專(zhuān)利名稱(chēng)：釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液制備方法及其抗dna病毒和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液制備方法及其抗DNA病毒和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)的用途， 屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。乙型肝炎病毒(HBV)屬于DNA病毒，其造成的急慢性肝炎、肝壞死及肝細(xì)胞癌對(duì)人類(lèi) 健康危害極大，每年死于肝癌的人數(shù)達(dá)100萬(wàn)以上。以往由于HBV受宿主范圍狹窄和缺乏體 外培養(yǎng)系統(tǒng)的限制，阻礙了抗HBV藥物的研究。近年來(lái)，隨著HBV DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的相繼建 立，為抗HBV藥物篩選提供了必要的條件。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有藥用價(jià)值的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供這種釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液的制備方法。 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供這種釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液抗DNA病毒和促 肝細(xì)胞生長(zhǎng)的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液，采用以下方法制備挑取釀酒酵母單克隆菌落，接種于5ml 的PD培養(yǎng)液中，3(TC振搖過(guò)夜取1毫升轉(zhuǎn)接到500毫升的PD培養(yǎng)液中，28—3(TC (優(yōu)選 28匸)振搖40—60小時(shí)(優(yōu)選48小時(shí))用0.2微米的濾膜過(guò)濾除菌即得。所述PD培養(yǎng)液的配方和制法為水解乳蛋白10—20克；葡萄糖5—15克；氯化鈉7— 12克溶于滅菌水1000毫升高壓8磅40分鐘滅菌。調(diào)PH值7—8。最優(yōu)選的配方為水解乳蛋白15克；葡萄糖10克氯化鈉9克；溶于滅菌水1000毫 升。調(diào)PH值7.5。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,編號(hào)為CICC 1001,培養(yǎng)溫度為28 30^C。我們還發(fā)現(xiàn)其他來(lái)源的釀酒酵母也具有本發(fā)明公開(kāi)的作用。釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液的制備方法，挑取釀酒酵母單克隆菌落，接種于5ml的PD培 養(yǎng)液中，30X:振搖過(guò)夜取1毫升轉(zhuǎn)接到500毫升的PD培養(yǎng)液中，28—3(TC (優(yōu)選28"C) 振搖40—60小時(shí)(優(yōu)選48小時(shí))；用0.2微米的濾膜過(guò)濾除菌即得。
所述PD培養(yǎng)液的配方和制法為水解乳蛋白10—20克葡萄糖5—15克；氣化鈉7— 12克；溶于滅菌水1000毫升；高壓8磅40分鐘滅菌。調(diào)PH值7—8。本發(fā)明可以擴(kuò)大規(guī)模 進(jìn)行生產(chǎn)，例如使用工業(yè)化生產(chǎn)工藝，則培養(yǎng)基的用量和接種量均有適當(dāng)比例的增加。最優(yōu)選的配方為水解乳蛋白15克；葡萄糖10克；氯化鈉9克；溶于滅菌水1000毫 升。調(diào)PH值7.5。釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液具有抗DNA病毒的作用,可以用來(lái)制備治療DNA感染引起的疾 病的藥物。所述DNA病毒包括皰疹病毒、乳頭狀瘤病毒、肝炎病毒等，其中肝炎病毒為乙型 肝炎病毒(HBV)。本發(fā)明提供的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液還具有促肝細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,尤其可促進(jìn)和修復(fù) 人為造成的肝細(xì)胞機(jī)械性損傷，可以用來(lái)制備治療肝細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的藥物。本發(fā)明藥效學(xué)試驗(yàn)采用HBV DNA全基因組的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人的肝癌細(xì)胞HepG2獲得的 2215細(xì)胞，該細(xì)胞能向培養(yǎng)上清中穩(wěn)定的分泌HBsAg和HBeAg及完整的HBV顆粒， 是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的用于體外篩選抗HBV藥物較理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１景l(fā)明采用2215細(xì)胞測(cè)定釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液的毒性反應(yīng)，證實(shí)該分泌液不僅沒(méi) 有毒性作用，反而還對(duì)還具有促進(jìn)作用，這可能是由于釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液抑制了 HBV DNA的復(fù)制而使2215細(xì)胞趨向正常細(xì)胞所致。當(dāng)釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋1: 1000或1:2000時(shí)對(duì)2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分別為52.11 %和59.85%， 提示本發(fā)明在體外達(dá)到一定濃度時(shí)有較好的抗HBV活性。以含有釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠原代肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具 有促肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，維持細(xì)胞正常形態(tài)和抑制肝細(xì)胞纖維化等作用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明意想不到地發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)PD培養(yǎng)基培養(yǎng)和簡(jiǎn)單純化后的釀酒 酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液具備顯著的抗DNA病毒和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，為治療乙型肝炎和肝 損傷性疾病提供了新的治療藥物。