專利名稱：A型和b型流感病毒復制抑制肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及流感病毒復制抑制肽，該肽抑制流感A型和B型病毒復制；抑制流感病毒復制的流感病毒復制抑制劑；用于確定流感病毒聚合酶亞基相互作用抑制劑的方法以及包含流感病毒復制抑制肽的流感治療劑。
背景技術：
流感病毒是導致每年發(fā)作的流行病以及反復發(fā)作的流行傳染病的負鏈RNA病毒， 導致很多人患病和嚴重的經濟負擔。除了廣為人知的A型流行性流感病毒(例如1918年 “西班牙”流感或H5W)，A型和B型病毒均是造成很多人患病和巨額醫(yī)療費用的每年再發(fā)的流行病的主要原因。WHO推薦針對傳播的流感病毒株A(FluA)和B(FluB)每年進行疫苗接種。然而，目前的疫苗針對流感提供的保護并不完全。到目前為止，只有神經氨酸酶抑制劑奧司他韋(oseltamivir (達菲(Tamiflu)))和扎那米韋(zanamivir (依樂偉(Relenza))) 可用作抵抗全部兩種病毒類型的抗病毒治療。然而，在醫(yī)學界內存在不斷增加的擔憂，所述擔憂即關于耐這兩種藥物的流感病毒株正在快速不斷的出現。較老的金剛烷藥物對FluB 無效，耐奧司他韋的流感病毒的全球分布表明此類藥物的局限性。最近在美國的流行病學調查發(fā)現98. 5%的Hmi分離株被測試出耐奧司他韋。因此，急需可對抗所述兩種病毒類型的新的改進的和替代的抗病毒劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供新的、改進的和/或替代的抗流感病毒劑。本發(fā)明的另一目的是除去或減輕本領域已知的抗流感病毒劑的至少一個缺點。本發(fā)明的又一目的是提供新的改進的和替代的用于確定流感病毒聚合酶亞基相互作用抑制劑的方法。令人意外的是，已發(fā)現本發(fā)明的新病毒復制抑制肽能夠抑制A型和B型流感病毒的異源三聚體病毒RNA聚合酶復合體的PA和PBl亞基的蛋白-蛋白相互作用。所述病毒聚合酶亞基相互作用結構域被證明是所述新抗病毒劑的有效靶標，因為所述三個病毒聚合酶亞基PB1、PB2和PA的正確裝配是病毒RNA合成和傳染性所需的。目前還沒有整個三聚復合體的結構數據?；谂cPBl的N末端復合的截短的FluA PA的晶體結構，本發(fā)明人確認，PBl的關鍵PA相互作用結構域由氨基酸(aa 5_11)所形成的31(|螺旋構成。該結構域在A和B型流感病毒中均是高度保守并且是病毒類型特異的(圖la)。含有來自A型和B型病毒的氨基酸序列的本發(fā)明的新肽結合于A型和B型流感病毒的PA亞基。在所述新肽中，含有來自A型和B型病毒的氨基酸序列的嵌合肽，被鑒定為不僅可結合于兩種PA亞基，而且可降低A型和B型流感病毒的病毒聚合酶活性和在細胞培養(yǎng)中的病毒分布。本發(fā)明的一個方面提供一種分離的流感病毒復制抑制肽，其已被證明可有效地干擾異源三聚體病毒RNA聚合酶復合體的PA和PBl亞基的蛋白-蛋白相互作用結構域并從而導致對病毒復制的抑制。本發(fā)明的另一方面提供一種鑒定變體肽的基于ELISA的篩選方法，該變體肽來源于異源三聚體病毒RNA聚合酶復合體的PBl亞基的PA結合結構域，該結構域可結合于A型和B型流感病毒的PA亞基。本發(fā)明使得可容易地使用本發(fā)明的肽，以及新的基于ELISA的篩選測定法，所述測定法用于鑒定對A型和B型流感病毒有抗病毒活性的小分子先導化合物。由于這些小分子對所述兩種病毒類型均有效，因此它們代表了有吸引力的神經氨酸酶抑制劑的替代品， 并向獲得強烈需要的、接近通用的對抗流感病毒的藥物的目標邁出了一大步，并且代表這樣一種藥劑，即由于其靶標是蛋白-蛋白相互作用結構域，因此可能對耐藥病毒株的出現 (流感的耐藥病毒株的出現是廣為人知的)較不敏感。