專利名稱：無誘導表達基因工程菌株及構(gòu)建方法和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及植物病害的防治，可以抵抗細菌、真菌、病毒、線蟲等對植物的危害。更具體地講，本發(fā)明涉及無誘導表達Harpin基因工作菌株，同時還涉及該菌株的構(gòu)建方法，該發(fā)明在防治植物病害中的應用。
背景技術(shù)：
過敏反應是植物自身具有的一種保護反應，類似于高等動物所具有的廣譜抗病菌免疫反應。植物病原真菌、細菌和病毒都能夠引起過敏性反應(hypersensitive response，HR)。過敏性反應是一種快速的、與防衛(wèi)反應相關的在侵染位點造成的植物細胞程序性死亡(programmedcell death，PCD)(Dangl et al.，1996；Klement et al.，1982)，從而使病原菌被限制在侵染部位，不能增殖。主要表現(xiàn)為接種區(qū)植物組織局部產(chǎn)生枯斑。病原菌所產(chǎn)生的一些多糖、脂多糖、糖蛋白、脂肪酸、蛋白質(zhì)以及多肽等物質(zhì)是誘導植物過敏性反應的主要因子，這些物質(zhì)被稱為激發(fā)子(elicitor)。高等植物過敏性反應(hypersensitiveresponse，HR)，是植物在受到病原細菌侵染、發(fā)生不親和(incompatible)反應時所產(chǎn)生的一種特有現(xiàn)象。
植物病原細菌屬Erwinia、Pseudomonas、Xanthomonas和Ralstonia中許多病原菌存在寄主專一性。它們侵染寄主植物后，能夠引起各種各樣不同的病癥；而在侵染非寄主植物后，則能夠激發(fā)過敏性反應的產(chǎn)生。最初，在用轉(zhuǎn)座子隨機誘變病原菌的研究中發(fā)現(xiàn)，某些突變體喪失了在寄主植物上的致病性，又喪失了在非寄主植物上的過敏性反應，這被稱之為hrp-表型(Lindgren et al，1986；Niepold et al.，1985)。后來的研究發(fā)現(xiàn)，這種表型的產(chǎn)生是由于病原菌中hrp基因(Hypersensitivereaction and pathogenicity gene)發(fā)生突變所致。革蘭氏陰性植物病原細菌屬中的大部分病原菌都含有hrp基因，控制其在寄主上的致病性和在非寄主上引起過敏性反應。HR反應后，受侵染植物體內(nèi)出現(xiàn)了一系列的生理、生化及細胞結(jié)構(gòu)的變化，例如強化結(jié)構(gòu)屏障作用(Ride JP et al，1983)、合成裂解酶(Linthorst H J M et al，1990)或者產(chǎn)生植物抗毒素(Paxton J D et al，1994)等，具體表現(xiàn)在能夠防止病菌二次或繼發(fā)性侵染(Harald K et al，1996)。
1992年，Wei等首先從梨火疫病的病原細菌(Erwinia amylovora)中分離到一種約44kDa、能激發(fā)HR的蛋白類激發(fā)子harpin(hrpN基因編碼，常用harpin Ea表示)，并將研究成果發(fā)表在《Science》上(Weiet al.，1992)。隨后利用hrpN基因的內(nèi)同源性，相繼從E.chrysanthemi和E.carotovora中獲得了HR激發(fā)子harpinEch和harpinEcc(David etal.，1995；Asita et al.，1997)。丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)中的harpin由hrpZ基因編碼產(chǎn)生，它同樣能夠通過Hrp通道分泌(He etal.，1993；Yuan et al.，1996；Charkowski et al.，1997)。雖然harpinPss與harpinEa具有類似的性質(zhì)與功能，但hrpZ與hrpN基因之間缺乏同源性。也就是說hrp基因的外同源性很低。利用hrpZ基因探針，在P.s.pv.tomato和P.s.pv.glycine中分離到HR激發(fā)子harpinPst和harpinPsg(Prestin et al.，1995)。harpinPst和harpinPsg與harpinPss分別具有76％和63％的序列同源性。PopA1是從R.solanacearum中發(fā)現(xiàn)的HR激發(fā)子(Arlat et al.，1994)，其性質(zhì)與功能類似于harpin，能誘導煙草及牽牛花的過敏性反應，因此也是harpin蛋白家族的成員。
hrp基因存在于植物病原細菌中，決定病原菌對寄主植物的致病性和非寄主植物的過敏反應HR。HrpW是在E.amylovora和P.s.pv.syringae中發(fā)現(xiàn)的第二種類型的harpin蛋白(Amy et al.，1998；Gaudriault et al.，1998)。在序列上，它同時具有harpin和果膠裂解酶的特征，但在功能上只有誘導非寄主植物過敏性反應的活性而沒有果膠裂解酶的活性。hrpW與hrpN、hrpZ基因之間缺乏明顯的序列同源性，但hrpW與P.s.pvs.、R.solanacearum和Xanthomonas campestris的基因組DNA有同源雜交信號，這表明，hrpW基因可能廣泛存在于革蘭氏陰性植物病原細菌中。
hrp基因一般以簇的形式存在于細菌染色體上，長度在17-41kb之間，由多個轉(zhuǎn)錄單元組成。E.amylovora的hrpN基因與P.s.pv.syringae的hrpZ基因分別編碼使煙草產(chǎn)生HR反應的蛋白harpinEa和harpinPss，它們的分子量分別為44kDa和34.7kDa，由385個氨基酸和341個氨基酸殘基組成。雖然這兩種蛋白具有類似的性質(zhì)與功能，但hrpN與hrpZ基因之間缺乏同源性，也就是說harpin編碼基因在屬與屬之間的同源性很低，但在同一個屬內(nèi)同源性很高。
harpin在植物病原細菌中起到一個激發(fā)非寄主HR和誘導抗病性的功能，但是對于其在病原菌與親和寄主互作時所起的作用還不甚清楚。Harpin與其受體HrBPI結(jié)合后，會激活多種防衛(wèi)反應信號傳導，從而使植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應。其激活植物防衛(wèi)反應的途徑主要有三種(1)一種未知途徑激活植物抗細菌反應；(2)水楊酸途徑激活植物的抗細菌/真菌/病毒反應；(3)乙烯和茉莉酸途徑激活抗真菌反應。
Harpin蛋白并不直接作用于靶標作物，而是刺激作物產(chǎn)生自然的免疫機制，使得植物能抵抗一系列的細菌、真菌和病毒病害。因此，harpin能夠直接應用于植物病害防治(直接噴灑使用或構(gòu)建多功能生防微生物)，也能夠應用于轉(zhuǎn)基因植物為產(chǎn)生廣譜的抗病特性。
Harpin蛋白還具有促進生長和發(fā)育的功能。研究表明過敏素蛋白可以增強植物的光合作用，利于營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，因此可以促進種子萌發(fā)和植物發(fā)育，提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，增大植株個體，利于植物的早熟和結(jié)實(傅華欣，1999；高正良，1999)。此外還有研究發(fā)現(xiàn)過敏素蛋白可提高蔬菜、水果抗腐爛、霉變能力，延長貯藏時間。可能與細胞壁修飾基因，生長時相調(diào)節(jié)基因有關。此外，Harpin蛋白對于農(nóng)作物、蔬菜害蟲如棉鈴蟲、甜菜夜蛾、菜青蟲等也有一定的趨避和控制作用。