下面結(jié)合較佳實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明,凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所作的本領(lǐng)域任 何等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1.制備酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液 一.材料PD培養(yǎng)基水解乳蛋白15克(購(gòu)于北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠) 葡萄糖IO克(北京博大生物科技有限公司) 氣化鈉9克(北京博大生物科技有限公司) 溶于滅菌水1000毫升，高壓8磅40分鐘滅菌。PH值7.5。 釀酒酵母CICCIOOI (購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)二.方法挑取釀酒酵母單克隆菌落，接種于5ml的PD培養(yǎng)液中，301C振搖過(guò)夜；取l毫升轉(zhuǎn)接到 500毫升的PD培養(yǎng)液中，28t:振搖48小時(shí)；用O. 2微米的濾膜過(guò)濾除菌即得。實(shí)施例2.體外抗病毒試驗(yàn)一. 材料酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液按實(shí)施例l方法制備，進(jìn)行10倍濃縮。人肝癌2215細(xì)胞(2.2.15細(xì)胞)美國(guó)西奈山大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化科贈(zèng)送北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院傅希賢教授轉(zhuǎn)贈(zèng)。培養(yǎng)液DMEM,內(nèi)含380ug/mlG418(美國(guó)GIBCO公司)青、鏈每素各100IU/ml， 10%無(wú)支原體小牛血清(購(gòu)于杭州四季青生物工程材料研究所)03%谷氨酰胺，pH值7.0左右。二. 方法1. 2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg規(guī)律的測(cè)定將2215細(xì)胞按lX105個(gè)/ml接種培養(yǎng)瓶(10ral/瓶)，每隔3天換液并收集上清液，置一20 "保存，共收8次，然后同時(shí)檢測(cè)各上清液中的HBsAg和HBeAg。2. 細(xì)胞毒性試驗(yàn)培養(yǎng)至單層的2215細(xì)胞分別用釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液和DEME培養(yǎng)液共同培養(yǎng) 5天(其中，釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液與DEME培養(yǎng)液的體積比分別為1: 10, 1: 50， 1: 100， 1: 200),同時(shí)設(shè)不含該分泌液的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照，每日在 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,取無(wú)細(xì)胞毒性作用的最低稀釋度為抗HBV的起始濃度。3. 釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液抗HBV活性試驗(yàn)2215細(xì)胞以1 X 105個(gè)/ml分瓶培養(yǎng)9天后用釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液和DEME培養(yǎng)液 共同繼續(xù)培養(yǎng)5天，收集細(xì)胞上清液測(cè)定HBsAg。以抑制率大于50。^為有效抑制濃度。對(duì)照孔P/N比值一試驗(yàn)孔P/N比值抑制率=-對(duì)照孔P/N比值
三.結(jié)果1. 2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg規(guī)律的測(cè)定試驗(yàn)表明2215細(xì)胞在接種后的第3天即可從培養(yǎng)上清中檢測(cè)出HBsAg和HBeAg, 而且HBeAg的值略髙，當(dāng)培養(yǎng)到第9天時(shí)，兩種抗原的分泌量出現(xiàn)高峰，并在15天后 緩慢下降，見(jiàn)表1所示。表l:2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg規(guī)律的培養(yǎng)上清液P/N值培養(yǎng)時(shí)間(天)HBsAgHBeAg33.825.4167.459.56916.1021.311216.8321,851516.3221.791815.3720,922112.6218.61249.3216.142. 細(xì)胞毒性試驗(yàn)以不同稀釋度的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液和DEME培養(yǎng)液共同培養(yǎng)2215細(xì)胞5天 后，未見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)不良反應(yīng)，出乎意料的是，用加入釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液的DEME 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，其形態(tài)、立體感、致密度均優(yōu)于未加該分泌液的。3. 釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液抗HBV活性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，表明釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液對(duì)2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制 率與釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液的濃度呈正相關(guān)。表2:釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率(％ )釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋度(l:)100200500100020004000HBsAg96.6288.5275.8352. n37.8126.27HBeAg99.1793.2287.5475.1359.8548.13