本發(fā)明的肽包含氨基酸序列，所述序列與野生型PBIh1A多肽MDVNPTLLFLK具有至少60 %、優(yōu)選至少70 %、更優(yōu)選至少80 %或90 %的同一性。一個或多個氨基酸殘基可被取代、缺失或添加，并且所述蛋白仍具有對A型和B型流感病毒的PA和PBl亞基的蛋白-蛋白相互作用的抑制活性。然而，已知的野生型PBlwiA被明確地放棄。本發(fā)明的肽是合成的或分離的流感病毒復制抑制肽，所述肽競爭性地抑制A型和 B型流感病毒的異源三聚體病毒RNA聚合酶復合體PA和PBl亞基的蛋白-蛋白相互作用。 這些肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含X5X6X7X8X9Xltl序列，其中)(5是？ ；)(6是1\￥、？、 W、H、C、I、L、V、A 或 M ;X7 是 L 或 F ;X8 是 L、I、F 或 M ;X9 是 F、Y、W、H、L、R 或 S ；并且 X10 是 L、I 或 Y。根據本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的肽的氨基酸序列與野生型PBlw5A多肽 MDVNPTLLFLKVPAQ具有至少66%、優(yōu)選至少73%、更優(yōu)選至少79%、86%或93%的同一性。 該野生型自身也被放棄。應注意在本申請中全部氨基酸優(yōu)選地由IUPAC單字母編碼標識。在使用三字母編碼時，它們也符合IUPAC。字母X用于標識某個位置處的通配符/變量或其他氨基酸。根據本發(fā)明的另一方面，流感病毒復制抑制劑包含與細胞穿膜肽(優(yōu)選HIV-Tat 的細胞穿膜結構域)融合的至少一種上述肽，作為活性成分，并抑制A型和B型流感病毒株的復制。根據其他實施方案，前述肽以與任何銜接肽——其確保被攝入至病毒可感染的細胞中——連接的方式提供，并且/或者作為包含肽和相容載體的蓋倫制劑提供。本發(fā)明的流感預防/治療劑包含前述肽的任何一種中的至少一種肽和/或前述抑制劑中的任何一種的至少一種流感病毒復制抑制劑，作為活性成分。此流感預防/治療劑對A型和B型流感病毒感染均有效。已將包含編碼上述肽的多核苷酸的表達載體引入細胞以使它們能夠分泌本發(fā)明的肽。已經開發(fā)了包含權利要求1-7中任一項的流感病毒復制抑制肽的流感治療劑。本發(fā)明的DNA或多核苷酸編碼前述肽的任一種，并由DNA、RNA、基因組DNA或PNA 構成。本發(fā)明的表達載體包括前述DNA。此外，本發(fā)明的細胞被弓I入前述表達載體并分泌前述肽中的任一種。前述肽可包含在脂質體中。根據一個優(yōu)選實施方案，所述脂質體中的肽被烷基化。
除了上述這些醫(yī)療用途之外，本發(fā)明的流感病毒復制抑制肽還可用作鑒定抗病毒藥物的工具。新肽如PBIh5At6y的鑒定及其抑制FluA和FluB生長的能力證明所述聚合酶亞基PA和PBl的相互作用可作為開發(fā)抗病毒藥物的新靶標，所述藥物包含特異性阻斷PA-PBl 相互作用并抑制多種FluA和FluB株生長的小分子或其他化合物，用作廣譜抗流感藥物。此外，本發(fā)明還提供基于酶聯免疫吸附測定(ELISA)的篩選測定法，來鑒定對A型和B型流感病毒有抗病毒活性的小分子前導化合物。由于它們對所述兩種病毒類型均有效，因此這些化合物代表有吸引力的神經氨酸酶抑制劑的替代品。