美國EDEN公司利用harpin蛋白開發(fā)一種新的生物農(nóng)藥MessengerTM，并于2000年4月在US-EPA獲得登記。HarpinEa蛋白是通過將E.amylovora編碼harpin蛋白的DNA片段轉(zhuǎn)入E.coli K-12中表達進行商業(yè)化生產(chǎn)而獲得的。用于生產(chǎn)harpin蛋白的E.coli是一弱毒株系，不能在人體消化道中生長，也不能在環(huán)境中存活。發(fā)酵以后，E.coli K-12細胞被殺死和溶解，harpin蛋白和其它細胞成分被提取用來制成MessengerTM產(chǎn)品。該產(chǎn)品對農(nóng)作物、果林、花卉等具有提高免疫力，增強抗病、抗蟲性和調(diào)節(jié)生長發(fā)育、改善品質(zhì)、增產(chǎn)增收兩大功能。還能夠促進根系、莖葉、果實生長。還可以增強植物的光合作用活性，提高光合速率和效率；加快植物生長發(fā)育進程，促進作物提前開花和成熟，減輕采后病害危害，延長農(nóng)產(chǎn)品貨架保鮮期，對改善作物品質(zhì)，提高商品等級，增產(chǎn)增收有明顯的效果。MessengerTM也是一種無毒、無害、無殘留、無抗性風險的生物農(nóng)藥。由于該產(chǎn)品用量低，且在土壤中容易降解，在實驗作物中不出現(xiàn)殘留，所以它對人的健康和周圍環(huán)境無影響。此外，實驗證明該產(chǎn)品對野生動物(如鳥、魚、蜜蜂、水蚤和藻類植物等)無害。harpin蛋白對植物病原不具有直接的抑制或毒殺效果，不存在促進有害生物種群抗性發(fā)展的選擇壓。
國內(nèi)，趙立平等用表達Harpin基因的大腸桿菌DH5α進行了誘導植物抗病性的研究，發(fā)現(xiàn)表達Harpin基因的重組菌除可明顯誘發(fā)煙草、番茄葉片的過敏反應外，對玉米、水稻葉片也能誘發(fā)過敏反應。李汝剛等也將harpin應用于轉(zhuǎn)基因植物的研究，獲得了抗晚疫病的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于提供一種無誘導表達基因工程蛋白質(zhì)APDZ。APDZ蛋白能刺激作物產(chǎn)生自然的免疫機制，使得植物能抵抗一系列的細菌、真菌和病毒病害。APDZ蛋白還具有促進生長和發(fā)育的功能，對于農(nóng)作物、蔬菜害蟲如棉鈴蟲、甜菜夜蛾、菜青蟲等也有一定的趨避和控制作用。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種重組基因工程菌株EscherichiacoliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)，該大腸桿菌包含編碼基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列，或者包含編碼本發(fā)明所述的基因工程蛋白APDZ的DNA片段。利用該重組基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)可以表達基因工程蛋白質(zhì)APDZ。
本發(fā)明的再一個目的在于提供一種大腸桿菌宿主細胞的構(gòu)建方法，方法簡便，操作方便，該宿主細胞包含基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列。表達量高，基因工程蛋白的表達量最高可以達到菌體蛋白總量的30-50％，融合表達，安全性高，利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的還涉及一種無誘導表達HarpinZ基因的方法，方法易行?？梢圆挥谜T導物，表達基因工程蛋白質(zhì)APDZ。
本發(fā)明還涉及基因工程蛋白在防治植物病蟲害中的應用。
本發(fā)明還涉及基因工程蛋白在提高植物質(zhì)量和產(chǎn)量中的應用。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明提供一種基因工程蛋白質(zhì)APDZ，其氨基酸序列具有與SEQ IDNO.2所示氨基酸至少70％同源性的序列，其分子量為約55.8kDa。所述的基因工程蛋白質(zhì)APDZ具有抗植物病蟲害的生物活性。
本發(fā)明提供一種基因工程蛋白質(zhì)APDZ，一種分離的蛋白質(zhì)其具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
本發(fā)明提供一種編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列，一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。
本發(fā)明提供一種編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列，一種分離的蛋白質(zhì)其具有與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少70％同源性的序列。
本發(fā)明是提供一種編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列，一種分離的蛋白質(zhì)其具有與SEQ ID NO.1所示核苷酸至少80％同源性的序列。
本發(fā)明提供一種編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列，與HarpinZ蛋白質(zhì)編碼的核苷酸具有至少90％同源性的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一種DNA片段的制備方法，該片段包含所述的編碼基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所提供的一種基因工程蛋白質(zhì)APDZ，一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸至少70％同源性的序列，其分子量為約55.8kDa，該基因工程蛋白質(zhì)APDZ具有抗植物病蟲害的特性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種基因工程蛋白質(zhì)APDZ，一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸至少80％同源性的序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種基因工程蛋白質(zhì)APDZ，一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸至少90％同源性的序列。
本發(fā)明所述的基因工程蛋白質(zhì)APDZ的氨基酸序列包括與蛋白質(zhì)Harpin Z具有至少96％同源性的氨基酸序列。
對于蛋白質(zhì)Harpin的研究，已經(jīng)有多種報道。在基因庫(GENEBANK)中，已經(jīng)存在了關于Harpin氨基酸序列的信息。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明所述的基因工程蛋白質(zhì)APDZ具有的氨基酸序列已經(jīng)被測序，具體結(jié)果如下MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMAISDPNSMRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPTLMQSLSLNSMSSLQTSASLFPVSLNSDVSANTSTSSKELKAVIDQLVQALTQSGQLDETSPLGKMLAKAMAADGKSANSIDDITASLDKLIHEKLGNNFGASAGIGAGGGGGGIGGAGSGSGVGGGLSSDAGAGQSDLMSQVLNGLGKAVLDDLLTPSGEGGTTFSSDDMPTLEKVARFMDDNKAQFPTRDGGSWMNELKEDNGLYAQETAQFRSALDVIGQQLGQQQGDASGVTSGGGLGSPVSDSSLGNPAIDANTGPAANGNASVDVGQLIGQLIDRGLQSVSSGGGLGTPVDNSTQPTGGTPAANPTGNVSNQDLGQLLNGLLQRGLEATLQDAGNTGADLQSSAAQVAAQLINA > LLQGTNNQTNQAVALEHHHHHH.
