專利名稱：對(duì)A型流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利涉及對(duì)流感病毒有干擾作用的siRNA序列的設(shè)計(jì)和干擾作用的鑒定
背景技術(shù)：
流行性感冒(Influenza)，簡(jiǎn)稱流感，被稱為最古老和最致命的人類瘟疫之一。據(jù) 歷史記載，早在1510年英國(guó)就發(fā)生了由全球第一起由流感引起的流行病。如今，美國(guó)每年 有2萬人死于流感，俄羅斯每年也有1萬人死于流感，英國(guó)每年有5萬人由流感發(fā)展成肺 炎，其中約20%死亡。據(jù)估計(jì)，全球每年流感患者死亡人數(shù)高達(dá)60萬人，多于艾滋病患者死 亡的人數(shù)。美國(guó)已將流感列為繼心臟病、癌癥、中風(fēng)、肺氣腫之后的威脅生命的第五大"殺手"。
流行性感冒，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流行性感冒病毒(Influenzavirus) 分別引起的急性呼吸道傳染病。甲乙丙不僅反映了病毒被發(fā)現(xiàn)的年代及前后順序，更主要 的是反映了對(duì)人類危害程度的順序。甲型變動(dòng)常以流行形式出現(xiàn)，引起世界性流感大流行， 在動(dòng)物中分布廣泛，并也能在動(dòng)物引起流感流行和造成大量動(dòng)物死亡。
盡管由死病毒、減毒毒株或重組表面糖蛋白組成的抗流感疫苗能夠有效地保護(hù)約 70 80%的健康成年人免于患病，但是疫苗只能針對(duì)一小部分毒株，對(duì)于新的潛在爆發(fā)的 毒株可能沒有作用。而且，對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)人群如嬰孩、老人、孕婦和其它各種免疫力低下的人 群，疫苗的保護(hù)作用是非常有限的，保護(hù)率低于40%。由于大部分的死亡都是發(fā)生在高風(fēng)險(xiǎn) 人群中，疫苗對(duì)于這些最需要它們的人卻不能起到很好的保護(hù)作用。正在應(yīng)用的幾種抗流 感藥物也能夠降低流感感染的發(fā)生和減輕流感感染時(shí)的癥狀。但是，藥物的副作用、病人的 承受能力、可能出現(xiàn)的抗藥性變異限制了這些藥物的大規(guī)模使用。所以，對(duì)于預(yù)防和治療流 感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特別是在高風(fēng)險(xiǎn)人群中和爆發(fā)流感時(shí)。因此，流感 的防治至少在今后50年內(nèi)仍然是一個(gè)嚴(yán)重的問題，尋找更有效的預(yù)防和治療途徑是醫(yī)學(xué) 研究的重大課題。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)是1998年首先在線蟲發(fā)現(xiàn)的由雙鏈RNA介 導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。RNAi —經(jīng)發(fā)現(xiàn)，迅速成為生物學(xué)研究領(lǐng)域中最 為活躍的熱點(diǎn)之一，Science雜志在2001年將其列為十大科學(xué)成就之一，2002年又將其列 為十大科技之首；Nature雜志也將小RNA評(píng)為2002年度最重要的科技發(fā)現(xiàn)之一 ；Andrew Z. Fire和Craig C. Mello因RNA干擾的發(fā)現(xiàn)而獲得了 2006年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。隨著廣 泛深入的實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)行，人們對(duì)RNAi的機(jī)制有了更多的了解。 目前認(rèn)為RNAi的主要過程為①siRNA形成階段。RNAi的誘導(dǎo)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被 RNaseIII Dicer切割成為21_23nt的小分子干擾RNA (small interferingRNA， siRNA)，siRNA的結(jié)構(gòu)特征是5'端單磷酸，3'端羥基，而且3'端有2 3_nt的堿基突出；②RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced Silencing Complex, RISC)的形成階段。siRNA與RNAi 特異性酶(如Ago-2)結(jié)合，形成RISC，具有特異性的核酸內(nèi)切酶活性能特異性地降解與 siRNA同源的mRNA ;③效應(yīng)階段。RISC中siRNA變性，雙鏈解開，卸下正義RNA，反義RNA仍 結(jié)合在復(fù)合物上，并引導(dǎo)RISC與同源的靶目標(biāo)mRNA結(jié)合，在核酸內(nèi)切酶的作用下，將靶目 標(biāo)mRNA切斷(切割位置在siRNA的中央，距離5'端10-nt)，從而阻斷了其翻譯成蛋白質(zhì)， 表現(xiàn)為基因沉默。miRNA導(dǎo)致基因沉默的機(jī)制與此稍有不同，它們與靶mRNA 3'非編碼區(qū) (untranslated region, UTR)通過不完全互補(bǔ)結(jié)合，抑制翻譯過程和蛋白質(zhì)的合成。