因此，本發(fā)明代表了向獲得強烈需要的、接近通用的對抗流感病毒的藥物的目標邁出了一大步，并且代表這樣一種藥劑，即由于其靶標是蛋白-蛋白相互作用區(qū)，因此可能對耐藥病毒株的出現(流感病毒株的耐藥病毒株的出現是廣為人知的)較不敏感。還提供熒光偏振(FP)測定法。建立所述ELISA以更好地分析PBl與PA的結合性質。如圖Ib所示，其證實了 FluA PA和FluB PA分別與PBV25A和PBlh25B的類型特異性結合。為了進一步表征各單個aa的作用，使用PBp25A衍生肽進行了競爭性ELISA實驗(表2)。缺少構成所述31(Γ螺旋的aa 的肽不能競爭結合，這與所述PA/PB1結合位點的結構吻合。此外，在31(Γ螺旋結構域內含有單個Ala或Asp取代(除了 Τ6Α以外)的肽喪失了其結合FluAPA的能力(表3)。這可能是由于變構效應或是由于氫鍵接觸的喪失。已發(fā)現PBl的關鍵PA相互作用結構域由31(|-螺旋構成，所述31(Γ螺旋由氨基酸 (aa))(5到)Cn構成。該區(qū)在A型和B型流感病毒中均是高度保守并且類型特異的(圖la)。此外，FluB PBl能夠結合于FluA PA，此時這25個aa與FluA PBl序列互換(圖 2)。確定了 FluA衍生肽和FluB衍生肽(15-mer)進行PA-PBl^5A相互作用，以及形成一系列FluA/FluB嵌合體的IC50值(表1)。野生型PBl1^15A有效地抑制FluA PA而非FluB PA結合于所述同族肽，而PBlw5B阻斷FluB PA而非FluA PA結合。某些嵌合肽喪失了其結合FluA PA的能力(表1)。令人意外的是，肽PBIh5At6y^f不僅競爭結合FluA PA，而且競爭結合FluB PA，雖然親和力小于PBU。僅在第6位——其在FluB中是高度保守的—— 上引入Tyr (PBIh5At6y),導致FluA PA的結合與所述雙突變體相比下降，然而結合仍優(yōu)于野生型肽；而對于PBIw5At6y來說，其與FluB PA的結合與PBV15At6U7f相比提高。所述L7F取代導致抑制活性的基本喪失(表1)，表明PBIh5At6y, L7F的有利結合性質可歸因于T6Y。結構分析表明FluB衍生肽在第6位上的Tyr嵌合進FluA PA的未經利用的疏水口袋中，增強了 PBIh5At6y與FluA PA之間的結合(圖Ic)。盡管對于FluA來說， 此疏水相互作用通過在第6位上引入Phe和Trp而增大，但是與FluB PA的結合下降，表明 FluB PA與PBl之間的相互作用的模式有稍許不同。疏水相互作用的增加以及水置換的熵效應可解釋PBIt6y與PA的結合的增強。在更大的肽PBL25At6y中保留了有利的雙結合性質，該肽還結合于數個FluA和 FluB病毒株的PA亞基(圖Ib和圖3)，證明了對多種流感病毒亞型的親和性。聚合酶重構測定法揭示，這些雙結合性質會轉變?yōu)椴灰蕾囉诓《绢愋偷膶酆厦富钚缘囊种啤ＥcGFP 融合的PBI^5At6y干擾FluA和FluB的病毒聚合酶活性，而PBIh5A-GFP和PBIh5B-GFP只抑制其同族亞型的活性(圖Id)。通過含有這些序列的蛋白的共免疫沉淀實驗觀察到一致的發(fā)現(圖4)。
為了提高所述治療活性分子——即本發(fā)明的合成或分離的流感病毒復制抑制肽——的遞送，使用了細胞穿膜肽。所述細胞穿膜肽是例如來自慢病毒的蛋白轉導結構域(PTD)或反式激活因子蛋白，也稱為Tat蛋白。已經顯示，與HIV-Tat的穿膜區(qū)融合的 PBUt6y (PBlmA^Y-Tat，表4)抑制FluA和FluB的生長但不抑制不相關病毒的生長(圖 Ie)。正如根據本發(fā)明人的生化表征可預測的，與野生型PBV25-A-Tat相比，PBlimA^-Tat 導致對A/WSN/33 (HlNl)和高病原性H5W病毒株A/Thai land/1 (Kan-I)/2004的生長抑制增加兩倍。