本發(fā)明所述的基因工程蛋白質(zhì)APDZ的氨基酸序列可以在一定范圍內(nèi)進行修飾、改變，所獲得的修飾后的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段與基因工程蛋白質(zhì)APDZ有相同的生物學功能，即它們富含甘氨酸、熱穩(wěn)定且對蛋白酶敏感，能使煙草、馬鈴薯、番茄、大豆、黃瓜及擬南芥菜產(chǎn)生過敏性反應。對蛋白質(zhì)進行修飾和改變的方法為常規(guī)的方法，為本專業(yè)技術(shù)人員所熟悉。按照現(xiàn)代生命科學的理論，氨基酸序列同源性70％以上的蛋白質(zhì)在生物學中常被詮釋為是具有相同生物學功能的蛋白質(zhì)。在此范圍內(nèi)對蛋白質(zhì)氨基酸序列進行的修飾和突變均被認為并未改變蛋白質(zhì)的生物學特性，這些改變和修飾包括(1)對個別氨基酸進行突變，特別是非功能決定位點的氨基酸。
(2)缺失或插入個別氨基酸，特別是非功能決定位點的氨基酸。這樣的改變?nèi)绻麤]有改變蛋白的空間構(gòu)象，就不會影響蛋白質(zhì)的生物學功能，也不會改變蛋白質(zhì)的免疫原性。
(3)插入特殊的氨基酸殘基。為了增加或改變蛋白質(zhì)的可溶性，增加穩(wěn)定性，在基因工程生產(chǎn)過程中，往往會在蛋白質(zhì)的N、C端加入一些氨基酸殘基，以避免形成包涵體，減少宿主細胞蛋白質(zhì)內(nèi)切酶的降解；或者在N、C端加入一些特殊的氨基酸功能位點以利于蛋白質(zhì)的表達和純化。
以上對蛋白質(zhì)進行修飾和改變的方法為常規(guī)的方法，為本專業(yè)技術(shù)人員所熟悉。通過上述方法獲得的與本發(fā)明所述的基因工程蛋白質(zhì)有70％同源性的蛋白質(zhì)或免疫性片段都具有與本發(fā)明所述基因工程蛋白APDZ相同的生物學功能，即它們能使煙草、馬鈴薯、番茄、大豆、黃瓜及擬南芥菜產(chǎn)生過敏性反應，能夠用于實現(xiàn)本發(fā)明的一個或多個目的。
根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸組成，結(jié)合SDS-PAGE的分析結(jié)果，本發(fā)明所涉及的基因工程蛋白APDZ的分子量為約55.8kDa。如果蛋白質(zhì)的氨基酸序列發(fā)生部分或局部的改變，蛋白質(zhì)的分子量會發(fā)生變化。選用不同的宿主菌株和表達載體，由于翻譯后修飾的原因，蛋白質(zhì)的分子量也會發(fā)生變化。選用不同的檢測方法，蛋白質(zhì)的分子量也會有一些差異，但這些變化和差異在原則上不會超過蛋白質(zhì)分子量的10％。
本申請人還對Harpin Z基因進行了PCR擴增，擴增得到的Harpin Z基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1在一些丁香假單胞桿菌變種(Pseudomonas syringae pvl)、青枯假單胞桿菌(Pseudomonas solanacearum)、野油菜黃單胞桿菌(Xanthomonas campestris)及一些歐文氏桿菌屬(Erwinia)的細菌中發(fā)現(xiàn)有3類hrp基因簇(Bogdanpve A J et al，1998)。這3類hrp基因簇間同源性很小，但同類hrp基因簇內(nèi)同源性很強。根據(jù)基因的序列相似性及其操縱子的組織結(jié)構(gòu)可將hrp分為兩個組，第一個組包括丁香假單胞菌(Pseudomonas)和梨火疫病歐文氏菌(Erwinia)屬的hrp基因，第二個組是野油菜單胞菌(Xanthomonas campestris)和Ralstoniasolanacearum中發(fā)現(xiàn)的hrp基因，兩組hrp基因簇的主要差異是基因調(diào)控不同。
本申請人針對已經(jīng)報道的Harpin進行了基因的同源性比較，Hrp基因序列分析及比較具體結(jié)果如圖7、8、9所示。
圖7、8、9、是三種不同來源的hrp基因的序列及推導的氨基酸序列比較分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，Pseudomonas syringae的兩個hrp基因同源性僅有56％，而不同屬的基因同源性更低。其中，hrpZ分離自Pseudomonassyringae(假單胞菌)；hrpH分離自Pseudomonas syringae(假單胞菌)；Ea-harpin(hrpN)分離自Erwinia amylovora(梨火疫病菌)。
Harpin Z基因克隆至表達載體pET-32b(+)中，實際編碼區(qū)核苷酸序列為SEQ ID NO.1，推導的氨基酸序列為SEQ ID NO.2陰影部分表示載體的序列，其它為Harpin Z基因序列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種基因工程蛋白質(zhì)APDZ，該蛋白為基因工程融合蛋白，其N和C端的氨基酸是載體編碼的，N端氨基酸是MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMAISDPNSC端氨基酸是LEHHHHHH本發(fā)明提供一種編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列，一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.1所示核苷酸至少有50％同源性的序列。
基因工程蛋白質(zhì)氨基酸序列的任何改變歸根結(jié)底都是其核苷酸序列的改變。任何核苷酸序列的改變都有可能改變其編碼的氨基酸，進而改變其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。但生物的氨基酸密碼子存在兼并性，即不同的密碼子可以編碼相同的氨基酸，比如，GCA、GCC、GCG、GCT都編碼Ala(丙氨酸)。在DNA的復制過程中，遺傳物質(zhì)可以因為內(nèi)部的或者外部的條件或因素發(fā)生改變，這些改變?nèi)绻⒓丛斐砂被岬淖兓?，就會直接影響蛋白質(zhì)特別是功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。大部分核苷酸序列的變化是不利于生物體的突變，而密碼子的兼并性就大大減少了核苷酸的突變對蛋白質(zhì)功能的影響。此外，密碼子的兼并性也是氨基酸的變異率遠遠低于核苷酸變異率的原因。因此，本發(fā)明所述的基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列可以進行突變，但其編碼的蛋白質(zhì)有相同的生物學功能。這些突變包括(1)同義突變個別核苷酸的突變，但是其編碼的氨基酸未發(fā)生改變，因此其編碼的蛋白質(zhì)的所有生物學特征與原來相同。
(2)錯義突變；個別核苷酸的改變，其編碼的氨基酸也發(fā)生改變，但這些氨基酸的改變往往是非功能決定位點的氨基酸，這些氨基酸的變化往往是中性的。結(jié)構(gòu)相似的氨基酸之間的替換一般不影響蛋白質(zhì)的功能。
(3)移碼突變個別核苷酸的增加或缺失，進而導致缺失或插入個別氨基酸，這樣的改變?nèi)绻麤]有改變蛋白的空間構(gòu)象，就不會改變蛋白質(zhì)的生物學功能。事實上，在基因工程蛋白的研究過程中，為了增加或改變蛋白質(zhì)的可溶性，增加穩(wěn)定性，往往會在蛋白質(zhì)的N、C端加入一些氨基酸殘基，或者在N、C端加入一些功能位點以利于蛋白質(zhì)表達和純化。
以上對核苷酸進行修飾和改變的方法為常規(guī)的方法，比如可以通過PCR的方法實現(xiàn)，這些方法為本專業(yè)技術(shù)人員所熟悉，不需進行創(chuàng)造性勞動即可獲得。通過該方法獲得的與本發(fā)明所述的核苷酸序列有50％同源性的核苷酸序列都具有與本發(fā)明所述核苷酸序列相同的生物學功能，即它們能使煙草、馬鈴薯、番茄、大豆、黃瓜及擬南芥菜產(chǎn)生過敏性反應，能夠用于實現(xiàn)本發(fā)明的一個或多個目的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列，其核苷酸序列與SEQ ID NO.1的核苷酸序列至少有70％的同源性。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列，其核苷酸序列與SEQ ID NO.1的核苷酸序列優(yōu)選地至少有80％的同源性。
本發(fā)明所述的編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列可以在一定范圍內(nèi)進行改變，所獲得的核苷酸序列與編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列具有相同的生物學功能。
按照現(xiàn)代生物學的概念，尤其是生物信息學的理論，同源性在70％以上的核苷酸序列可以判定為具有顯著的相似性，同源性在80％以上的核苷酸序列可以判定為具有相同的生物學功能。
以上對核苷酸進行修飾和改變的方法為常規(guī)的方法，比如可以通過PCR的方法實現(xiàn)，這些方法為本專業(yè)技術(shù)人員所熟悉，不需進行創(chuàng)造性勞動即可獲得。獲得的與本發(fā)明所述的核苷酸序列有70％同源性、優(yōu)選有80％同源性的核苷酸序列都具有與本發(fā)明所述核苷酸序列有相同的生物學功能，即它們能使煙草、馬鈴薯、番茄、大豆、黃瓜及擬南芥菜產(chǎn)生過敏性反應，能夠用于實現(xiàn)本發(fā)明的一個或多個目的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列，包含Harpin Z基因，通過EcoR I和XhoI兩個位點插入到表達載體pET-32(b)(Novagen公司產(chǎn)品)中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種編碼基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列，該核苷酸序列的上游和下游包括載體的序列。