RNAi能夠被迅速應(yīng)用于多種生物和功能的研究，得益于它的實(shí)驗(yàn)方法相對(duì)簡(jiǎn)單， 周期短，表型易于觀察。RNAi實(shí)驗(yàn)中最關(guān)鍵的因素是干擾靶點(diǎn)的選擇、siRNA的制備和基因 導(dǎo)入方法 作為一種快速、有效、特異的抑制基因表達(dá)的工具，尤其是發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞也 存在這一機(jī)制后，RNAi被廣泛用于基因功能的研究以及腫瘤、病毒性疾病和遺傳性疾病的 治療研究。 自2003年以來RNAi抗IAV的已經(jīng)有很多，有細(xì)胞水平的，也有動(dòng)物水平的，有用 合成的siRNA的，也有用載體的。Ge等針對(duì)A型流感病毒病毒的八個(gè)基因設(shè)計(jì)并合成了 20 個(gè)siRNA，與H1N1共轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞和十日齡雞胚，結(jié)果提示以NP和PA基因?yàn)榘尹c(diǎn)的siRNA 對(duì)A型流感病毒病毒感染有較好的抑制作用。Eric Ka-Wai Hui等通過研究指出以病毒的M 基因?yàn)榘悬c(diǎn)的化學(xué)合成siRNA能夠特異性地抑制293T細(xì)胞中流感病毒的基質(zhì)蛋白Ml的表 達(dá)，并且利用慢病毒載體來表達(dá)針對(duì)M基因的siRNAs同樣能夠特異性地抑制MDCK細(xì)胞中 Ml的表達(dá)和流感病毒的復(fù)制。我國(guó)學(xué)者郭驍才等采用自己編寫的計(jì)算機(jī)程序結(jié)合系統(tǒng)發(fā) 育重建方法，對(duì)6101個(gè)siRNA分子進(jìn)行了計(jì)算機(jī)篩選，結(jié)果表明設(shè)計(jì)的siRNA的分子針對(duì) NP和PB1應(yīng)該是最有效的。在動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)上，St印hen等證明了針對(duì)A型流感病毒HlNl 的NP和PA高度保守區(qū)域的特異的siRNA能夠抑制病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制，并且能夠抑制 多種H5和H7亞型病毒的體內(nèi)復(fù)制。另外，Qing Ge等發(fā)現(xiàn)將化學(xué)合成的siRNAs和一種多 聚陽離子載體PEI —起靜脈注射到小鼠后眼窩，可以抑制病毒感染的小鼠的肺部?jī)?nèi)的病毒 復(fù)制。同樣的結(jié)果也可見于小鼠被能夠表達(dá)siRNAs前體的慢病毒載體與PEI共注射或與 Infasurf共灌輸?shù)叫∈蠓尾俊?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供3條對(duì)A型流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA及其編碼 序列。所述的3條對(duì)A型流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA的序列分別如序列表400〈1>、 400〈2>和400〈3>所示。 本發(fā)明所述的三條siRNA的動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNAi不但能有效抑制HINI 的病毒復(fù)制，而且能夠抑制A型流感病毒其它亞型(如H3N1)的復(fù)制，為其用于流感的治療 和預(yù)防提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 :siRNA序列的設(shè)計(jì)和靶點(diǎn)的選擇 設(shè)計(jì)和合成siRNA應(yīng)遵循的一般原則是①應(yīng)避免選擇5'和3'端UTR和起始密 碼區(qū)；②應(yīng)根據(jù)目的基因的mRNA，選擇其AUG起始密碼子下游50 100nt區(qū)域處的編碼序 列；③GC含量應(yīng)在30% 50%之間；④盡量避免3個(gè)同樣的核苷酸連續(xù)出現(xiàn)；⑤每條鏈的 3'端要有2個(gè)堿基(最好是TT)突出；⑥最后，選擇的DNA片段經(jīng)BLAST查詢，應(yīng)與其它人 類基因無同源性，以避免非特異性抑制。 采用這一原則，設(shè)計(jì)出序列表所述的三條siRNA序列〈400>1、 〈400>2、以及 〈400>3 ，并采用常規(guī)方法進(jìn)行合成，進(jìn)行以下的試驗(yàn)。