本發(fā)明的流感預防/治療劑對流感A型和B型病毒廣泛有效。有利的是，本發(fā)明的制劑可在非常短的時間內根據需要采用合成方法制備。對于由局部或區(qū)域爆發(fā)(例如亞洲國家的禽流感或者最近墨西哥的豬流感)導致的致命流行病，明顯需要具有廣泛作用的病毒預防/治療劑。本領域普通技術人員在閱讀以下對本發(fā)明具體實施方案連同附圖的描述后會明了本發(fā)明的其他方面和特征。本領域技術人員會根據本文給出的描述中明了本發(fā)明的目的、特征和優(yōu)點以及其構思。應理解采用下文描述的本發(fā)明的實施方案和具體實施例作為本發(fā)明的優(yōu)選實施例。 這些描述僅是為了說明和示例，而不意圖將本發(fā)明限定于這些實施方案或實施例。本領域技術人員還會明了可基于本文給出的描述在本文公開的本發(fā)明目的和范圍內進行各種變化和改變。


圖1示出了 PBI1J5At6y的結合和抑制活性。圖Ia在上圖中示出了對FluA PBl和FluB PBl的N-末端25個aa的共有序列的比對。中圖和下圖示出了對所有可以獲得的來源于PBl全長序列的FluA和FluB序列N-末端25個aa的比對。圖Ib示出了來自細胞提取物的帶有HA標簽的PA亞基與固定化肽的結合，所述肽對應FluA PBl和FluB PBl的不同結構域。上圖所用的含PA的細胞提取物的蛋白質印跡。圖Ic 示出了結合于 FluA PA 的 FluA PBlw5 和 FluA PBIw5t6y 的結構。圖Id示出了在FluA和FluB聚合酶重構測定法中PBlh25衍生的GFP融合蛋白的聚合酶抑制活性。圖 Ie 示出了使用 PBlH5A-Tat,PBlusA^Y-I^at、PX-Tat (對照肽)對 FluA、FluB 和 VSV(水泡性口炎病毒)進行的空斑減少測定。圖2示出了 PA與PBl的病毒類型特異性相互作用。圖加示出了在圖2b的測試中使用的PBl嵌合體。圖2b示出了以表達質粒轉染的結果，所述質粒編碼所示的FluA的PBl蛋白和 C-末端帶有六組氨酸標簽的PA (FluA PAHis)。圖3示出了 FluA/B肽嵌合體PBI^5At6y與PBl^5A和PBl^5B相比的雙結合性質。圖如示出了在圖4b的測試中使用的GFP-PBl融合蛋白。圖4b示出了免疫印跡，所述免疫印跡基于FluA和FluB的PBV25-衍生GFP融合蛋白和帶有HA標簽的PA的形成。
具體實施例方式現在借助上述附圖和附表——只是為了舉例——對本發(fā)明的實施方案進行描述。材料和方法病毒株對于感染實驗，使用根據(ihanemet al. (2007)的 A/WSN/33 (HlNl)、根據 Chockephaibulkit et al. (2005)的A/Thailand/1 (Kan-I)/2004、根據Norton(1987)的B/ Yamagat/73 以及如 khwemmle (1995)所述的 VSV Qndiana 血清型)。質粒構建Ghanem(2007)、Mayer (2007)和 Pleschka (1996)描述了質粒 pCA-Flag-GFP 和 PCA-PBii^25A-GFP, pCA-PBI-HA、FluA微復制子質粒和FluB微復制子的表達質粒。根據 Pleschka(1996)，通過將側翼連接有B/Yamagata/73的第8段的非編碼區(qū)的螢火蟲螢光素酶ORF(反向)克隆到經Sapl消化的質粒pPolI-SapI-Rib中，從而獲得FluB微型基因組表達質粒 pPolI-lucRT_B。