序列的上游包括載體的序列是ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCGATATCGGATCCGAATTCG序列的下游包括載體的序列是CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA在本發(fā)明的一個實施方案中，所用pET-32b(+)質(zhì)粒(Novagen公司產(chǎn)品)帶有TrxA.Tag，有108個氨基酸組成，其相對分子量為12kDa；另外，在pET-32b(+)質(zhì)粒多克隆位點上游還帶有His.Tag、S.Tag及腸激酶和凝血酶酶切位點，載體部分相對分子量為19kDa；hrpZ基因有1116bp編碼372個氨基酸，相對分子質(zhì)量為36.8kDa；融合蛋白分子質(zhì)量大約55.8kDa。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種DNA片段及其制備方法。該片段包含本發(fā)明所述的編碼基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列。
發(fā)明所涉及的DNA片斷可以通過以下方式獲得(1)人工合成，可直接用DNA合成儀人工合成本發(fā)明所述的DNA片段，或者分段合成本發(fā)明所述的DNA片段，這些合成產(chǎn)物具有與本發(fā)明所述的DNA片段相同的生物學功能，可以實現(xiàn)本發(fā)明所述的一個或多個目的。
(2)PCR擴增，以本發(fā)明所述的DNA片段為模板，或者以含有本發(fā)明所述的DNA片段的質(zhì)粒、載體、宿主細胞為模板，通過PCR擴增得到DNA片段，這些PCR產(chǎn)物具有與本發(fā)明所述的DNA片段相同的生物學功能，可以實現(xiàn)本發(fā)明所述的一個或多個目的。
以上方法為分子生物學中常用的方法，為本領域技術(shù)人員所熟悉，不需通過創(chuàng)造性勞動即可獲得，所獲得的DNA片段被視為與本發(fā)明所涉及的核苷酸序列有相同的生物學功能，能夠進一步通過基因工程的方法實現(xiàn)本發(fā)明的一個或多個發(fā)明目的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種宿主細胞，該宿主細胞包含編碼本發(fā)明所述的基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列，或者包含編碼本發(fā)明所述的基因工程蛋白APDZ的DNA片段。宿主細胞的制備方法為分子生物學中常用的方法，為本領域技術(shù)人員所熟悉，不需通過創(chuàng)造性勞動即可獲得，所獲得的宿主細胞能夠進一步通過基因工程的方法實現(xiàn)本發(fā)明的所有發(fā)明目的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種大腸桿菌重組基因工程菌株，該菌株分類命名為Eshcherichia.coliBL21(DE3)/(pET-32b-hrp)，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2005年11月30日，保藏編號CCTCC M205136，該宿主細胞包含本發(fā)明所述的基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列。
一種重組基因工程菌株，它包括下列步驟A.PCR擴增Hrp Z基因；B.將純化的PCR產(chǎn)物克隆于pGEM-T-Vector，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性重組子；C.用Xho I和EcoR I雙酶切pGEM-T-hrpZ質(zhì)粒和表達載體pET-32(b)+，將Hrp Z基因克隆于pET-32(b)+，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性重組子。
利用重組基因工程菌株E.coliBL21，其無誘導表達、提取基因工程蛋白質(zhì)APDZ步驟如下首先是將重組獲得的攜帶Harpin蛋白的工程菌株M205136單菌落挑到內(nèi)含100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)；其次是以1∶20比例接種到含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，200rpm誘導表達5hr，收獲菌液；第三是4000rpm離心10min，收集菌體沉淀；第四是按常規(guī)方法即可獲得Harpin蛋白。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種大腸桿菌宿主細胞的構(gòu)建方法，該宿主細胞包含本發(fā)明所述的基因工程蛋白APDZ的核苷酸序列。
(1)hrpZ基因片段的PCR擴增制備以本室保存的含有hrpZ基因的質(zhì)粒為模板，用上游引物GGAATTCGATG CAG AGC TCT AGT CTT AAC(下劃線為引入的EcoR I酶切位點)和下游引物GCTCGAGTCA GGC CAC AGC CTG GTT AGT C(下劃線為引入的Xho I限酶切位點)，利用PCR儀擴增1.1kb的hrpZ基因片段。回收PCR產(chǎn)物并將其克隆入T載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliJM109，用于基因的增殖和保藏。
(2)用EcoR I和Xho I雙酶切將hrpZ基因定向插入表達載體pET-32b(+)，獲得重組質(zhì)粒pET-32b-hrp。
(3)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細胞中構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化方法包括但不僅限于電轉(zhuǎn)化法，氯化鈣轉(zhuǎn)化法。在本發(fā)明的一個實施例中提供了一種氯化鈣轉(zhuǎn)化方法，使用的表達載體是pET-32b(+)，宿主細胞是E.coliBL21(DE3)。
以上分子生物學的操作方法為本領域技術(shù)人員所熟悉，可以參考JoeSambrook，David Russell等編寫的Molecular CloningA LaboratryManual，Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，2001。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種基因工程蛋白質(zhì)APDZ，或編碼所述的基因工程蛋白質(zhì)APDZ的核苷酸序列，或編碼所述的基因工程蛋白質(zhì)APDZ的DNA片段，或本發(fā)明所述的宿主細胞。
本發(fā)明選用pET-32b(+)表達載體制備基因工程蛋白APDZ，宿主細胞是E.coli BL21(DE3)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果(1)表達量高，基因工程蛋白的表達量最高可以達到菌體蛋白總量的30-50％。本發(fā)明采用的pET-32b(+)載體是一種表達量很高的載體，外源蛋白約占菌體蛋白總量的29％以上，表達的基因工程HrpZ蛋白主要形成可溶性蛋白。曾同時將目的基因插入pET-15b(+)、pET-22b(+)表達載體中，均沒有ET-32b(+)載體表達量大。
(2)融合表達N端含有6個連續(xù)的組氨酸，利于蛋白質(zhì)的分離和純化。組氨酸在一般蛋白中為稀有氨基酸，引入連續(xù)的6個組氨酸具有很高的特異性。His6尾與金屬離子有很強的結(jié)合能力，而且對目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的影響很小，通常生物學活性可以得以保持，不經(jīng)去除His6尾可直接研究目的蛋白的生物學活性。
(3)安全性高大腸桿菌表達系統(tǒng)是一種安全的表達系統(tǒng)，已經(jīng)成功的用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達出多種醫(yī)用的蛋白質(zhì)，安全無毒，對人畜及環(huán)境無毒無害。
(4)利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)在所有基因工程表達系統(tǒng)中，大腸桿菌的生產(chǎn)成本是最低的，而且已經(jīng)有成型的發(fā)酵設備和生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用的表達系統(tǒng)，有利于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。氨芐青霉素是最為廉價的抗生素，可以進一步降低生產(chǎn)成本。


本發(fā)明的上述和其他目的，特點和優(yōu)勢可顯而易見地從下面對本發(fā)明優(yōu)選實施例的詳細描述和附圖示出的內(nèi)容得到，不同視圖中相同的參考符號代表相同的部分。附圖并不一定是按比例示出，其重點在于說明本發(fā)明的實施和效果。
圖1為重組質(zhì)粒pET-32b-hrp的構(gòu)建示意圖；圖2為PCR擴增hrpZ基因鑒定圖；泳道1.DL2000marker；泳道2.PCRproduct.
