢測(cè)rDEV-E病毒感染細(xì)胞中E蛋白的表達(dá)圖，其 中 1 :rDEV-EFl;2 :rDEV-E。
[0036] 圖6為pEP-EFl-in載體質(zhì)粒圖譜。
[0037] 圖7為pEP-BGH-end載體質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下列實(shí)施中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué) 實(shí)驗(yàn)指南》（F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.賽德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍譯，北京：科學(xué) 出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。
[0039]1、序列優(yōu)化、引物設(shè)計(jì)及合成
[0040] 鴨坦布蘇病毒E基因序列參考GenBank(JF270480. 1)，由GenScript公司以雞為宿 主進(jìn)行優(yōu)化合成；引物分別參考序列GenBank(EU082088. 2)、鴨坦布蘇病毒E基因優(yōu)化序列 設(shè)計(jì)，由上海生工合成；
[0041] 引物EF1-印1和EF1-印2用于以EF1啟動(dòng)子替換pDEV-vac中g(shù)fp基因的啟動(dòng)子 Pcmv，構(gòu)建pDEV-EF1。下劃線部分與pEP-EF1 -in質(zhì)粒序列同源，斜體序列分別和pDEV-vac 序列中g(shù)fp基因的啟動(dòng)子Pcmv上、下游序列同源；
[0042]引物 pDEVvac-in-s和 pDEVvac-in-as用于將表達(dá)框 Pcmv-E-BGH-pA插入到 DEV 基因組的US7基因和US8基因之間。下劃線部分與pEP-BGH-E同源，粗體部分分別與位于 US7和US8基因間插入位點(diǎn)上、下游的序列同源；
[0043]引物EF1-JD-F和EF1-JD-R用于EF1啟動(dòng)子替換是否成功的鑒定；
[0044] 引物Rec-JD-F和Rec-JD-R用于外源基因插入BAC基因組中的驗(yàn)證。
[0045]表1
[0046]
[0047] 2、pDEV-vac的CMV啟動(dòng)子替換成EF1啟動(dòng)子
[0048] 本發(fā)明所用的攜帶有鴨瘟病毒疫苗株全基因組感染性細(xì)菌人工染色體（BAC) 克隆的pDEV-vac/GS1783菌株是由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所構(gòu)建并保存（Chen L,YuB,HuaJ,etal.Constructionofafull-lengthinfectiousbacterial artificialchromosomecloneofduckenteriti