對于 PCA-PBv25B-GFP 的構建，將含有 PBl (B/Yamagata/73) 的前25個密碼子的接頭克隆到pCA-Flag-GFP質粒的EcoRI/NotI位點，用PBln5B替代 Flag編碼序列。用PCA-PBlh25A-GFP進行定點誘變以形成質粒pCA-PBlmA^Y-GFP。用在起始密碼子上游含有NotI位點(FluA病毒株)或EcoRI位點(FluB病毒株)的正義引物和在缺失的終止密碼子后具有Xmal位點、HA標簽的編碼序列和BioI位點的反義引物，對 PBl (B/Yamagata/73)和 PA(A/SC35M, A/Thailand/1 (ΚΑΝ-Ι)/04、A/Vietnam/1203/04、B/ Yamagata/73、B/Lee/40)的 ORF 進行 PCR 擴增。將 PCR 產物克隆到用 EcoRI/XhoI 或 NotI/ Xhol 消化的經修飾的 pCAGGs 載體(Schneider，2003)中，得到 pCA-PBl-HA 或 pCA-PA-HA 質粒，編碼C末端帶有標簽的聚合酶亞基。為獲得pCA-PAA/se35M-His質粒，用XmaIAhol消化pCA-PA/se35M-HA并用6xHis-接頭取代HA編碼序列。通過使用SC35M和B/Yamagata/73 的pCAPBl-HA質粒的裝配PCR并通過將得到的PCR產物克隆到用EcoRI/EcoRV消化的 pCA-PBlB/Yamagata/73-HA 中得到 A/B-嵌合表達質粒。流感病毒聚合酶活性的重建用質?；旌衔锊⒂镁幋a所示GFP融合蛋白的表達質粒瞬時轉染HEK293T細胞，所述質粒混合物含有FluA-或FluB-衍生的PB1-、PB2-、PA-和NP-表達質粒、聚合酶I (Pol I)-驅動的轉錄A型或B型流感病毒樣RNA (該RNA編碼報告蛋白螢火蟲螢光素酶以監(jiān)測病毒聚合酶活性)的質粒。使兩種微型基因組RNA的側翼分別連接于FluA和FluB的第8段的非編碼區(qū)序列。所述轉染混合物還含有組成型表達海腎螢光素酶(Renilla luciferase) 的質粒，其用于標準化轉染效率的偏差。在轉染后M小時測定報告蛋白活性并使用 Dual-Glu Lufierase Assay System(Promega)進行標準化。將針對含有 Flag-GFP 的轉染反應觀察到的活性設為100%。肽合成所述肽的固相合成是在Pioneer自動肽合成儀(Applied Biosystems, Foster City, USA)上進行，所述合成采用Fmoc化學法與TBTU/二異丙基乙胺活化。側鏈保護如下 Asp，Glu，Ser，Thr和Tyr:t-Bu ；Asn，Gln和His:Trt ；Arg:Pbf ；Lys和Trp:Boc。偶聯時間為 1小時。如果根據程序 P印tide Companion (CoshiSoft/PeptiSearch, Tucson, USA)預期到偶聯困難，那么就進行雙偶聯。所有肽均通過在Rapp S RAM樹脂(Rapp Polymere, Tubingen, Germany)上進行合成以羧基胺形式產生。用 Fmoc-Lys (Biotin)-OH(NovaBiochem/Merck， Nottingham, UK)在所示肽的C-末端納入生物素并進行18小時的TBTU/ 二異丙基乙胺活化，然后進行1小時的Fmoc-β -Ala-OH偶聯。將肽從所述樹脂上切下并通過用含有3%三異丁基硅烷和2%水的TFA(10ml/g樹脂)處理3小時去保護。在用叔丁基甲基醚沉淀后， 通過使用含有0. TFA的水/乙腈梯度的制備型HPLC(RP-IS)純化所得到的粗肽，并用分析型 HPLC 和 MALDI-MS 表征。