圖3為pGEM-T-hrpZ的PCR及酶切驗證結(jié)果圖；泳道1.DL2000marker；泳道2.PCR product；泳道3.pGEM-T-hrpZ/EcoR I+Xho I；泳道4.pGEM-T-hrpZ/Xho I；泳道5.λDNA/Hind III+EcoR I Marker.
圖4為重組表達載體pET-32b-hrp酶切驗證結(jié)果圖；泳道1.DL2000marker；泳道2.PCR product；泳道3.pET-32b-hrp/EcoR I+XhoI；泳道4.pET-32b-hrp/Xho I；泳道5.λDNA/Hind III+EcoR I Marker.
圖5為基因工程菌株表達蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖；泳道1.Protein molecular marker；泳道2.E.coli BL21(pET-32)；泳道3.Induced E.coli BL21(pET-32)；泳道4.E.coli BL21(DE3)(pET-32b-hrp)；泳道5.Supernatant of E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)；泳道6.Pelletof E.coli BL21(DE3)(pET-32b-hrp).
圖6為蛋白質(zhì)APDZ在煙草葉片上誘導產(chǎn)生的過敏反應；1.PBSBuffer；2/4.supernatant of IPTG-induced E.coliBL21(pET-32b)；3/5.APDZ sample.
圖7為hrpZ與hrpH、Ea-harpin基因的同源性比較；hrpZ與hrpH、Ea-harpin基因的同源性分別為56％、13％圖8為hrpZ與hrpH基因的同源性比較；hrpZ與hrpH基因的同源性為56％圖9hrpZ與hrpH產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的同源性比較；hrpZ與hrpH產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的同源性為78％。
具體實施例方式
實施例1PCR擴增Harpin Z基因擴增引物合成引物根據(jù)Harpin Z基因的ORF及載體設計，用oligo6.0軟件檢測。上游引物GGAATTCG ATG CAG AGC TCT AGT CTT AAC(下劃線為EcoR I酶切位點)下游引物GCTCGAGTCA GGC CAC AGC CTGGTT AGT C(下劃線為Xho I限酶切位點)。以上引物均由上海生工合成。以本室保存的含有hrpZ基因的質(zhì)粒為模板，用上游引物和下游引物，利用PCR儀擴增1.1kb的hrp Z基因片段。
PCR體系組分5μl 10×PCR buffer，4μl 2.5mM dNTPs，3μl 25mMMgCl2，1μl上游引物(20μM)，1μl下游引物(20μM)，2μl hrpZ plasmidDNA plate，0.5μl Taq DNA聚合酶，補無菌ddH2O至50μl。
用移液槍抽吸混勻，最后加無菌石蠟油50μl，向無菌PCR管中加上述組分的操作在冰上進行。1000rpm離心10sec后，將PCR管置于PCR儀上。
PCR反應條件95℃，5min；95℃，1min；58℃，1min；72℃，1min30s，30次；72℃，10min。
取5uL PCR產(chǎn)物在1.0％的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色后紫外燈下觀察擴增結(jié)果。PCR擴增hrpZ基因，PCR產(chǎn)物在1.0％的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色后紫外燈下觀察，有與目的基因大小相符的目的條帶，大小為1.1kb左右。
實施例2PCR產(chǎn)物的回收與純化(1)將剩余的PCR產(chǎn)物用1.0％瓊脂糖凝膠上電泳(1×TAE)，用紫外燈觀察電泳情況，當要回收的DNA帶與其他帶完全分離時，停止電泳，在紫外燈下用刀片切下欲回收帶，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。(2)在Eppendorf管中將膠搗碎，加入等體積的溶膠液Binding Buffer，65℃水浴7min，其間每2min輕搖Eppendorf管一次直至膠完全融解。(3)將融解的樣品加入層析柱中，12000rpm離心1min，棄去液體。(4)加300μl Binding Buffer，離心棄去液體。(5)加750μl Washing Buffer，離心棄去液體。(6)重復步驟5)。(7)空柱子12000rpm離心1min以甩干液體。(8)將柱子放于1.5ml Eppendorf管，加入30μl Elution buffer，37℃保溫2min，12000rpm離心1min，將得到的PCR產(chǎn)物取2μl電泳檢測定量，其余的貯于-20℃?zhèn)溆?。PCR擴增hrpZ基因鑒定結(jié)果見圖2。
實施例3將PCR產(chǎn)物克隆于pGEM-T-Vector
將以上純化的PCR產(chǎn)物克隆于pGEM-T-Vector。其連接體系為5.0μl 2×ligation buffer；0.5μl pGEM-T-Vector；4.0μl PCRproducts；0.5μl T4 DNA ligase，補無菌ddH2O至10μl。在冰上混合上述液體，將10μl混合液放在250μl的無菌離心管中，用移液槍輕輕抽吸幾下混勻，5000rpm瞬時離心，將混合液集中在管底，然后4℃連接過夜。
實施例4大腸桿菌的轉(zhuǎn)化采用冷氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞(1)以無菌牙簽挑取平板上的大腸桿菌JM109單菌落，接種到5mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm活化過夜。(2)取10～20uL上述活化大腸桿菌，接種到5mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)2～3h，至OD600值為0.4～0.6。(3)取1.5mL步驟2中的菌液加入無菌的Eppendorf離心管中，4,000rpm離心10min，抽干上清。(4)加入800uL冰預冷的0.1M氯化鈣，輕輕振蕩重懸菌體沉淀，冰浴30min。4,000rpm離心10min，抽干上清。(5)加入100uL冰預冷的0.1M氯化鈣重懸沉淀，得到制備好的感受態(tài)細胞。4℃保存，7～10天內(nèi)使用。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(1)取10uL連接反應液，加入到100uL上述制備的感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。(2)42℃水浴中熱激90s，迅速移至冰中冰浴2-3min。(3)加入390uL新鮮LB液體培養(yǎng)基，37℃，150rpm輕搖，50min。(4)4,000rpm離心5min，吸棄400uL上清，將剩余的菌液用移液槍輕輕混勻。(5)取100uL細菌懸液，用無菌三角玻璃涂棒涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，正向放置1-2小時，直至液體被充分吸收，倒置平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。(6)12-16小時后，觀察結(jié)果。
實施例5陽性重組子pGEM-T-hrpZ的檢測(1)菌落PCR鑒定從LBA平板上挑取白色單菌落，接種于3ml LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)8h，取2μl菌液作為模板進行菌落PCR鑒定。
(2)pGEM-T-hrpZ質(zhì)粒的雙酶切鑒定
將初步鑒定后的菌液小量提取質(zhì)粒，再進行酶切鑒定。
反應體系2μl 10×H buffer；pGEM-T-hrpZ plasmid≤1μg；1μlXho I酶；1μl EcoR I酶；補無菌水ddH2O至2μl。
反應過程將反應體系組分在冰上混合并混勻，5000rpm瞬時離心10s，置于37℃水浴鍋中保溫反應2-4h，加反應量0.1倍體積的10×loading Buffer終止反應，取8μl酶切產(chǎn)物，用0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。根據(jù)雙酶切后是否有大小正確的帶來判斷該質(zhì)粒是否為陽性重組子pGEM-T-hrpZ。
hrpZ片段引物引入了EcoR I和Xho I酶切位點，hrpZ片段的大小約為1.1kb，載體pGEM-T(Promage公司產(chǎn)品)的大小為3.0kb，所以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEM-T-hrpZ，應得3.0kb片段和1.1kb片段，單酶切時，應有約4.1kb的片段(3.0kb+1.1kb)。
pGEM-T-hrpZ的PCR及酶切驗證結(jié)果見圖3。
(3)hrpZ序列測定將經(jīng)過PCR鑒定及雙酶切鑒定的pGEM-T-hrpZ重組質(zhì)粒送往上海生物工程公司測序列。序列測定結(jié)果正確。
實施例6重組基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)的構(gòu)建(1)用Xho I和EcoR I雙酶切pGEM-T-hrpZ質(zhì)粒和表達載體pET32(b)+雙酶切pGEM-T-hrpZ質(zhì)粒體系8μl 10×H buffer；40μlpGEM-T-hrpZ plasmid；3μl Xho I酶；3μl EcoR I酶；補無菌ddH2O至80μl。
雙酶切pET32(b)+體系8μl 10×H buffer；40μl pET32(b)+plasmid；3μl Xho I酶；3μl EcoR I；補無菌ddH2O至80μl。
37℃水浴酶切2-4小時后，用0.7％的瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下切下目的條帶，用膠回收試劑盒進行回收純化。最后用30μl無菌水洗脫。取2μl樣品1％瓊脂糖電泳檢測，其余貯于-20℃?zhèn)溆谩?br> (2)連接反應反應體系1μl 10×連接反應緩沖液；6μl hrpZ片斷；2.5μlpET32(b)+；0.5μl T4連接酶；總體積為10μl。