實(shí)施例2 :shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 以129Sv/Ev小鼠基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出276bp的U6啟動(dòng)子序列。PCR
產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和Xbal雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pBluescript載體(美國(guó)Stratagene公
司)連接得到載體pU6P，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，以
證實(shí)插入序列的正確性。 實(shí)施例3 :pU6-siHlNl載體的構(gòu)建 載體pU6P用EcoRV-Xba I雙酶切，質(zhì)粒酶切產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離，切 膠用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，與合成的siRNA寡核苷酸鏈進(jìn)行連接反應(yīng)。轉(zhuǎn)化后挑取陽 性克隆。 實(shí)施例4 :雞胚實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證pU6-siHlNl干擾H1NI流感病毒增殖的有效性 同時(shí)注射H1N1流感病毒(1000倍稀釋液0. lml)和pU6-siHlNl (5微克)進(jìn)九日
齡雞胚氣室下尿囊腔，33t:培養(yǎng)72小時(shí)，取尿囊液，測(cè)血凝效價(jià)。 血凝試驗(yàn)測(cè)定尿囊液病毒滴度，具體過程如下 (1)于微量血凝板的每孔中滴加稀釋液1 XPBS 50 ii L，根據(jù)被檢樣品數(shù)量定所加 排數(shù)。 (2)吸取被檢尿囊液分別滴加于第一列孔，每個(gè)樣品50ii L，然后由左至右順序倍
比稀釋至第ll列孔，再從第11列孔各吸取50iiL棄之。最后一列不加樣品作空白對(duì)照。 (3)于每孔中加入0. 5%紅細(xì)胞懸液50 ii L。 (4)置微型振蕩器上振蕩lmin，或手持血凝板繞圓圈混勻。 (5)放室溫下(l8 20°C ):30min，或;3rC下l5 加min，觀察結(jié)果。 經(jīng)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，序列表所述的三條序列〈400>1、 〈400>2、以及〈400>3對(duì)流感病
毒復(fù)制的抑制率如下
序列抑制后病毒滴度/未抑制病毒滴度
序列〈400>18/512
序列〈400>216/512
序列〈400>364/512
5
序列表〈110〉中山大學(xué)〈120〉對(duì)A型流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA及其編碼序列〈160〉3〈210〉1〈211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1aatccgaccg ctcttaata 19〈210>2<211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>2朋tctggcgc c朋gct朋te a 21〈210>3〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>3gaaatctcac tcagttatt 19
權(quán)利要求
一種對(duì)流感病毒復(fù)制有干擾作用的siRNA，其核苷酸序列如序列表400<3>所示。
2. 權(quán)利要求1所述的siRNA作為治療流感病毒的藥物的應(yīng)用。
3. 含有權(quán)利要求1所述的siRNA的表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一條對(duì)流感病毒復(fù)制有抑制作用的siRNA；針對(duì)H1N1的shRNA表達(dá)載體pU6-siH1N1的構(gòu)建及其對(duì)A型流感病毒的干擾作用的鑒定技術(shù)。本發(fā)明首先利用分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)構(gòu)建了十幾條siRNA的表達(dá)載體；然后通過雞胚實(shí)驗(yàn)測(cè)HA滴度的方法確定了siRNA對(duì)流感病毒干擾的有效性。
文檔編號(hào)A61P31/16GK101760457SQ200910205078
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月6日
發(fā)明者任政華, 周亮, 周俊祺, 徐安龍, 李榮輝, 謝征, 鄔明月 申請(qǐng)人:中山大學(xué)