某些肽通過 ρ印tides&el印hants (Nuthetal，Germany)合成并隨后如上所述進行純化和鑒定。免疫沉淀實驗使用 Metafectene (Biontex, Martinsried, Germany)在 6 孑L板中以所示質粒轉染HEK293T細胞。在轉染后M小時將細胞用裂解緩沖液OOmM Tris pH7. 5、100mM NaCl、 0. 5mM EDTA、0. 5%NP-40、1%蛋白酶抑制劑Mix G(Serva,Heidelberg,Germany), ImM DTT) 在冰上孵育15分鐘。在4°C下以13000rpm離心后，將上清液用偶聯于瓊脂糖珠(Sigma) 的抗HA-特異性抗體于4°C孵育1小時。在用Iml洗滌緩沖液(不含蛋白抑制劑混合物的裂解緩沖液)洗滌三次后，在變性條件下洗脫結合的物質并在SDSPAGE凝膠上分離并轉至 PVDF 膜。用特異性抗 HA-(Covance，Berkeley，California)或 His-^jiagen)或 GFP-標簽 (Santa Cruz Biotechnology)的抗體檢測病毒聚合酶亞基和GFP融合蛋白。空斑減少測定本實驗如&111^(11 ^2001)所述進行并進行了改進。于室溫下，用溶于含BSA的PBS 中的 100PFU 的 A/WSN/33、B/Yamagata/73、A/KAN-1 或 VSV/lndiana 感染匯合的 MDCK 細胞。 在除去接種物后，用含有Oxoidagar和所示濃度肽的培養(yǎng)基(含有20mM Hepes.0.01% DEAE Dextran、0. 001% NaHCO3的DMEM)覆蓋細胞。分別于37°C禾口 5% CO2下孵育24小時 (VSV)、48 小時(A/WSN/33,A/KAN-1)或于 33°C禾口 5% CO2 下孵育 72 小時(B/Yamagata/73) 后，將細胞用甲醛固定并用結晶紫染色。對菌斑進行計數并將水對照的平均菌斑數設為 100%。ELISA將微孔板(Pierce)在室溫下用飽和濃度的肽孵育，洗滌，隨后在室溫下用帶有 HA標簽的PA孵育。為獲得PA-HAJf 細胞接種于94mm培養(yǎng)皿中，用各質粒轉染并在轉染后M小時用裂解緩沖液處理，如Meyer et al. O007)中詳細描述。在洗滌微孔板后，將所述孔用HA特異的一抗(Covance)孵育，然后洗滌三次，再用過氧化物酶偶聯的二抗(Jackson lmmuno Research, Newmarket, UK)再孵育30分鐘。在最后一步洗滌后，加入 ABTS-底物(Sigma，即用溶液)并在405nm下測定光密度。如上所述進行競爭ELISA，但是先將競爭肽加入具有結合肽的板孔中，然后再加入含有帶有HA標簽的PA亞基的細胞提取物。熒光偏振(FP)測定法所述測試樣品包括已知的包含熒光標記的蛋白或蛋白亞基的結合對，其可通過熒光偏振根據本發(fā)明的優(yōu)選實施方案來分析。這里，本發(fā)明人使用A型流感病毒聚合酶亞基 PBl——表示為前25個N-末端氨基酸——與亞基PA的相互作用。然后使所述測試樣品接觸候選抑制劑化合物并測定熒光偏振。所述化合物導致離解、干擾或者阻止所述蛋白或蛋白亞基結合的能力是通過熒光偏振(FP)監(jiān)測的。FP量度使得可辨別結合和未結合的經熒光標記的蛋白、肽、亞基或其片段。經熒光標記的第一個片段的FP在溶液中迅速旋轉，并因此具有隨機的光選擇性分布，其導致小的實測FP。當第一種亞基的經熒光標記的第一片段與第二種亞基——其通常為更大的、旋轉更慢的分子——的該片段相互作用時，所述經熒光標記的第一片段的旋轉變慢并且熒光偏振增強。