在冰上混合上述液體，將10μl混合液放在250μl的無菌離心管中，用移液槍輕輕抽吸幾下混勻，5000rpm瞬時離心，將混合液集中在管底，然后16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞(感受態(tài)細胞制備同實施例4)，涂布LBA固體培養(yǎng)基平板。
(3)含重組pET-hrpZ質(zhì)粒的陽性菌落的篩選與鑒定從LBA平板上挑取多個白色單菌落，接種于3ml LBA培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)8h，取2μl菌液作為模板進行菌落PCR鑒定，將初步鑒定后的菌液小量提取質(zhì)粒，再進行酶切鑒定。
用EcoR I和XhoI雙酶切將hrpZ基因定向插入表達載體pET32b(+)，得重組質(zhì)粒pET-hrpZ。pET-hrpZ經(jīng)PCR應得1.1kb的片段，EcoR I和Xho I雙酶切產(chǎn)生5.9kb和1.1kb的2個片段；經(jīng)Xho I單切產(chǎn)生一個7.0kb的片段。重組表達載體pET-32b-hrp酶切驗證結(jié)果見圖4，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
實施例7外源蛋白APDZ的誘導表達(1)從平板上挑取攜帶有質(zhì)粒pET-32b-hrp的重組基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)單菌落，接種于20mL含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)8-12h，4℃靜置過夜。(2)次日按1-2％接種到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約2-3小時左右。(3)至菌液OD600值為0.6-0.8時，加入誘導物IPTG至終濃度為0.6mM，在37℃下誘導表達3-5h。(4)菌液在4℃下12,000離心1min，收集菌體。
實施例8外源蛋白APDZ的無誘導表達(1)配制豐富LB培養(yǎng)基蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉5g/L。(2)從平板上挑取攜帶有質(zhì)粒pET-32b-hrp的重組基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)單菌落，接種于250ml的三角瓶中的豐富LB培養(yǎng)基內(nèi)，Amp終濃度為200μg/ml，37℃220rpm/min，振蕩培養(yǎng)8小時后，置冰箱過夜。(3)按4％的接種量接種于豐富LB和2YT培養(yǎng)基中，Amp終濃度為200μg/ml，37℃200rpm/min，振蕩培養(yǎng)2小時后，OD值為0.6-0.8之間，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4小時。(4)菌液在4℃下12,000離心1min，收集菌體。
實施例9基因工程蛋白APDZ的提取(1)向收集的菌體加入適量PBS(5mM/L，pH6.5)，-20℃反復凍融幾次后，再進行超聲波破碎菌處理(4℃，處理3次，每次10秒，間隔30秒)。(2)待菌液變清亮，絕大部分菌體破裂后，4,000rpm離心菌液15-20分鐘。(3)分別收集得到菌體殘渣和上清液。上清在4℃下12,000rpm繼續(xù)離心15分鐘。(4)收集兩次離心所得上清和沉淀。上清即為基因工程蛋白APDZ的提取液。
實施例10基因工程蛋白APDZ的純化(1)Ni2+柱層析樣品處理取發(fā)酵罐發(fā)酵菌液經(jīng)離心得到的濕菌體30g，用60ml 1×Binding Buffer(0.5M NaCl+5mM咪唑+20mM Tris·HClpH7.9)重懸，超聲波破碎3×30分鐘(有效破碎時間為30分鐘)，破碎后的蛋白懸液在15000RPM、30分鐘條件下離心，取上清液，再用0.45μm的濾膜過濾，用1×Binding Buffer定容至100ml Ni2+柱層析樣品。(2)Ni2+柱的預處理用10床1×Binding Buffer，20床無菌水清洗柱床；用10床1×Charge Buffer(5mM NiSO4)，結(jié)合Ni2+；再用10床1×Binding Buffer平衡柱床后，備用(1床即是柱內(nèi)介質(zhì)的體積)。(3)柱層析濃縮過的樣品經(jīng)蠕動泵以循環(huán)方式通過Ni2+柱，使帶有6×His的蛋白樣品流動相充分與Ni2+柱中的Ni2+相結(jié)合，過夜后從Ni2+柱出口收集未與Ni2+結(jié)合的樣品(穿漏液)。(4)清洗柱分別采用50床1×Binding Buffer；75床60mM咪唑；75床100mM咪唑；30床150mM咪唑梯度洗滌留在柱內(nèi)的少量樣品和與Ni2+柱結(jié)合的非目的蛋白。(5)洗脫Ni2+柱用1×Elute Buffer(1M咪唑+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl pH7.9)洗脫與Ni2+柱結(jié)合的目的蛋白，分部收集，每床體積為5管。通過SDS-PAGE檢驗目的蛋白在洗脫液中的分布。(6)Ni2+柱用1×Elute Buffer繼續(xù)洗脫，洗樣柱中全部蛋白；再用1×Strip Buffer(100mM EDTA+0.5MNaCl+20mM Tris·HCl pH7.9)洗去柱子上的Ni2+離子。
實施例11 APDZ純化樣品中蛋白質(zhì)含量的確定將11ml Ni2+柱洗脫、收集的樣品裝入處理好的透析袋中，并加入PBS至終體積60ml。PEG濃縮至干癟狀態(tài)，再加入PBS后PEG濃縮。重復PEG濃縮，直至加入PBS的總體積達300ml。將濃縮好的透析袋用ddH2O沖洗干凈后，放入盛有1000ml PBS燒杯中反透、過夜。往反透好的透析袋中加入50ml PBS，再用PEG濃縮至干癟狀態(tài)。加入1.6ml PBS將透析袋中的蛋白沖洗出來，以上操作均在4℃進行。
實施例12表達產(chǎn)物APDZ的SDS-PAGE鑒定收集上述離心所得上清和沉淀，分別取樣加入5×SDS-PAGE加樣緩沖液，經(jīng)沸水浴10分鐘后，離心用10％SDS-PAGE進行電泳檢測。
SDS-PAGE電泳按照分子克隆上所講述的標準方法進行。濃縮膠的濃度為4.5％，分離膠的濃度為10％，電泳時電壓為8V/cm。當溴酚藍指示線到達分離膠底邊時，關掉電源。用0.1％考馬斯亮藍染液染色4-6h后，再用脫色液(甲醇∶乙酸∶ddH2O＝4.5∶1∶4.5)將背景色脫盡為止，中間更換脫色液。
10％SDS-PAGE分析表明，該工程菌菌體經(jīng)破碎后分為上清和沉淀，上清在相對分子質(zhì)量55.8kDa處有明顯的表達，含量約占總蛋白的79％，而沉淀中很少，可見表達的hrpZ蛋白主要以可溶性形式存在。基因工程菌株表達蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖5。
實施例13表達產(chǎn)物APDZ的生物活性測定采用葉片穿刺法測定hrpZ蛋白誘導煙草的過敏反應。不銹鋼毫針用酒精棉球擦拭，并在酒精燈上灼燒，待冷卻后在煙葉葉面穿刺小孔，將處理好的樣品20μl，分別點加在上述小孔上，控制水漬斑直徑為2cm，標明各孔處理。采用重組基因工程菌株E.coliBL21(DE3)(pET-32b-hrp)無誘導表達，所制備的基因工程蛋白APDZ的提取液樣品。并以E.coliBL21(pET-32b)誘導表達上清和PBS(5mmol/L，pH6.5)做對照。將煙草置20℃-25℃溫室培養(yǎng)，分別于12h、24h、36h和48h后觀察葉片反應及反應程度。
12h后，APDZ蛋白樣品穿刺點樣的孔周圍出現(xiàn)萎縮，24h后出現(xiàn)塌陷，36h后出現(xiàn)枯斑，而對照E.coli BL21(pET-32b)誘導表達上清及PBS無此現(xiàn)象。蛋白質(zhì)APDZ在煙草葉片上誘導產(chǎn)生的過敏反應結(jié)果見圖6，表明重組表達的基因工程蛋白質(zhì)APDZ能引起煙草的過敏反應。
實施例14APDZ的田間應用試驗以APDZ蛋白作為活性成分制備的抗菌抑菌劑中，基因工程蛋白質(zhì)APDZ有效含量為3％。將該抗菌抑菌劑粉劑或乳劑均勻的噴灑于植物表面即可達到對細菌、真菌、病毒性植物病害廣譜的預防和控制作用。
在一組田間實驗中，以APDZ蛋白作為活性成分的抗菌抑菌劑對真菌引起的茄子棉疫病防治效果達到75％，而常用的化學農(nóng)藥只有43％；對黃瓜細菌性角斑病防治效果達到93％，遠遠超過化學農(nóng)藥的40％；對黃瓜花葉病毒引起的病毒性病害，本發(fā)明的抗菌抑菌劑對黃瓜花葉病防治效果達到96％，而常用的化學農(nóng)藥只能達到78.8％的防治效果。
序列表<110>武漢大學<120>無誘導表達基因工程菌株及構(gòu)建方法和應用<130>無誘導表達基因工程菌株及構(gòu)建方法和應用<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1749<212>DNA<213>Pseudachorutes sp.