實(shí)施例3.釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液促肝細(xì)胞生長(zhǎng)及抑制肝纖維化細(xì)胞的作用一. 材料成年雄性Wistar大鼠，體重200土20g，本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， 1V型膠原酵，SIGMA公司產(chǎn)品，培養(yǎng)液DMEM，內(nèi)含380u g/mlG418 (美國(guó)GIBCO公司)青、鏈霧素各100IU/ml， 10%無(wú)支原體小牛血清(購(gòu)于杭州四季青生物工程材料研究所)03%谷氨酰胺， pH值7.0左右。二. 方法1. 分離肝細(xì)胞肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞分離方法采用原位二步灌注法。取 Wistar大鼠，用0.594戊巴比妥鈉麻醉，固定，無(wú)菌處理后開(kāi)腹。門(mén)靜脈插管。灌注先經(jīng)37r 水浴并通氧氣的無(wú)Ca Mg"離子的Hanks液，以洗去肝中血液。待肝顏色變白后，換用經(jīng)37匸 水浴并通氧氣的0.0296的IV型膠原酶繼續(xù)灌注。約10min后取出肝臟，碎過(guò)濾離心 700卬m/min 3次。將細(xì)胞懸浮于含1096無(wú)支原體小牛血清的DMEM中。計(jì)數(shù)后，以lXl()S個(gè)/ral接種培養(yǎng)瓶，于37^含5% ca的孵箱中培養(yǎng)。2. 培養(yǎng)和觀察用含不同濃度的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)鼠肝細(xì)胞(釀酒酵母細(xì)胞培 養(yǎng)分泌液與DEME培養(yǎng)液的體積比分別為1: 10， 1: 50, 1: 100, 1: 200)，每隔4天 換液，每R鏡檢比較細(xì)胞生長(zhǎng)情況。二.結(jié)果鏡檢結(jié)果表明，釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液具有促肝細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)和維持細(xì)胞正 常形態(tài)及延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間等作用，尤其在人為造成肝細(xì)胞機(jī)械性損傷(吸管用力吹打) 后，釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液可有效促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)和再生。此外，釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分 泌液對(duì)肝貯脂細(xì)胞有明顯的抑制作用，延緩了肝細(xì)胞的纖維化過(guò)程。
權(quán)利要求
1. 釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液，其特征在于采用以下方法制備挑取釀酒酵母單克隆 菌落，接種于5ml的PD培養(yǎng)液中，30r振搖過(guò)夜；取1毫升轉(zhuǎn)接到500毫升的PD培養(yǎng)液中， 28—30'C振搖40—60小時(shí)；用0.2微米的濾膜過(guò)濾除菌即得；PD培養(yǎng)液的配方和制法為水解乳蛋白10—20克；葡萄糖5—15克；氯化鈉7 — 12克;溶于滅菌水1000毫升高壓8磅40分鐘滅菌，pH值為7-8。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液，其特征在于所述PD培養(yǎng)液的配 方為水解乳蛋白15克；葡萄糖10克氯化鈉9克；溶于滅菌水1000毫升，pH值為7. 5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液，其特征在于所述釀酒酵母 購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為CICC 1001。
4. 釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液的制備方法，其特征在于挑取釀酒酵母單克隆菌落，接 種于5ml的PD培養(yǎng)液中，30TC振搖過(guò)夜；取1毫升轉(zhuǎn)接到500毫升的PD培養(yǎng)液中，28—30 t:振搖40—60小時(shí)用0. 2微米的濾膜過(guò)濾除菌即得；PD培養(yǎng)液的配方和制法為水解乳蛋白10—20克；葡萄糖5—15克；氯化鈉7 — 12克;溶于滅菌水1000毫升；高壓8磅40分鐘滅菌，pH值為7-8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液的制備方法，其特征在于所述PD培養(yǎng)液的配方為水解乳蛋白15克；葡萄糖10克；氣化鈉9克；溶于滅菌水1000毫升，pH 值為7.5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液的制備方法，其特征在于所 述釀酒酵母購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為CICC 1001。
7. 釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液制備治療DNA感染引起的疾病的藥物的用途。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述DNA病毒包括皰疹病毒、乳頭狀瘤 病毒或肝炎病毒。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述肝炎病毒為乙型肝炎病毒。
10. 釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液在制備治療肝細(xì)胞損傷相關(guān)疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液制備方法及其抗DNA病毒和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)的用途，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)分泌液，采用以下方法制備挑取釀酒酵母單克隆菌落，接種于5ml的PD培養(yǎng)液中，30℃振搖過(guò)夜；取1毫升轉(zhuǎn)接到500毫升的PD培養(yǎng)液中，28-30℃振搖40-60小時(shí)；用0.2微米的濾膜過(guò)濾除菌即得。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明意想不到地發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)PD培養(yǎng)基培養(yǎng)和純化后的釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液具備顯著的抗DNA病毒和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，為治療乙型肝炎和肝損傷性疾病提供了新的治療藥物。
文檔編號(hào)A61K36/06GK101121922SQ20061008919
公開(kāi)日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2006年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月8日
發(fā)明者洪 劉, 貌盼勇 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三○二醫(yī)院;王 濤