因此，測試化合物對所述亞基相互作用的破壞可使所述熒光偏振降低，其指示了對所述蛋白相互作用的抑制?？蓪⒃诖嬖跍y試化合物的情況下的FP量度與不存在測試化合物的情況下的FP量度進行比較。比較可由操作者手動進行，也可由計算機自動進行，特別是在使用384孔板的高通量測定法中。對于蛋白純化，將A型流感病毒聚合酶亞基PA克隆到C末端附有6xHis接頭或血凝素表位(HA)的合適表達載體中。用所述質粒轉染人細胞。在轉染后M小時，用裂解緩沖液(20mM TrisHCl pH 7. 5U00mM NaCl、0. 5mM EDTA、0. 5% NP-40、ImM DTT 和蛋白酶抑制劑混合物)制備細胞裂解物。為從裂解物進行純化，將PA亞基結合于Ni-或抗-HA-瓊脂糖并用沒有蛋白酶混合物的裂解緩沖液進行洗滌。在用溶于20mM TrisHCl pH 7. 5、150mM NaCl、0. 5mM EDTAUmM DTT和5 %甘油中的HA-肽洗脫后，在必要時用 ViVaSpin2050K柱濃縮PA-蛋白并于-80°C下冷凍備用。解凍后，將洗脫緩沖液置換為低熒光級的試劑，同時使用IO-DG Bio-Gel柱除去任何HA-肽。將對應于A型流感病毒聚合酶亞基PBl前25個N-末端氨基酸的經熒光標記的肽以 3nM 的濃度加入到溶于 20mM TrisHCl pH 7. 5、150mM NaCl、0. 5mM EDTAUmM DTT、5%甘油和lOOmg/ml牛γ球蛋白中的10 μ M (mikroM) HA-PA中。將所述混合物分加到黑色384孔板中至總體積為每孔20 μ 1并置于冰上。加入溶于DMSO中的測試化合物至終濃度為25 μ Μ。 于室溫下孵育10分鐘后，用hfinite F200酶標儀(Tecan)讀板。將含有測試化合物的孔的FP值與不含測試化合物、不含DMS0、只含肽的孔進行比較。序列比對使用公共流感病毒數據庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/ FLU/FLU. html)提供的全長序列，用EdgaH2004)中所述的MUSCLE進行比對。建模用Accelrys Discovery Mudio將突變的肽手動泊入PA (C)-PBl (N)晶體結構(He et al.，2008)，然后進行最小化。表格和附圖的詳細描述表Ia示出了通過競爭性ELISA測定的FluA/FluB衍生肽的抑制濃度。將競爭肽 (0. 048-3000nM)與含有來自FluA或FluB的帶有HA標簽的PA的細胞提取物混合。表1 列出了 12種競爭性肽。第一種肽PBIh5A是FluA野生型，第二行示出了 FluB野生型。對于3-8行的肽，字母表示FluB特異性氨基酸。9-12行列出了第6位的氨基酸既非FluA特異也非FluB特異的其他競爭性肽。S.D.示于括號中。星號表示未達到50%抑制時使用的肽的最高濃度。未在此表中列出、但在低肽濃度下可有效達到50%抑制的其他競爭性肽是 PBI1^15At61, PBI1^15At6l 和 PBIh5At^ 具有稍低抑制活性的肽為 PBIw5At6a 和 PBI1^At6m,其也未示于表Ia中。表Ia 通過競爭性ELISA測定的FluA/FluB衍生肽的抑制濃度
權利要求
1.一種合成或分離的流感病毒復制抑制肽，所述肽競爭性地抑制A型和B型流感病毒的異源三聚體病毒RNA聚合酶復合體的PA和PBl亞基的蛋白-蛋白相互作用，所述肽包含氨基酸序列，所述序列包含序列AX6X7X8X9Xici，其中)(5是？；)(6是1\￥、？、1、!1、(、1、1^、￥、八或 M ;X7是L或F 是L、I、F或M成是F、Y、W、H、L、R或S ；并且)(1(1是L、I或Y，所述氨基酸序列與野生型PBlwiA的多肽MDVNPTLLFLK具有至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80% 或90%的同一性，其中不包括所述野生型PBU。