<221>CDS<222>(1)..(1749)<221>Trx.Tag<222>(1)..(327)<221>His.tag<222>(514)..(531)<221>His.tag<222>(1729)..(1746)<400>1atg agc gat aaa att att cac ctg act gac gac agt ttt gac acg gat48Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 5 10 15gta ctcaaa gcg gac ggg gcg atc ctc gtc gat ttc tgg gca gag tgg96Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp202530tgc ggt ccg tgc aaa atg atc gcc ccg att ctg gat gaa atc gct gac144Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp354045gaa tat cag ggc aaa ctg acc gtt gca aaa ctg aac atc gat caa aac192Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn505560cct ggc act gcg ccg aaa tat ggc atc cgt ggt atc ccg act ctg ctg240Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65707580ctg ttc aaa aac ggt gaa gtg gcg gca acc aaa gtg ggt gca ctg tct288Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95aaa ggt cag ttg aaa gag ttc ctc gac gct aac ctg gcc ggt tct ggt336Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly100 105 110tct ggc cat atg cac cat cat cat cat cat tct tct ggt ctg gtg cca384Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro115 120 125cgc ggt tct ggt atg aaa gaa acc gct gct gct aaa ttc gaa cgc cag432Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln130 135 140cac atg gac agc cca gat ctg ggt acc gac gac gac gac aag gcc atg480His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met145 150 155 160gcg ata tcg gat ccg aat tcg atg cgg ggt tct cat cat cat cat cat528Ala Ile Ser Asp Pro Asn Ser Met Arg Gly Ser His His His His His165 170 175cat ggt atg gct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgg gat ctg576His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu180 185 190tac gac gat gac gat aag gat cca acc ctt atg cag agt ctc agt ctt624Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Pro Thr Leu Met Gln Ser Leu Ser Leu195 200 205aac agc atg agt tcg ttg caa acc tct gca tca ttg ttc ccc gtg tcg672Asn Ser Met Ser Ser Leu Gln Thr Ser Ala Ser Leu Phe Pro Val Ser210 215 220ctc aac agc gat gtg agc gcc aac acc agc act tcc agc aaa gag ctc720Leu Asn Ser Asp Val Ser Ala Asn Thr Ser Thr Ser Ser Lys Glu Leu225 230 235 240aag gct gtg atc gat cag ctg gtt cag gcg ctg acc caa agt ggg cag768Lys Ala Val Ile Asp Gln Leu Val Gln Ala Leu Thr Gln Ser Gly Gln245 250 255ctc gat gaa acc tca ccg ctc ggc aaa atg ctc gcc aag gcc atg gct816Leu Asp Glu Thr Ser Pro Leu Gly Lys Met Leu Ala Lys Ala Met Ala260 265 270gcg gat ggc aag tcg gct aac agc atc gat gac atc act gca tcg ctc864Ala Asp Gly Lys Ser Ala Asn Ser Ile Asp Asp Ile Thr Ala Ser Leu275 280 285gac aag ctg atc cac gaa aag ctc ggc aac aat ttc ggt gcc tct gcc912Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asn Asn Phe Gly Ala Ser Ala290 295 300ggc atc ggc gcg ggt ggc ggt ggc ggt ggc att ggc ggg gcg ggt tct960Gly Ile Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Ala Gly Ser305 310 315 320ggt tcg ggt gtc ggt ggc ggt ctg agc agc gac gcg ggt gcc ggg caa1008
Gly Ser Gly Val Gly Gly Gly Leu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Gly Gln325 330 335tcc gat ctg atg agc cag gtc ctg aac ggc ctc ggc aaa gcc gtg ctg1056Ser Asp Leu Met Ser Gln Val Leu Asn Gly Leu Gly Lys Ala Val Leu340 345 350gac gat ctg ctg aca ccg agt ggt gaa ggc gga aca acc ttt tcc agt1104Asp Asp Leu Leu Thr Pro Ser Gly Glu Gly Gly Thr Thr Phe Ser Ser355 360 365gat gac atg ccg acc ctg gaa aaa gtc gcc cgg ttc atg gac gac aac1152Asp Asp Met Pro Thr Leu Glu Lys Val Ala Arg Phe Met Asp Asp Asn370 375 380aag gcc cag ttc cct act cgg gac ggc ggc tcg tgg atg aac gag ctg1200Lys Ala Gln Phe Pro Thr Arg Asp Gly Gly Ser Trp Met Asn Glu Leu385 390 395 400aag gaa gac aat ggc ctg tat gca cag gaa acc gct cag ttt cgt tcg1248Lys Glu Asp Asn Gly Leu Tyr Ala Gln Glu Thr Ala Gln Phe Arg Ser405 410 415gct ctc gac gtc att ggt caa cag ctc ggc cag caa caa ggt gat gcc1296Ala Leu Asp Val Ile Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gln Gln Gly Asp Ala420 425 430agt ggc gtt acc agt ggc ggc ggt ctg ggt tcg ccc gtg agt gac agc1344Ser Gly Val Thr Ser Gly Gly Gly Leu Gly Ser Pro Val Ser Asp Ser435 440 445tcc ctg ggt aat cct gca atc gat gcc aac aca ggt ccc gcg gcc aat1392Ser Leu Gly Asn Pro Ala Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Ala Ala Asn450 455 460ggc aat gcc agc gtc gac gta ggt caa ctg atc ggt caa ctc atc gac1440Gly Asn Ala Ser Val Asp Val Gly Gln Leu Ile Gly Gln Leu Ile Asp465 470 475 480cgt ggt ttg cag tcg gtt tcg tcg ggt ggc ggt ctg ggt aca ccg gtc1488Arg Gly Leu Gln Ser Val Ser Ser Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val485 490 495gac aat tcc acg cag ccg aca ggt ggc acg cca gcg gct aac ccg acg1536Asp Asn Ser Thr Gln Pro Thr Gly Gly Thr Pro Ala Ala Asn Pro Thr500 505 510ggc aac gtg tcc aat cag gac ctg ggt caa ctg ctg aac ggc ttg ctg1584Gly Asn Val Ser Asn Gln Asp Leu Gly Gln Leu Leu Asn Gly Leu Leu515 520 525caa cgc ggg ctg gaa gcg acg ctt cag gat gct ggc aac acc ggc gcc1632Gln Arg Gly Leu Glu Ala Thr Leu Gln Asp Ala Gly Asn Thr Gly Ala530 535 540gac ctg caa tcg agc gct gcg caa gtg gca gct cag ctg atc aat gcg1680Asp Leu Gln Ser Ser Ala Ala Gln Val Ala Ala Gln Leu Ile Asn Ala545 550 555 560
ctg ttg caa ggc acc aat aac cag act aac cag gct gtg gcc ctc gag1728Leu Leu Gln Gly Thr Asn Asn Gln Thr Asn Gln Ala Val Ala Leu Glu565 570 575cac cac cac cac cac cac tga1749His His His His His His580<210>2<211>582<212>PRT<213>Pseudachorutes sp.