2.權利要求1的肽，包含以下氨基酸序列所述氨基酸序列與野生型PBlw5A的多肽 MDVNPTLLFLKVPAQ具有至少66%、優(yōu)選至少73%、更優(yōu)選至少79%、86%或93%的同一性， 其中不包括所述野生型PBU。
3.權利要求1或2的肽，包含氨基酸序列AX7X8X9Xici，其中\(zhòng)是T、Y、F、W、H、C、I、L或 V ;x7是L或F J8是L或I ;X9是F、Y或W并且X1。是L。
4.權利要求3的肽，包含氨基酸序列)(6X7，其中&是T、Y、F、W、H、C、I、L或V并且X7 是L或F。
5.權利要求1-4之一的肽，其中所述氨基酸序列包含15個殘基&_15。
6.權利要求1-5之一的肽，包含氨基酸序列MDVNPX6X7LFLKVPAQ，其中&選自T、Y、F、 W、H、C、A、I、L、V 或 M，并且 X7 選自 L 或 F。
7.權利要求6的肽，包含選自以下的氨基酸序列MDVNPYFLFLKVPAQ、 MDVNPYLLFLKVPAQ、MDVNPffLLFLKVPAQ 或 MDVNPFLLFLKVPAQ。
8.—種流感病毒復制抑制劑，包含權利要求1-7任一項的肽作為活性成分，所述肽與細胞穿膜肽優(yōu)選HIV-Tat的細胞穿膜結構域融合。
9.權利要求8的流感病毒復制抑制劑，其抑制A型和B型流感病毒株的復制。
10.一種流感預防/治療劑，包含權利要求1-7任一項的肽作為活性成分。
11.權利要求10的流感預防/治療劑，其可有效對抗A型和B型流感病毒株。
12.編碼權利要求1-7任一項的肽的多核苷酸。
13.—種蓋倫制劑，包含權利要求1-7任一項的肽和相容載體。
14.包含權利要求1-7任一項的肽的藥物。
15.用于治療流感的權利要求1-7任一項的肽。
16.權利要求1-7任一項的肽用于生產治療流感的藥物的用途。
17.一種基于ELISA或熒光偏振測定法確定流感病毒聚合酶亞基相互作用抑制劑的方法，包括使用權利要求1-7任一項的肽，其中包括所述野生型，優(yōu)選作為競爭性抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種合成或分離的流感病毒復制抑制肽，所述肽競爭性地抑制A型和B型流感病毒的PA和PB1的蛋白-蛋白相互作用；以及新的用于鑒定具有抗A型和B型流感病毒的抗病毒活性的肽的體外結合篩選。除了廣為人知的A型流行性流感病毒(例如1918年“西班牙”流感或H5N1)，A型和B型病毒均是造成很多人患病和巨額醫(yī)療費用的每年再發(fā)的流行病的主要原因。令人意外的是，已發(fā)現所述新的病毒復制抑制能夠抑制A型和B型流感病毒的異源三聚體病毒RNA聚合酶復合體的PA和PB1亞基的蛋白-蛋白相互作用。所述病毒聚合酶亞基相互作用結構域被證明是所述新抗病毒劑的有效靶標，因為所述三個病毒聚合酶亞基PB1、PB2和PA的正確裝配為病毒RNA合成和傳染性所需的。
文檔編號A61K38/04GK102439028SQ200980159191
公開日2012年5月2日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權日2009年5月8日
發(fā)明者C·拉納德希拉, D·邁爾, K·文德利希, M·施韋姆勒, U·喀斯樂 申請人:派克制藥有限公司