<400>2Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp1 51015Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp202530Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp35 40 45Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn50 5560Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu65707580Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser85 9095Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly100 105 110Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro115 120 125Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln130 135 140Hi s Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met145150 155 160Ala Ile Ser Asp Pro Asn Ser Met Arg Gly Ser His His His His His165 170 175His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu180 185190Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Pro Thr Leu Met Gln Ser Leu Ser Leu195 200 205Asn Ser Met Ser Ser Leu Gln Thr Ser Ala Ser Leu Phe Pro Val Ser210 215 220Leu Asn Ser Asp Val Ser Ala Asn Thr Ser Thr Ser Ser Lys Glu Leu225 230235 240
Lys Ala Val Ile Asp Gln Leu Val Gln Ala Leu Thr Gln Ser Gly Gln245 250 255Leu Asp Glu Thr Ser Pro Leu Gly Lys Met Leu Ala Lys Ala Met Ala260 265 270Ala Asp Gly Lys Ser Ala Asn Ser Ile Asp Asp Ile Thr Ala Ser Leu275 280 285Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asn Asn Phe Gly Ala Ser Ala290 295 300Gly Ile Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Ala Gly Ser305 310 315 320Gly Ser Gly Val Gly Gly Gly Leu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Gly Gln325 330 335Ser Asp Leu Met Ser Gln Val Leu Asn Gly Leu Gly Lys Ala Val Leu340 345 350Asp Asp Leu Leu Thr Pro Ser Gly Glu Gly Gly Thr Thr Phe Ser Ser355 360 365Asp Asp Met Pro Thr Leu Glu Lys Val Ala Arg Phe Met Asp Asp Asn370375 380Lys Ala Gln Phe Pro Thr Arg Asp Gly Gly Ser Trp Met Asn Glu Leu385390 395400Lys Glu Asp Asn Gly Leu Tyr Ala Gln Glu Thr Ala Gln Phe Arg Ser405 410 415Ala Leu Asp Val Ile Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gln Gln Gly Asp Ala420 425 430Ser Gly Val Thr Ser Gly Gly Gly Leu Gly Ser Pro Val Ser Asp Ser435 440 445Ser Leu Gly Asn Pro Ala Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Ala Ala Asn450 455 460Gly Asn Ala Ser Val Asp Val Gly Gln Leu Ile Gly Gln Leu Ile Asp465 470 475480Arg Gly Leu Gln Ser Val Ser Ser Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val485 490 495Asp Asn Ser Thr Gln Pro Thr Gly Gly Thr Pro Ala Ala Asn Pro Thr500 505 510Gly Asn Val Ser Asn Gln Asp Leu Gly Gln Leu Leu Asn Gly Leu Leu515 520 525Gln Arg Gly Leu Glu Ala Thr Leu Gln Asp Ala Gly Asn Thr Gly Ala530 535 540Asp Leu Gln Ser Ser Ala Ala Gln Val Ala Ala Gln Leu Ile Asn Ala545 550 555560Leu Leu Gln Gly Thr Asn Asn Gln Thr Asn Gln Ala Val Ala Leu Glu565 570 575His His His His His His580
權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
2.一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少80％同源性的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于蛋白質(zhì)APDZ的分子量為55.8kDa道爾頓。
4.一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
5.一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。
6.一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少70％同源性的序列。
7.一種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少80％同源性的序列。
8.一種重組基因工程菌株Eshcherichia.coliBL21(DE3)/(pET-32b-hrp)，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為M205136，宿主細胞為大腸桿菌。
9.一種用于實現(xiàn)權(quán)利要求8所述的重組基因工程菌株的方法，它包括下列步驟A.PCR擴增Hrp Z基因；B.將純化的PCR產(chǎn)物克隆于pGEM-T-Vector，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性重組子；C.用Xho I和EcoR I雙酶切pGEM-T-hrpZ質(zhì)粒和表達載體pET-32(b)+，將Hrp Z基因克隆于pET-32(b)+，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性重組子。
10.一種無誘導表達基因工程蛋白質(zhì)APDZ的方法，其特征在于利用重組基因工程菌株E.coliBL21，其無誘導表達、提取基因工程蛋白質(zhì)APDZ步驟如下首先是將重組獲得的攜帶Harpin蛋白的工程菌株M205136單菌落挑到內(nèi)含100g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)；其次是以1∶20比例接種到含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，200rpm誘導表達5hr，收獲菌液；第三是4000rpm離心10min，收集菌體沉淀；第四是按常規(guī)方法即可獲得Harpin蛋白。
11.權(quán)利要求1所述的基因工程蛋白質(zhì)在防治植物病害中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無誘表達基因工程菌株及構(gòu)建方法和應用，無誘導表達基因工程菌株的宿主細胞為腸桿菌E.coliBL21，CCTCC M205136，PCR擴增hrp Z基因片段，克隆到pGEM－T載體中，經(jīng)EcoR I/Xho I酶切、酶連接，將hrp Z基因插入大腸桿菌表達載體pET－32b(+)硫氧還蛋白下游，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET－32b－h(huán)rp，再將其轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中，經(jīng)篩選得到陽性克隆子。無誘導表達重組HrpZ蛋白，SDS－PAGE顯示，高效表達了可溶性重組蛋白APDZ蛋白。用葉片穿刺法，表明重組蛋白APDZ具有誘導煙草過敏反應的生物功能。該重組蛋白對植物病害有良好的防治效果和促進植物的生長、提高了農(nóng)作物產(chǎn)量。
文檔編號A01N63/02GK1793172SQ20051012050
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者孟小林, 徐進平, 丁玲, 魯偉, 王健 申請人:武漢大學